凝胶等电聚焦测定蛋白质等电点
IEF-PAGE聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳法
【实验目的】1.掌握聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦的基本原理2.学习用等电聚焦电泳测定蛋白质等电点的操作和方法【实验原理】等电聚焦法是一种特殊的聚丙烯酰胺凝胶电泳法。
它的特点是在凝胶柱中加入两性电解质载体-Ampholine，从而使凝胶柱上产生pH梯度。
当向两性载体凝胶施加电场时，即可形成pH梯度，pH梯度的顺序是从阳极到阴极pH值逐渐增大。
蛋白质为两性电解质，其所带电荷的性质和数量随所处环境的pH而变化。
当蛋白质在等电聚焦凝胶柱中进行电泳时，带电荷的蛋白质离子即在凝胶柱上泳动：带负电荷的蛋白质分子向阳极移动，带正电荷的蛋白质分子向阴极移动。
当蛋白质样品泳动到凝胶的某一部位，这一部位的pH值正好相当于该蛋白质的等电点时，蛋白质的净电荷为零不再移动，则聚焦形成一条蛋白质区带。
这种按等电点的大小在pH梯度某一相应位置进行聚焦的方法称为等电聚焦。
利用这种方法，在蛋白质聚焦的相应位置测定凝胶的pH值，就可得知该蛋白质的等电点。
【实验材料】1.实验器材小玻璃管：内径0.5cm，长10cm 2支；小玻管架；圆盘电泳槽；注射器和长针头；移液管；pH计2.实验试剂(1) 两性电解质载体凝胶：丙烯酰胺3.5g，N-甲叉双丙烯酰胺0.1g，pH3～10的Ampholine 2.5ml，核黄素溶液（4mg/100ml）12.5ml，加水至50ml。
(2) 蛋白质溶液：纯牛血清白蛋白7mg，溶于1ml蒸馏水。
此蛋白溶液应无盐离子。
(3) 5%磷酸溶液(4) 2%氢氧化钠溶液(5) 考马斯亮蓝R-250染色液：称取考马斯亮蓝R-250 0.25g，加入50%甲醇91ml和冰醋酸9ml。
(6) 40%蔗糖溶液(7) 12%三氯醋酸溶液(8) 脱色液乙醇：冰醋酸：蒸馏水=25：10：65（v/v）。
【实验操作】1. 取4ml两性电解质载体凝胶，置于抽气瓶中，加入0.07ml蛋白质溶液，轻轻摇动混匀，抽去气泡。
2. 取干净的小玻璃管2支，垂直放置，底端塞以橡皮塞，加入40%蔗糖溶液3～4滴，然后吸取抽气瓶中的两性电解质载体-蛋白质混合液1.8ml缓缓放入玻璃管中，加入胶液后立即用注射器加上一薄层水（3～5 mm高），使混合液表面与空气隔绝。
等电聚焦电泳测定血清蛋白质等电点
等电聚焦电泳测定血清蛋白质等电点【实验原理】等电聚焦电泳是利用具有pH梯度的两性电解质为载体，分离等电点(pI)不同的蛋白质等两性分子的电泳技术。
在IEF电泳系统中，具有一个从阳极到阴极，pH值逐渐增大的连续而稳定的pH梯度，处于此系统的各种蛋白质分子，将根据各自的pI值与所处位点的pH值的差别带上正电或负电。
当蛋白质分子向相反电极移动的过程中，其逐渐靠近与其DI相同的pH位点，直至到达pH=pI，净电荷为零而停止移动，从而达到聚焦。
因此，将pI不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一段时间后，各组分会分别聚焦在各自pI相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。
根据电泳装置的不同，IEF可分为管型IEF和平板型IEF，本实验介绍管犁PAGE—IEF．【试剂与器材】1．凝胶贮备液称取丙烯酰胺(Acr)20g，甲叉双丙烯酰胺(Bis)0．8g，蒸馏水溶解后定容至100mL，过滤，将未溶物滤去，盛于棕色瓶中，4℃冰箱保存。
2．1％(V/V)TEMED溶液。
3．5g/L过硫酸铵称取过硫酸铵0．5g，溶于蒸馏水100mL，冰箱存放，每周新配。
4．40％两性电解质载体。
5．0．5mmol/L磷酸溶液量取85％磷酸16mL，加蒸馏水定容至500mL。
6．0．5mmol/L NaOH溶液称取NaOH10g，加蒸馏水溶解并定容至500mL。
7．1g/L考马斯亮蓝固定染色液称取考马斯亮蓝R250 lg，溶于含甲醇200mL、乙酸100mL和蒸馏水700mL的混合液中，过滤后备用。
8．酸性乙醇脱色液乙醇25份，蒸馏水25份，冰醋酸8份，混匀备用。
9．血清样本血清无须稀释，但最好透析去除离子。
10．电泳仪选用电子管或晶体管整流电源，电压0~600V，电流0~300mA。
11．电泳槽圆盘电泳槽及电泳玻管。
12．锥形瓶，250px长针头或腰椎穿刺针头，5mL或10mL注射器。
食品安全检测农药兽药残留土壤成分分析焦炭成分分析【操作步骤】1．凝胶制备取洁净干燥的电泳玻璃管2支，将管底用胶布封闭，垂直放置在电泳管架上。
聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点
（4）待凝胶聚合
2. 电泳
小心地拔出玻管，并用蒸馏水洗去蔗糖溶液，把管固定 到电泳槽上槽的洞中（安装时要保证凝胶管垂直且橡胶塞孔 密封不漏）在上槽中加入5%磷酸缓冲液，在下槽中装入2%氢 氧化钠溶液。避免管下有气泡。上槽接电泳仪的正极，下槽 接负极，打开电源，先调电压至100 V，待电压稳定后再升 到300 V，电泳2 h以上至电流降为0，将电压调至0，关闭电 源。
5. pH梯度的制作
取另一条凝胶条放在玻板上，从凝胶的正极端开始，每 隔0.5 cm切下一段，依次放入已编好号并装有1 mL蒸馏水的 试管中，浸泡过夜。次日用酸度计分别测定每管浸提液的pH 值。以凝胶长度为横坐标，pH值为纵坐标，绘制标准pH梯度 曲线。
6 .蛋白质样品等电点的计算
求出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度为： 固定后的蛋白区带中心距凝胶条正极端的距离
(4)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，也无 变性作用，其化学组成不同于蛋白质。
IEF-PAGE分离蛋白质并测定pI
(2)在pI处应有良好的电导及相同的电导系数，以保持均匀的电场。
固定染色后凝胶条长度
（3）将配好的凝胶溶液用细长头滴管加到预先准备好的玻管中，至离上端1 cm处，再用注射器缓缓加水3-5 mm高。
实验九 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦 电泳测定蛋白质的等电点
一、目的要求 等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点方法
二、原理
聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(Isoelectric Focusing-PAGE，简称IEF-PAGE)：利用各种蛋白质 pI不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其 中加入两性电解质载体(carrier ampholytes)，两 性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极 到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。在电场作 用下，蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH 值等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区 带。
实验操作指导书：等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点
实验三等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点一、实验目的了解等电聚焦的原理。
通过蛋白质等电点的测定，掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直管式等电聚焦电泳技术。
二、实验原理等电聚焦（Isoelectric focusing，简称IEF）是六十年代中期出现的新技术。
近年来等电聚焦技术有了新的进展，已迅速发展成为一门成熟的近代生化实验技术。
目前等电聚焦技术已可以分辨等电点（pI）只差0.001pH单位的生物分子。
由于其分辨力高，重复性好，样品容量大，操作简便迅速，在生物化学、分子生物学及临床医学研究中得到广泛的应用。
蛋白质分子是典型的两性电解质分子。
它在大于其等电点的pH环境中解离成带负电荷的阴离子，向电场的正极泳动，在小于其等电点的pH环境中解离成带正由荷的阳离子，向电场的负极泳动。
这种泳动只有在等于其等电点的pH环境中，即蛋白质所带的净电荷为零时才能停止。
如果在一个有pH梯度的环境中，对各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，则在电场作用下，不管这些蛋白质分子的原始分布如何，各种蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度中相对应的位置处进行聚焦，经过一定时间的电泳以后，不同等电点的蛋白质分子便分别聚焦于不同的位置。
这种按等电点的大小，生物分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为就称为“等电聚焦”。
等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度，使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦，从而达到分离、测定和鉴定的目的。
两性电解质载体，实际上是许多异构和同系物的混合物，它们是一系列多羧基多氨基脂肪族化合物，分子量在300~1000之间。
常用的进口两性电解质为瑞典Pharmacia-LKB公司生产的Ampholine 和Pharmalyte，价格昂贵。
国产的有中国军事医学科学院放射医学研究所和上海生化所生产的两性电解质，价格便宜，质量尚佳。
两性184电解质在直流电场的作用下，能形成一个从正极到负极的pH值逐渐升高的平滑连续的pH梯度。
蛋白质等电点的测定优选PPT资料
区带。
三、实验试剂与仪器 1）两性电解质 2）30％丙烯酰胺溶液 3）TEMED 4）10％过硫酸铵溶液 5）负极缓冲液：0.1M NaOH 6) 正极缓冲液：0.1M 磷酸或硫酸 7) 固定液：10％（W/V）三氯乙酸 8) 染色液 9) 脱色液 10) 蛋白质等电点标准 11) 电泳仪 12) 圆盘电泳槽
3．剥胶
电泳结束后，取下凝胶管，用蒸馏水洗净两端电极液，在 凝胶条的正极端作上标记。用灌满水的注射器长针头插入凝胶 与玻管管壁之间，边压水边慢慢转动玻管，推针前进，同时注 入水，靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开，凝胶条 即可流出。
4 .固定染色
取出凝胶条放在一块洁净的玻板上，用尺量出固定前的凝 胶条长度。放入带盖试管中加入固定液。固定20min2后，倒 掉固定液后用脱色液漂洗2次，再染色1h，用蒸馏水漂洗数次 后用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，量出蛋白带距正极端 的距离。
5 .蛋白质条带聚焦位置的计算
求出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度为：
蛋白区带中心距凝胶条正极端的距离 固定染色前凝胶条长度 固定染色后凝胶条长度
三、浊度、分光光度法
溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，静电荷为0，当溶液pH值大于蛋 白质等电点时，则羧基游离，蛋白质带负电荷。反之，溶液的pH值小 于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带正电荷。溶液的pH值距蛋 白质等电点越远，蛋白质的电荷越多。反之则越少。
蛋白质等电点的测定
主要内容
(1)了解蛋白质的两性解离性质。 (2)学习测定蛋白质等电点的方法。
蛋白质的解离性质
• 蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中 存在下列平衡：
蛋白质的等电点
• 蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液 的酸碱度影响。当溶液的pH达到一定数值 时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等， 在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不 向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋 白质的等电点。不同蛋白质各有其特异的 等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质 都有变化，可利用此种性质的变化测定各 种蛋白质的等电点。
蛋白质等电点的测定
蛋白质等电点的测定蛋白质是生命体内构成最广泛的一类生物大分子，具有各种生物功能。
在生物体内，蛋白质具有正负电荷，并在不同PH值的溶液中表现出不同的电性质。
蛋白质在pH等于其等电点时，蛋白质的电荷处于中性状态，亦是纯蛋白质最稳定的情况，因此准确测定蛋白质等电点对于分离、纯化和鉴定蛋白质具有重要意义。
本文中将介绍三种测定蛋白质等电点的方法。
方法1. 等电点电泳法等电点电泳法是一种电泳分离方法，利用蛋白质在不同pH值下的电荷变化探测其等电点。
该方法的原理为将蛋白质经过电泳分离，直到电泳缓冲液pH等于蛋白质的等电点，此时蛋白质处于中性带中心。
与常规电泳仪不同的是，该仪器在酸性电极和碱性电极之间加入溶液，以确保酸碱缓冲系统能够维持所需的pH值。
等电点电泳法可以快速而准确地测定蛋白质等电点，但需要特殊仪器和耗时较长，且样品纯度较高。
方法2. 等电聚焦法等电聚焦法是一种电泳技术，利用在连续的pH梯度中，使具有等电点的蛋白质依次停止迁移，从而分离蛋白质。
该方法的原理是，利用蛋白质在不同pH值下的等电点特性，将样品置于pH梯度中，通过电压控制，使蛋白质在等电点处停止迁移，从而实现蛋白质分离。
等电聚焦法具有高分辨率和高分离效率，同时还可以同时分离出等电点相似但分子量不同的蛋白质，但样品量较小，需要特殊仪器和大量控制。
方法3. pH梯度管柱法pH梯度管柱法是一种可溶性蛋白质的标准测定方法，也是等电点法中最广泛应用的方法之一。
该方法的基本原理是，在含有不同pH值的缓冲液梯度的柱子上，蛋白质会在不同的pH值时呈现出不同的电荷状态。
在pH值等于其等电点时，蛋白质处于中性状态，停止迁移。
通过检测蛋白质在不同pH值下的吸收值，可以确定样品的等电点。
pH梯度管柱法的优点包括样品量较大，操作简单，数据可靠，但分辨率较低，需要特殊的柱子。
三种测定蛋白质等电点的方法各有侧重，实验操作难度大小也不同，一般来说，选择合适的测定方法应根据样品特点和实验条件。
等电点聚焦测蛋白质等电点
实验四等电点聚焦测蛋白质等电点宫魁六组200928006841083一、实验原理：等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，IEF实质就是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。
在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极之间逐步建立起稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其它两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终到达一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是这种分子的pI。
聚焦在等电点的分子也会不断地扩散。
一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。
因此，这些分子总是处于不断地扩散和抗扩散的平衡之中，在pI处得以“聚焦”。
二、实验仪器和用具：玻璃管（4支）、封口膜、试管架、细长滴管、注射器和长针头、培养皿、刀片、烧杯、微量移液器、圆盘电泳槽及电泳仪三、试剂：0.1M磷酸（500ml）、0.1M氢氧化钠（1000ml）、丙烯酰胺储液、两性载体电解质、TEMED、牛血清蛋白样品（0.5mg/ml）、过硫酸铵（10%）、三氯乙酸（10%）等四、实验步骤：1、先将玻管洗净，用封口膜封的一端垂直放在架上；2、配胶：丙烯酰胺储液0、67ml两性载体电解质0、2mlTEMED 0、004ml牛血清蛋白质样品0、04ml蒸馏水 2.9ml过硫酸铵0.02ml3、用细长滴管加入溶液至10cm高处，胶面上加3—3cm高水层，进行封闭，聚合10—50min，吸出上层水，用滤纸稍微吸取；4、在电泳槽上槽加800ml磷酸，下槽500ml氢氧化钠；5、将管接入电泳槽，要求上端浸入液面，下端不接触下槽底面，注意排除凝胶下表面的气泡；6、接上电源，正极接酸，负极接碱；恒定160v，4h左右，电泳至电流为“0”；7、取胶将聚胶后的含蛋白质样品的凝胶借助注射器针头注水取出；8、量取三条胶的长度；9、pH梯度的测定取KCl溶液分别加入2ml于10只小管中，将欲测pH 梯度的胶条置于玻片上，用刀片切成1cm长的小段，按顺序放入有标号的小管中，盖好盖子，室温下过夜；10、次日用pH计测每只小瓶中浸泡液的pH值。
蛋白质两性性质及等电点的测定
蛋白质两性性质及等电点的测定蛋白质是生物体中极其重要的有机化合物，是构成生物体的基本组成部分之一。
蛋白质具有很多种类和功能，不同的蛋白质在生物体内发挥着不同的作用。
蛋白质的性质也因其结构而异，其中包括两性性质和等电点。
本文将介绍蛋白质的两性性质及等电点的测定。
一、蛋白质的两性性质蛋白质是由多肽链组成的，其分子中含有氨基酸残基。
这些氨基酸残基中的羧基（-COOH）和氨基（-NH2）可以参与酸碱反应，所以蛋白质具有两性性质，能够在不同的pH值下呈现不同的电离状态。
1. 在低pH值下，蛋白质中的羧基处于质子化状态，成为正电荷，而氨基则不受质子化，保持中性。
因此，在低pH值时，蛋白质呈正电荷状态，称为阳离子。
2. 在高pH值下，蛋白质中的氨基受到氢离子的质子化，成为正电荷，而羧基则不受质子化，保持中性。
因此，在高pH值时，蛋白质呈负电荷状态，称为阴离子。
3. 在等电点附近，蛋白质的质子化和去质子化同时发生，羧基和氨基的质子化程度相等，呈中性状态。
此时，蛋白质没有净电荷，称为等电点。
由于蛋白质的两性性质，可以影响其溶解性、折叠构象和相互作用等特性，对其功能和生物学作用具有重要影响。
二、蛋白质等电点的测定等电点是蛋白质具有中性状态的pH值。
测定蛋白质的等电点可以帮助我们了解其溶解性、电动力学性质和酸碱加工过程中的变化。
常用的测定等电点的方法有以下几种：1. pH梯度电泳法：这是一种常用且广泛应用的测定等电点的方法。
在一个pH梯度上进行电泳，当蛋白质离子迁移速率和电场力相等时，达到等电点。
可以通过在梯度上观察蛋白质带的形成和移动情况来确定等电点。
2. 等电聚焦电泳法：这是一种利用电场作用下蛋白质在凝胶上垂直移动的方法，根据蛋白质在凝胶中的移动速率和电场力相等时的pH值来测定等电点。
3. 等电点电位计法：该方法利用等电点时蛋白质没有净电荷的特性，使用电位计测量蛋白质在不同pH值下的电位变化，找出没有净电荷时的pH值，即为等电点。
聚丙烯酰胺凝胶平板等电聚焦电泳测定蛋白质等电点
聚丙烯酰胺凝胶平板等电聚焦电泳测定蛋白质等电点一、目的：学习聚丙烯酰胺凝胶平板等电聚焦电泳测定蛋白质等电点的原理及方法。
二、原理：等电点聚焦（isoelectric focusing, IEF）或简称电聚焦（electrof ocusing），也曾称等电点分离聚焦电泳等。
它是60年代中期出现的技术，克服了一般电泳易扩散的缺点。
近年来，等电点聚焦电泳又有了新的进展，可以分辨等电点只差0.001pH单位的生物分子。
由于它的分辨力高、重复性好、样品容量大、操作简便、迅速，在生物化学、分类学、分子生物学及临床医学研究等诸方面，都得到广泛应用。
等电点聚焦电泳产生pH 梯度的方法有两种：一是用两种不同的pH缓冲液相互扩散，在混合区形成pH梯度，此为人工pH梯度。
这种pH梯度不稳定，常用于制备电泳；另一种是利用载体两性电解质在电场作用下形成自然pH梯度。
本实验就是利用载体两性电解质形成的自然pH梯度进行蛋白质样品等电焦聚电泳的。
理想的载体两性电解质应该在其本身的等电点处有足够的缓冲能力和良好的导电性，且分子量要小，组成与被分析样品有所区别，对分析样品无变性作用或发生化学反应。
常用的载体两性电解质是一系列脂肪族多氨基和多羧基类的混合物，即是一系列的异构物和同系物，分子量在300—1000之间，各组分的等电点(pI)既有差异又相接近，pI的范围在2.5—11之间。
合成载体两性电解质的原料是丙烯酸和多乙烯多胺，合成反应如下：R1 和R2为氢或带有氨基的脂肪基。
这一反应的特点是生成众多的异构物和同系物的混合物，而不是均一的化合物。
混合物中各成分的含量、等电点的分布，取决于原材料的性质、比例和合成条件。
目前常用的载体两性电解质的商品有：Ampholine（LKB公司）、Pharmlyte（Phar macia公司）、 Serralyty（Serva公司），近来已有国产商品了。
不同厂家合成的方法不同，电泳的条件也略有不同。
实验报告等电点聚焦测蛋白质等电点
实验报告等电点聚焦测蛋白质等电点引言：蛋白质是生物体中一类重要的生物大分子，它们的功能和性质与其结构密切相关。
等电点是指蛋白质在溶液中存在时呈电荷中性的pH值。
当蛋白质的溶液中pH等于它的等电点时，蛋白质的正电荷和负电荷相等，从而净电荷为0。
等电点测定是一种常用的方法，用于确定蛋白质的等电点。
实验目的：1.掌握等电点聚焦技术的原理和操作方法。
2.利用等电点聚焦技术测定其中一种蛋白质的等电点。
材料与方法：1.实验仪器：等电点聚焦仪。
2.实验试剂：蛋白质样品、等电点聚焦凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、溶液缓冲液等。
3.样品制备：取适量的蛋白质样品，加入等电点样品溶液缓冲液，使其浓度适当。
4.等电点聚焦凝胶制备：根据实验需要，选择适当的pH梯度，制备等电点聚焦凝胶。
5.实验操作：将已制备好的等电点聚焦凝胶放置于等电点聚焦仪中，按照仪器操作说明进行调试和操作。
将样品加载到凝胶上，通过电场力使其在凝胶中聚焦移动，最终形成pH梯度。
根据蛋白质的等电点，蛋白质在凝胶中会聚焦在对应的位置。
6.凝胶分离与染色：等电点聚焦结束后，取出凝胶，根据需要进行分离和染色。
结果与讨论：等电点聚焦技术是一种高效、准确的测定蛋白质等电点的方法。
它利用电场力将蛋白质在凝胶中聚焦，根据蛋白质在不同pH条件下的电荷变化，最终确定其等电点。
该方法操作简便、结果可靠，适用于各类蛋白质的等电点测定。
结论：本实验利用等电点聚焦技术成功地测定了一种蛋白质的等电点，并通过凝胶分离和染色展示了等电点聚焦的结果。
等电点聚焦技术在蛋白质等电点测定中具有重要的应用价值，可以为蛋白质结构和功能的研究提供重要的参考。
[1]赵海洋.蛋白质等电点聚焦技术[J].广西科技大学学报，2024[2]张桂泉,王运青,刘晓东.蛋白质等电点聚焦的实验教学及质量考察[J].高等教育化学研究，2024。
蛋白质等电点的测定
水浴锅、温度计、200毫升锥形瓶、100图毫升聚容量丙瓶烯、吸酰管胺、试凝管胶、试圆管盘架、电乳泳钵 示意图
(A为正面,B为剖面)
四、操作方法 1. 凝胶柱的制备
（1）玻璃管的一端插在橡皮帽中 （2）配胶
表 10mL 7.5%凝胶的配制
试剂名称
体积(mL)
凝胶贮液
2.5
两性电解质载体
0.5
蒸馏水
10%过硫酸铵
最常用的方法是：
凝胶贮液
2.
①测其溶解度最低时的溶液pH值。 ％酪蛋白醋酸钠溶液
水浴锅、温度计、200毫升锥形瓶、100毫升容量瓶、吸管、试管、试管架、乳钵
10%TEMED
0.
②等电聚焦电泳测其净电荷为零时的PH 求出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度为：
②等电聚焦电泳测其净电荷为零时的PH
蛋白区带中心距凝胶条正极端的距离
以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持介质，并在凝 胶中加入两性电解质载体，在电场作用下，蛋 白质在此pH梯度的凝胶中泳动，当迁移至pH值 等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的 区带。
三、实验试剂与仪器 1）两性电解质 2）30％丙烯酰胺溶液 3）TEMED 4）10％过硫酸铵溶液 5）负极缓冲液：0.1M NaOH 6) 正极缓冲液：0.1M 磷酸或硫酸 7) 固定液：10％（W/V）三氯乙酸 8) 染色液 9) 脱色液 10) 蛋白质等电点标准 11) 电泳仪 12) 圆盘电泳槽
10%TEMED
0.1
蛋白质混合样品
0.1
混匀后置真空干燥器中抽气
10 min
（3）将配好的凝胶溶液用细长头滴管加到预先准备好的玻管 中，至离上端1 cm处，再用注射器缓缓加水3-5 mm高。
ice3 (protein simple)等电点
等电点是指蛋白质分子所带净电荷为零时的pH 值，是蛋白质最基本和最重要的理化参数之一。
在生物化学、分类学、分子生物学及临床医学研究等诸方面，等电点都得到广泛应用。
ICE3是ProteinSimple公司推出的一款蛋白质等电聚焦分析系统，采用独特的全分离柱检测技术，结合凝胶平板等电聚焦的高分辨率及可靠性和毛细管柱分离技术的自动进样及定量检测的优点，快速方便，重复性高。
该系统适用于蛋白质药物稳定性的研究和产品的定性分析，有助于产品快速通过专业机构的认可。
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检测蛋白质等电点的方法
检测蛋白质等电点的方法
以下是 8 条关于检测蛋白质等电点的方法：
1. 电泳法呀，哇哦，就像让蛋白质们来一场赛跑！比如在凝胶上，不同的蛋白质会根据它们的电荷特性以不同速度前进，是不是很神奇呀？
2. 盐析法呢，就好像把蛋白质放在一个特殊的“筛子”里，随着盐浓度的变化，能看出它们的沉淀情况，这可是个很妙的方法哟！比如说鸡蛋清遇到盐会发生的变化。
3. 等电聚焦法，嘿，想象一下蛋白质顺着电势梯度找到自己的“专属位置”，多有意思呀！像在专门为它们打造的小天地里各就各位。
4. pH 滴定法，这就像是精确地调整酸碱度来引出蛋白质的神秘反应呀！比如慢慢地滴加酸碱看看会发生什么。
5. 分光光度法，哇塞，通过光的变化来洞察蛋白质的秘密，多酷啊！就像是用光线当钥匙打开蛋白质秘密的大门。
6. 超滤法呢，也好有趣呀，把蛋白质和其他东西分离开，就像在一个大混合物里精准地捞出我们想要的，你说好玩不？就拿混合溶液来试试呀。
7. 离子交换层析法，嘿，这就如同让蛋白质在离子的世界里穿梭筛选，找出它们的归宿，是不是很特别呢！就像在一个离子构建的迷宫里探索。
8. 透析法，哇哦，让蛋白质在膜的两边来回穿梭，想想就很刺激呀！就如同让它们玩一场特殊的“穿越游戏”。
我觉得每一种方法都有其独特之处和魅力呀，关键是能帮助我们更好地了解蛋白质的性质呢！。
amh蛋白等电点
AMH蛋白等电点引言AMH（Anti-Müllerian Hormone）是一种由人体生产的蛋白质，它在胚胎发育和生殖系统中起着重要的作用。
AMH蛋白的等电点是指其在电泳过程中停留在凝胶上的特定pH值，本文将深入探讨AMH蛋白等电点的相关知识。
AMH蛋白简介AMH是一种由Sertoli细胞合成的二聚体蛋白质，主要存在于男性睾丸和女性卵巢中。
它在男性中发挥着抑制女性生殖管道发育和促进睾丸发育的作用，在女性中则参与卵巢早期发育以及排卵调节。
因此，AMH在生殖系统发育和功能中扮演着重要角色。
等电点概述等电点是指溶液中带有电荷的分子或粒子净电荷为零时所对应的pH值。
当分子带有正电荷时，其净电荷为正；当分子带有负电荷时，其净电荷为负。
而在等电点附近，分子的净电荷为零。
对于蛋白质而言，等电点是指在某个特定pH值下，蛋白质的净电荷为零。
AMH蛋白等电点的测定方法测定AMH蛋白的等电点可以采用多种方法，其中常用的有等电聚焦法和凝胶电泳法。
等电聚焦法等电聚焦法是一种基于蛋白质在不同pH值下迁移速度不同的原理进行分离的方法。
通过将样品放置在一个具有连续pH梯度的凝胶上，施加直流电场使蛋白质沿着梯度迁移。
当蛋白质达到其等电点时，其净电荷为零，停留在相应位置上。
通过染色或其他检测方法可确定AMH蛋白的等电点位置。
凝胶电泳法凝胶电泳法是一种常用于分离和测定蛋白质等离子体组分的方法。
通过将样品加载到一个凝胶中，并施加直流电场使蛋白质迁移，根据其迁移速度和距离可以推断出其等电点位置。
具体方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳（IEF）等。
AMH蛋白等电点的意义AMH蛋白的等电点对于研究其结构和功能具有重要意义。
首先，等电点可以提供关于蛋白质带电情况的信息。
通过测定AMH蛋白的等电点，可以了解其在不同pH值下的带电状态，进而推断出其氨基酸序列中可能存在的离子化基团。
其次，等电点还与蛋白质的溶解性和稳定性相关。
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❖ 4. 剥胶
❖ 取下胶管，用H2O 将胶管和两端洗2次， 用注射器沿管壁轻轻插入针头，在转动胶 管和内插针头的同时分别向胶管两端注入 H2O少许，胶条即自行滑出，若不滑出可 用洗耳球轻轻挤出。胶条置于小培养皿内， 记住正极端为“头”，负极端为“尾”， 若分不清时，可用pH试纸鉴定，酸性端为 正，碱性端为负。
的pH梯度。在此梯度中进行不同pI的蛋白 质等电聚焦, 随着电泳时间的增加，不同pI 蛋白质都会停留在与各自pI相同的pH位置， 不再移动，测定这些位置pH，即得到这些 蛋白质的等电点pI。
两性电解质载体:
⒈ 溶解性好、缓冲能力强，能形成稳定的pH梯 度
⒉ 导电性能好 ⒊ 化学性质稳定，无毒、无生物学效应，不影
pH ＞ pI 蛋白质带负电荷 → 正极
pH ＜ PI 蛋白质带正电荷 → 负极
pH = pI 净电荷为O
不移动
❖ 等电聚焦（Isoelectric focusing，简称IEF）是 六十年代中期出现的新技术。由瑞典科学家建立， 利用蛋白质具有不同等电点在一个稳定 线性 连 续的pH梯度中进行分析和分离。
❖ 5. 染色
❖ 每组取五支胶条置于一个小培养皿内，倒 入染色溶液至没过胶条，进行染色脱色， 约半小时后，即可看到胶条内蛋白质的蓝 色沉淀带。倒出脱色液，用直尺量出胶条 长度“L2”和正极端到蛋白质白色沉淀带 中心（即聚焦部位）的长度“L’”。
❖ 6. 测定pH梯度
❖ 将放在另一个培养皿内未固定的胶条，用直 尺量出待测pH胶条的长度“L1”。按照由正 极至负极的顺序，用镊子和小刀依次将胶条 切成10mm长的小段，分别置于小试管中， 加入1ml H2O，浸泡半小时以上或过夜，用 仔细校正后的pH试纸测出每管浸出液的pH 值。
响蛋白质活性 ⒋ 紫外吸收低，分子量小，与蛋白质可逆结合
易除去
❖ 两性电解质载体: 多羧基 多氨基的脂肪族化合物. 淡黄色的水溶液 40% 4℃ 商品有不同的pH范围供选择. 本实验的终浓度为多少?
❖ 本实验采用柱状聚焦电泳法进行 ❖ 超薄层凝胶等电聚焦法 ❖ 园盘状等电聚焦法
❖ 三 试剂与器材 1 凝胶储备液
❖ 凝胶等电聚焦法是一种特殊的聚丙烯酰 胺凝胶电泳法。
❖ 特点:在凝胶中加入一种两性电解质载体的 化合物其可以使凝胶柱上产生pH梯度。把蛋 白质样品放在这样的凝胶柱中进行电泳带电 荷的蛋白质离子即在柱上泳动。当泳动至凝 胶的某一部位时而此部位的pH正好相当于该 蛋白质的pI时由于蛋白质在等电点时净电荷 为0即不在移动测定聚焦部位凝胶的pH值 即是该蛋白质的pI.
❖ 7、数据处理
1. 以胶条长度（mm）为横座标，pH值为纵座标作图，得到一条 pH梯度曲线。所测每管的pH值为10mm胶条的pH的混合平均值。 作图时将此pH值取为10mm小段中心即5mm处的pH值。 2. 用下式计算蛋白质聚焦部位至胶条正极端的实际长度L ：
L L' L1 L2
上式中：L’——量出蛋白质的白色沉淀带中心至胶条正极端的长 度。
❖ 蛋白样品
100ul
❖ TEMED
10ul
❖水
6.74ml
❖ 10%AP
0.15ml
10ml
10ml可灌6个凝胶柱
❖ 2. 装管
每个学生装1支管，每组装六支（其中五只为）。 将圆盘电泳槽的玻璃管洗净晾干，底端用塑料 薄膜和橡皮筋封口，垂直放在试管架上，用胶 头滴管将配好的胶液移入管内，（每根玻璃管 的容量约为~2ml），液面加至距管口5mm处， 用注射器轻轻加入少许H2O，进行水封，以消 除弯月面使胶柱顶端平坦。胶管垂直聚合约50 分钟，聚合完成时可观察到水封下的折光面。
❖ 3. 装槽和电泳
❖ 用滤纸条吸去胶管上端的水封，除去下端的薄膜， 水封端向上，将胶管垂直插入圆盘电泳槽内，调节 好各管的高度，记下管号。每支管约1/3在上槽， 2/3在下槽。上槽加入500ml 1M NaOH ，下槽加入 500ml 1M H3PO4 ，淹没各管口和电极，用注射器 或滴管吸去管口的气泡。上槽接负极，下槽接正极， 开启电泳仪，恒压160V，聚焦2至3小时，至电流近 于零不再降低时，停止电泳。
30gAcr，0.8gBis纯水定容至100ml 2 10%AP
1克AP至10毫升
Hale Waihona Puke 4 40%两性电解质载体（商品用品） 5 正极溶液: 1M磷酸溶液（2000ml/班）
H3PO4(85 %)68ml，加纯水定容至1000ml
6 负极溶液: 1MNaOH溶液（2000ml/班）
NaOH40g，加纯水定容至1000ml
7 固定染色液（1000ml/2班） : 10g三氯乙酸，0.5g考马斯亮蓝R250，
定容至100ml(先溶解三氯乙酸，待颗粒溶解 完全，加入考马斯亮蓝R250 ) 8 未知pI样品溶液: 5mg/ml 10ml
四 实验操作
1. 凝胶柱的制备 配方如下:
❖ 凝胶液
2.5ml
❖ 40%Ampholine 0.5ml
聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳 测定蛋白质等电点
张楠楠
一 目的 1 学习凝胶等电聚焦的原理 2 掌握圆盘聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳操
作技术 3 测定出本实验条件样品的等电点
原理
❖ 等电聚焦（Isoelectric focusing，简称IEF）是 六十年代中期出现的新技术。近年来等电聚 焦技术有了新的进展，已迅速发展成为一门 成熟的近代生化实验技术。目前等电聚焦技 术已可以分辨等电点（pI）只差0.001pH单位 的生物分子。由于其分辨力高，重复性好， 样品容量大，操作简便迅速，在生物化学、 分子生物学及临床医学研究中得到广泛的应 用。
L1——测pH的胶条的长度 L2——固定后胶条的长度 3. 根据计算出的L，由pH梯度曲线上查出相应的pH值，即为该蛋 白质的等电点。
❖ 近年来等电聚焦技术有了新的进展，已迅速发 展成为一门成熟的近代生化实验技术。目前等电 聚焦技术已可以分辨等电点（pI）只差0.001pH单 位的生物分子。由于其分辨力高，重复性好，样 品容量大，操作简便迅速，在生物化学、分子生 物学及临床医学研究中得到广泛的应用。
❖ 本实验利用pH3~9的两性电解质载体在聚 丙烯酰胺凝胶中形成一个稳定 连续 线性