凝胶等电聚焦测定蛋白质等电点

pH ＞ pI 蛋白质带负电荷 → 正极
pH ＜ PI 蛋白质带正电荷 → 负极
pH = pI 净电荷为O
不移动
❖ 等电聚焦（Isoelectric focusing，简称IEF）是 六十年代中期出现的新技术。由瑞典科学家建立， 利用蛋白质具有不同等电点在一个稳定 线性 连 续的pH梯度中进行分析和分离。
7 固定染色液（1000ml/2班） : 10g三氯乙酸，0.5g考马斯亮蓝R250，
定容至100ml(先溶解三氯乙酸，待颗粒溶解 完全，加入考马斯亮蓝R250 ) 8 未知pI样品溶液: 5mg/ml 10ml
源自文库
四 实验操作
1. 凝胶柱的制备 配方如下:
❖ 凝胶液
2.5ml
❖ 40%Ampholine 0.5ml
❖ 蛋白样品
100ul
❖ TEMED
10ul
❖水
6.74ml
❖ 10%AP
0.15ml
10ml
10ml可灌6个凝胶柱
❖ 2. 装管
每个学生装1支管，每组装六支（其中五只为）。 将圆盘电泳槽的玻璃管洗净晾干，底端用塑料 薄膜和橡皮筋封口，垂直放在试管架上，用胶 头滴管将配好的胶液移入管内，（每根玻璃管 的容量约为~2ml），液面加至距管口5mm处， 用注射器轻轻加入少许H2O，进行水封，以消 除弯月面使胶柱顶端平坦。胶管垂直聚合约50 分钟，聚合完成时可观察到水封下的折光面。
的pH梯度。在此梯度中进行不同pI的蛋白 质等电聚焦, 随着电泳时间的增加，不同pI 蛋白质都会停留在与各自pI相同的pH位置， 不再移动，测定这些位置pH，即得到这些 蛋白质的等电点pI。
两性电解质载体:
⒈ 溶解性好、缓冲能力强，能形成稳定的pH梯 度
⒉ 导电性能好 ⒊ 化学性质稳定，无毒、无生物学效应，不影
聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳 测定蛋白质等电点
张楠楠
一 目的 1 学习凝胶等电聚焦的原理 2 掌握圆盘聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳操
作技术 3 测定出本实验条件样品的等电点
原理
❖ 等电聚焦（Isoelectric focusing，简称IEF）是 六十年代中期出现的新技术。近年来等电聚 焦技术有了新的进展，已迅速发展成为一门 成熟的近代生化实验技术。目前等电聚焦技 术已可以分辨等电点（pI）只差0.001pH单位 的生物分子。由于其分辨力高，重复性好， 样品容量大，操作简便迅速，在生物化学、 分子生物学及临床医学研究中得到广泛的应 用。
30gAcr，0.8gBis纯水定容至100ml 2 10%AP
1克AP至10毫升
4 40%两性电解质载体（商品用品） 5 正极溶液: 1M磷酸溶液（2000ml/班）
H3PO4(85 %)68ml，加纯水定容至1000ml
6 负极溶液: 1MNaOH溶液（2000ml/班）
NaOH40g，加纯水定容至1000ml
❖ 凝胶等电聚焦法是一种特殊的聚丙烯酰 胺凝胶电泳法。
❖ 特点:在凝胶中加入一种两性电解质载体的 化合物其可以使凝胶柱上产生pH梯度。把蛋 白质样品放在这样的凝胶柱中进行电泳带电 荷的蛋白质离子即在柱上泳动。当泳动至凝 胶的某一部位时而此部位的pH正好相当于该 蛋白质的pI时由于蛋白质在等电点时净电荷 为0即不在移动测定聚焦部位凝胶的pH值 即是该蛋白质的pI.
❖ 5. 染色
❖ 每组取五支胶条置于一个小培养皿内，倒 入染色溶液至没过胶条，进行染色脱色， 约半小时后，即可看到胶条内蛋白质的蓝 色沉淀带。倒出脱色液，用直尺量出胶条 长度“L2”和正极端到蛋白质白色沉淀带 中心（即聚焦部位）的长度“L’”。
❖ 6. 测定pH梯度
❖ 将放在另一个培养皿内未固定的胶条，用直 尺量出待测pH胶条的长度“L1”。按照由正 极至负极的顺序，用镊子和小刀依次将胶条 切成10mm长的小段，分别置于小试管中， 加入1ml H2O，浸泡半小时以上或过夜，用 仔细校正后的pH试纸测出每管浸出液的pH 值。
❖ 近年来等电聚焦技术有了新的进展，已迅速发 展成为一门成熟的近代生化实验技术。目前等电 聚焦技术已可以分辨等电点（pI）只差0.001pH单 位的生物分子。由于其分辨力高，重复性好，样 品容量大，操作简便迅速，在生物化学、分子生 物学及临床医学研究中得到广泛的应用。
❖ 本实验利用pH3~9的两性电解质载体在聚 丙烯酰胺凝胶中形成一个稳定 连续 线性
❖ 7、数据处理
1. 以胶条长度（mm）为横座标，pH值为纵座标作图，得到一条 pH梯度曲线。所测每管的pH值为10mm胶条的pH的混合平均值。 作图时将此pH值取为10mm小段中心即5mm处的pH值。 2. 用下式计算蛋白质聚焦部位至胶条正极端的实际长度L ：
L L' L1 L2
上式中：L’——量出蛋白质的白色沉淀带中心至胶条正极端的长 度。
L1——测pH的胶条的长度 L2——固定后胶条的长度 3. 根据计算出的L，由pH梯度曲线上查出相应的pH值，即为该蛋 白质的等电点。
❖ 3. 装槽和电泳
❖ 用滤纸条吸去胶管上端的水封，除去下端的薄膜， 水封端向上，将胶管垂直插入圆盘电泳槽内，调节 好各管的高度，记下管号。每支管约1/3在上槽， 2/3在下槽。上槽加入500ml 1M NaOH ，下槽加入 500ml 1M H3PO4 ，淹没各管口和电极，用注射器 或滴管吸去管口的气泡。上槽接负极，下槽接正极， 开启电泳仪，恒压160V，聚焦2至3小时，至电流近 于零不再降低时，停止电泳。
❖ 4. 剥胶
❖ 取下胶管，用H2O 将胶管和两端洗2次， 用注射器沿管壁轻轻插入针头，在转动胶 管和内插针头的同时分别向胶管两端注入 H2O少许，胶条即自行滑出，若不滑出可 用洗耳球轻轻挤出。胶条置于小培养皿内， 记住正极端为“头”，负极端为“尾”， 若分不清时，可用pH试纸鉴定，酸性端为 正，碱性端为负。
响蛋白质活性 ⒋ 紫外吸收低，分子量小，与蛋白质可逆结合
易除去
❖ 两性电解质载体: 多羧基 多氨基的脂肪族化合物. 淡黄色的水溶液 40% 4℃ 商品有不同的pH范围供选择. 本实验的终浓度为多少?
❖ 本实验采用柱状聚焦电泳法进行 ❖ 超薄层凝胶等电聚焦法 ❖ 园盘状等电聚焦法
❖ 三 试剂与器材 1 凝胶储备液