总抗氧化能力测定 FRAP法

总抗氧化能力检测试剂盒 (FRAP 法 )

总抗氧化能力检测试剂盒(FRAP法)产品编号产品名称包装S0116 总抗氧化能力检测试剂盒(FRAP法) 100次产品简介：总抗氧化能力检测试剂盒(FRAP法)，即Total Antioxidant Capacity Assay Kit with FRAP method，简称T-AOC Assay Kit，是一种采用Ferric Reducing Ability of Plasma (FRAP)方法，可以对血浆、血清、唾液、尿液等各种体液，细胞或组织等裂解液、植物或中草药抽提液、或各种抗氧化物(antioxidant)溶液的总抗氧化能力进行检测的试剂盒。

活性氧(Reactive oxygen species, ROS)主要包括羟基自由基、超氧自由基和过氧化氢。

在细胞或组织的正常生理代谢过程中会产生活性氧，同时一些环境因子例如紫外照射、γ射线照射、吸烟、环境污染等也可以诱导活性氧的产生。

活性氧产生后，可以导致细胞内脂、蛋白和DNA等的氧化损伤，诱发氧化应激(Oxidative stress)，继而导致各种肿瘤、动脉粥样硬化、风湿性关节炎、糖尿病、肝损伤、以及中枢神经系统疾病等。

机体中存在多种抗氧化物，包括抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶等，可以清除体内产生的各种活性氧，以阻止活性氧诱导的氧化应激(oxidative stress)的产生。

一个体系内的各种抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶的总的水平即体现了该体系内的总抗氧化能力。

因此测定血浆、血清、尿液、唾液等各种体液，细胞或组织等裂解液中的总抗氧化能力具有非常重要的生物学意义。

植物或中草药抽提液、或各种抗氧化物溶液的总抗氧化能力的检测可以用于检测各种溶液的抗氧化能力的强弱，可以用于筛选强抗氧化能力的药物。

FRAP法测定总抗氧化能力的原理是酸性条件下抗氧化物可以还原Ferric-tripyridyltriazine (Fe3+-TPTZ)产生蓝色的Fe2+-TPTZ，随后在593nm测定蓝色的Fe2+-TPTZ即可获得样品中的总抗氧化能力。

抗氧化物活性测定方法总结

抗氧化物活性测定方法总结抗氧化物活性测定方法是通过对样品中的抗氧化物质含量和抗氧化活性进行定量分析，评估其对自由基的清除能力和抗氧化能力。

随着抗氧化研究的不断深入，测定方法也逐渐完善。

以下是对常见的抗氧化物活性测定方法的总结。

1. ORAC法（氧化应激反应活性测定法）：该方法通过测定样品清除自由基的能力来评估其抗氧化活性。

实验中，将样品与荧光试剂（如2,2'-azobis(2,4-dimethylvaleronitrile)）共同作用，观察其清除自由基的能力，并通过建立标准曲线计算样品的ORAC值。

2.DPPH法（1,1-二苯基-2-苦味基-苦味酸磷）：该方法是一种常用的快速测定抗氧化活性的方法。

实验中，将样品与DPPH稳定自由基共同作用，通过比色反应观察DPPH自由基被样品清除的程度，从而评估抗氧化活性。

3.ABTS法（2,2'-联氮双5-苯砜酸）：该方法通过ABTS离子自由基的生成和清除反应来测定样品的抗氧化活性。

实验中，ABTS与过氧化氢反应生成ABTS离子自由基，通过观察样品对其的清除能力来评估抗氧化活性。

4.FRAP法（亚铁离子还原能力）：该方法基于样品对人造抗坏血酸（Fe3+）的还原能力，通过测量还原后的Fe2+离子的生成量来评估抗氧化活性。

实验中，将样品与Fe3+离子反应生成Fe2+离子，通过比色反应来测定Fe2+的含量。

5. 碘标法（Iodine value）：该方法用于测定油脂、脂肪等样品的抗氧化活性。

实验中，将已知量的碘与样品中的不饱和化合物反应，在光反应下观察反应终点的颜色变化，并根据标准曲线计算样品的抗氧化活性。

6. 硝酸盐法（Nitrite method）：该方法用于测定样品中亚硝酸盐的含量，从而评估其抗氧化活性。

实验中，样品经过还原反应生成亚硝酸盐，然后与DANO（N-乙基-N-（2-苯基乙基）-对硝基苯胺）反应生成稳定的偶氮染料，通过比色测定反应终点的吸光度来计算样品中亚硝酸盐的含量。

3种抗氧化活性测定方法

3种抗氧化活性测定方法抗氧化活性测定是评估物质抗氧化能力的重要方法，常用于食品、药物和化妆品等领域。

下面将介绍三种常用的抗氧化活性测定方法。

一、DPPH自由基清除法DPPH(2,2-二苯基-1-苦味肼)是一种常用的抗氧化剂，它能采用紫色的自由基形式存在，并且在反应中会转变为无色的稳定形式。

DPPH自由基清除法是一种简单而直观的测定方法。

该方法的基本原理是将待测物添加到预先溶解的DPPH中，反应一段时间后，根据颜色变化程度来评估抗氧化活性。

通过测量样品溶液吸光度的降低来计算其清除率，清除率越高，抗氧化能力越强。

二、FRAP法FRAP(铁还原能力)法是一种评估抗氧化物质电子给予能力的方法。

抗氧化物质能够通过给予电子来中和自由基的电子，从而保护细胞免受氧化损伤。

FRAP法通过反应产生的铁（II）络合物的吸光度变化来评估样品的抗氧化能力。

具体操作中，将待测物加入到铁（III）试剂（通常为铁(III)氯化物）中，待反应一定时间后，读取吸光度。

样品的抗氧化能力可以通过吸光度的变化来计算。

三、TBARS法TBARS(硫代巴比妥酸反应物)法是一种评估脂质过氧化的方法。

脂质过氧化是一种自由基引起的反应，会导致脂质的氧化和脂质分解产生不稳定化合物。

TBARS法主要用于评估食品和药物等样品中脂质过氧化的程度。

该方法通过将待测样品与反应试剂（如硫代巴比妥酸）反应生成稳定的色素产物，然后测量这种产物的吸光度来评估脂质过氧化的程度。

吸光度越高，脂质过氧化程度越高。

综上所述，DPPH自由基清除法、FRAP法和TBARS法是常用的抗氧化活性测定方法。

每种方法都有其独特的原理和应用范围，选择适合的方法可以准确评估样品的抗氧化能力。

在实际应用中，可以根据实验需求选择合适的方法，或结合多种方法综合评估抗氧化活性。

总抗氧化能力（FRAP 法）试剂盒说明书

总抗氧化能力（FRAP 法）试剂盒说明书微量法100T/96S 注　意：正式测定之前选择2-3 个预期差异大的样本做预测定。

研究意义：测定对象中各种抗氧化物质和抗氧化酶等构成总抗氧化水平。

在生物学、医学和药学研究中常常检测血浆、血清、唾液、尿液等各种体液，细胞或组织等裂解液、植物或中草药抽提液及各种抗氧化物(antioxidant)溶液的总抗氧化能力。

测定原理：在酸性环境下，抗氧化物质还原Fe3+-三吡啶三吖嗪(Fe3+-TPTZ)产生蓝色的Fe2+-TPTZ 的能力反映了总抗氧化能力。

自备实验用品：恒温水浴锅、低温离心机、酶标仪、96 孔板和蒸馏水。

试剂组成和配制：提取液：液体120mL×1 瓶，使用前预冷。

试剂一：液体20 mL×1 瓶，避光保存。

试剂二：液体2 mL×1 瓶，4℃避光保存。

试剂三：液体2 mL×1 瓶，避光保存。

混合液(现配现用)：将试剂一、试剂二、试剂三按10:1:1 的比例混合，使用前37℃预温。

样品的制备：(1) 血清、血浆、唾液或尿液等液体样品血浆（制备时可以使用肝素或柠檬酸钠抗凝，不宜使用EDTA 抗凝）4℃，5000rpm 离心10min，取上清待测。

血清、唾液或尿液样品直接用于测定，也可以-80℃冻存（不宜超过30 d）后再测定。

(2) 组织样品按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

(3) 细胞样品按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1 的比例（建议500 万细胞加入1mL 提取液），冰浴超声波破碎（功率200W，超声3s，间隔10s，重复30 次）；10000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

操作步骤：1、酶标仪预热30min，调节波长至593nm。

抗氧化物活性测定方法总结

抗氧化物活性测定方法总结抗氧化物活性测定方法（倾向于考虑DPPH法和ORAC法）1.FRAP法:铁离子还原抗氧化能力测定法[1]FRAP(ferric ion reducing antioxidant power)方法，在低pH值的溶液中，Fe3+-TPTz(Fe3+-三吡啶三嗪)被抗氧化剂还原成有色的Fe2+-TPTZ。

反应的结果常以Fe2+当量或标准物质的抗氧化能力表示。

该法快速简便、易于操作、重复性好，但FRAP反应属于电子转移(SET)反应，因此FRAP方法不能够测定氢转移反应(HAT)起作用的物质。

而且该法实际测定的是待测生物活性物质将Fe3+还原为Fe2+的能力，因此没有抗氧化能力的生物学相关性。

2.TEAC法(trolox equivalent antioxidant capacity)ABTS(2,2'-amino-di(2-ethyl-benzothiazoline sulphonic acid-6)ammonium salt,2,2'氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐)与过氧化物酶和氢过氧化物在一起形成ABTS+阳离子自由基。

在抗氧化剂存在时，这种自由基混合物的光吸收值下降，下降程度取决于抗氧化剂的抗氧化能力，测得的结果以TEAC表示，即被测抗氧化剂清除ABTS·+的能力(吸光度大小的变化)与标准抗氧化剂trolox(VE的水溶性类似物)清除ABTS·+的能力的比值。

TEAC法十分简单，适用于大量样品的分析检测。

但是，ABTS·+并非生理自由基，缺乏生理相关性，而且与FRAP方法相似，ABTS·+与不同抗氧化剂问的氧化反应时间不同，因此，只能定性不能定量评价样品的抗氧化能力。

3.DPPH法[2，3](2，2-diphenyt-l-picrylhydrazyl radical scavenging capacity)DPPH·(二苯代苦味肼基自由基)法是较常用的方法之一。

DPPH和FRAP法测定41种中草药抗氧化活性

第 30 卷第 6 期 2011 年 6 月
实验室研究与探索
RESEARCH AND EXPLORATION IN LABORATORY
Vol． 30 No． 6 Jun． 2011
DPPH 和 FRAP 法测定 41 种中草药抗氧化活性
陈玉霞，刘建华，林峰，杜向党
（河南农业大学牧医工程学院，河南郑州 450002）
0引言
人体产生的自由基及其诱导的氧化反应与多种疾病密切相关，并可加速人体衰老，抗氧剂能有效清除自由基，延缓人体衰老和预防疾病。目前，在医疗和食品领域使用较多的是合成抗氧剂，而实验动物研究表明，合成抗氧剂，如 BHT、BHA 对生物体有潜在的毒副作用，加上人们日益追求环保，因此，近年来寻找天然、安
（ 3）抗氧化活性的测定［1］。 ① 总抗氧化能力的测定（ FRAP 值测定）。取各供试品溶液，适当稀释后移液器取 100 μL，加入 FRAP 工作液 3 mL，混匀反应 20 min，于 593 nm 处读取吸光度。以 FeSO4 为标准物质绘制标准曲线（见图 1），求得回归方程为 Y = 0． 007X － 0． 019，相关系数为 R2 = 0． 994，样品的抗氧化能力以 FRAP 值表示： 1 FRAP单位 = 1 mmol / L FeSO4 ，即样品的抗氧化能力相当于 FeSO4 的 mmol / L 数。
中草药白花蛇舌草
苍术黑豆茺蔚子益母草川芎徐长卿杜仲黑芝麻牛膝龙葵人参黄芪山药葛根生地青黛薏苡仁韭子大蒜
DPPH / % 15． 11 ± 3． 75 10． 77 ± 2． 29 9． 31 ± 0． 22 9． 13 ± 3． 67 9． 13 ± 1． 09 8． 47 ± 4． 31 7． 96 ± 3． 79 7． 85 ± 1． 55 7． 64 ± 1． 64 7． 55 ± 1． 75 7． 04 ± 3． 07 6． 89 ± 1． 65 6． 27 ± 3． 88 6． 56 ± 0． 05 6． 07 ± 3． 47 5． 71 ± 0． 60 5． 61 ± 2． 75 5． 20 ± 0． 10 4． 69 ± 0． 41 2． 75 ± 0． 98

总抗氧化能力测定(FRAP法)讲解学习

总抗氧化能力测定(F R A P法)小麦叶片总抗氧化能力测定（FRAP法）一、实验原理FRAP法测定总抗氧化能力的原理是酸性条件下抗氧化物可以还原Ferric-tri-pyridyl-tria-zine(Fe3+-TPTZ)产生蓝色的Fe2+-TPTZ，随后在593nm测定蓝色的Fe2+-TPTZ即可获得样品中的总抗氧化能力。

由于反应在酸性条件下进行，可以抑制内源性的一些干扰因素。

并且由于血浆等样品中的铁离子或亚铁离子的总浓度通常低于10μM，因此血浆等样品中的铁离子或亚铁离子不会显著干扰FRAP法的检测反应。

由于反应体系中的铁离子或亚铁离子是和TPTZ螯合的，样品本身含有的少量金属离子螯合剂通常也不会显著影响检测反应。

AntioxidantFe3+-TPTZ（橘黄色）——————> Fe2+-TPTZ (蓝色)二、实验步骤1.FRAP工作液配制：0.3 M pH 3.6 醋酸缓冲液：0.364g无水醋酸钠+3.2mL冰乙酸定容至200mL，用1M HCl调节pH至3.6；10mmol/L TPTZ溶液25mL：0.078g TPTZ用40mM 盐酸溶液定容至25mL；20mmol/L FeCl溶液50mL：2.78g用RO水定容至50mL；3上述溶液以10:1:1的比例混合（现配现用）。

2.取叶片0.1g，加入2.5mL蒸馏水研磨稍沉淀后取1.5mL 12000g离心10min（4o C），取上清液。

3.在反应管中加入100uL上清液，再加入 2.4mL工作液，37 o C条件下水浴10min，于593nm处测定吸光度，的标准液替代样品绘制标准曲4.标准曲线绘制：以0.1-1.6mmol/L的FeSO4线。

三、结果计算以1.0mmol/L的FeSO4为标准，样品抗氧化活性以达到同样吸光度值为一个FRAP值，计算结果。

[1]Benzie I F F, Strain J J. The Ferric Reducing Ability of Plasma (FRAP) as a Measure of “Antioxidant Power”: The FRAP Assay[J]. Analytical Biochemistry, 1996, 239(1):70-6.[2]Katarzyna Szafrańska, Rafał Szewczyk, Krystyna Maria Janas. Involvem ent of melatonin applied to Vigna radiata, L. seeds in plant response to chilling stress[J]. Central European Journal of Biology, 2014, 9(11):1117-1126.。

抗氧活性的测定

园艺科学研究方法——园艺植物育种研究Ⅱ抗氧活性的测定一、实验目的：1、掌握FRAP 法测抗氧化活力的方法；2、常见水果、蔬菜的抗氧化能力比较。

二、实验原理：Ferric-tripyridyltriazine(Fe3+-TPTZ)三、仪器、耗材：离心机、离心管、离心管，移液器、分光光度计、水浴锅、塑料比色杯、试剂瓶，吸水纸，枪头、量筒、大研钵；苹果、青椒、葡萄、胡萝卜、番茄、芒果。

四、实验内容：1.不同果、蔬抗氧化物质的提取用自来水、蒸馏水反复冲洗干净后，分离果肉称取1～5 g ，在研钵内按1：9比例加入蒸馏水，研磨成匀浆液，10 000 r ／min 离心10 min ，取上清按下述FRAP 法测定抗氧化活性，每份样品重复测定5次。

2.FRAP 测定方法操作Fe2+-TPTZ 样品中总抗氧化能力抗氧化剂antioxidant 593nm 测定取适量样品上清(必要时稀释)，加入FRAP试剂，混匀后37℃反应10 min，593 nm 测定吸光度，以1.0 mM FeSO4为标准．样品抗氧化活性以达到同样吸光度所需的FeSO4的毫摩尔数表示。

（1）FRAP试剂准备100 ml醋酸缓冲液+ 10 ml TPTZ溶液+ 10 ml三氯化铁溶液+ 12 ml双蒸水，混匀，37℃保温。

（1）2 ml FRAP试剂+双蒸水1 ml，4 min后593 nm调零。

（2）2 ml FRAP试剂+100 ul 提取液+双蒸水900 ul，4 min后593nm 测量。

五、数据整理：三次重复的不同浓度Fe2+对应的吸光度Fe2+浓度（mM）吸光度(A) 平均值（A）第一次第二次第三次1.0 1.181 1.182 1.177 1.180 0.8 1.198 1.196 1.185 1.193 0.6 1.195 1.192 1.185 1.191 0.4 1.167 1.168 1.163 1.166 0.2 1.006 1.021 1.009 1.012 0.1 0.631 0.620 0.623 0.625 各种材料FRAP法抗氧化活性的测定重测量值一测量值二测量值三平均值（A) 抗氧化活性种类青椒 1.170 1.294 1.257 1.240 ＞1.00胡萝卜0.266 0.366 0.456 0.363 0.04苹果0.912 1.039 1.011 0.987 0.16葡萄0.739 0.703 0.729 0.724 0.12番茄 1.021 1.012 1.034 1.022 0.21芒果 1.071 1.069 1.067 1.069 0.23六、结果分析由表格得，胡萝卜的抗氧化活性最低，青椒的抗氧化活性最高。

总抗氧化活性评估

3、提取物总抗氧化活性评估采用铁还原/抗氧化能力（Ferric reducing/antioxidant power，FRAP）分析法。

取适量上述样品提取液（必要时稀释），加入 1.8ml TPTZ 工作液（由0.3moL/L 醋酸盐缓冲液25 ml、10 mmoL/L TPTZ 溶液 2.5 ml、20 mmol/L FeCl3溶液 2.5 ml 组成），混匀后37 ℃反应10 min，593 nm 测定吸光度，以 1.0 mmol/L FeSO4为标准，样品抗氧化活性以达到同样吸光度所需的FeSO4的毫摩尔数表示试剂的配方：1）TPTZ 工作液现用现配：由25ml 300 mmol/L pH 3.6的醋酸盐缓冲液、2.5ml 10mmol/L TPTZ溶液、2.5ml 20mmol/L FeCl3溶液混合而成。

A: 300 mmol/L醋酸盐缓冲液（PH3.5）取醋酸铵（分子量77）25g，加水25ml 溶解后，加7mol/L盐酸溶液38ml，用2 mol/L盐酸溶液或5 mol/L氨溶液准确调节PH值至3.5（电位滴定法），用水稀释至100（还是1000？你计算下）ml，即得。

B: TPTZ是一种化合物1,3,5- tri(2-pyridyl)-2,4,6-triazine (C18H12N6, TPTZ)的缩写2,4,6-三吡啶基三嗪（这个药品实验室估计没有，明天再找找，我买了，估计2-3天到）2）标准曲线的绘制：分别吸取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mmol/L的FeSO4标准液，加入3ml FRAP工作液，再加入0.3ml标准系列，混匀，准确反应5min，于593 nm处测定其吸光度，用超纯水调零，绘制标准曲线。

样品的抗氧化活性(FRAP值)以达到相同吸光度所需FeSO4的毫摩尔数表示。

3）样品的测定：量取0.1ml的样品溶液，加入3ml FRAP工作液，再加入0.3 ml 待测样品，混匀，准确反应5 min，于593 nm处测定其吸光度，用超纯水调零。

抗氧化物活性测定方法总结

抗氧化物活性测定方法（倾向于考虑DPPH法和ORAC法）1.FRAP法:铁离子还原抗氧化能力测定法[1]FRAP(ferric ion reducing antioxidant power)方法，在低pH值的溶液中，Fe3+-TPTz(Fe3+-三吡啶三嗪)被抗氧化剂还原成有色的Fe2+-TPTZ。

反应的结果常以Fe2+当量或标准物质的抗氧化能力表示。

该法快速简便、易于操作、重复性好，但FRAP反应属于电子转移(SET)反应，因此FRAP方法不能够测定氢转移反应(HAT)起作用的物质。

而且该法实际测定的是待测生物活性物质将Fe3+还原为Fe2+的能力，因此没有抗氧化能力的生物学相关性。

2.TEAC法(trolox equivalent antioxidant capacity)ABTS(2,2'-amino-di(2-ethyl-benzothiazoline sulphonic acid-6)ammonium salt,2,2'氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐)与过氧化物酶和氢过氧化物在一起形成ABTS+阳离子自由基。

在抗氧化剂存在时，这种自由基混合物的光吸收值下降，下降程度取决于抗氧化剂的抗氧化能力，测得的结果以TEAC表示，即被测抗氧化剂清除ABTS·+的能力(吸光度大小的变化)与标准抗氧化剂trolox(VE的水溶性类似物)清除ABTS·+的能力的比值。

TEAC法十分简单，适用于大量样品的分析检测。

但是，ABTS·+并非生理自由基，缺乏生理相关性，而且与FRAP方法相似，ABTS·+与不同抗氧化剂问的氧化反应时间不同，因此，只能定性不能定量评价样品的抗氧化能力。

3.DPPH法[2，3](2，2-diphenyt-l-picrylhydrazyl radical scavenging capacity)DPPH·(二苯代苦味肼基自由基)法是较常用的方法之一。

总抗氧化能力测定(FRAP法)

精品文档小麦叶片总抗氧化能力测定（FRAP法）一、实验原理FRAP法测定总抗氧化能力的原理是酸性条件下抗氧化物可以还原Ferric-tri-pyridyl-tria-zine（Fe 3+-TPTZ）产生蓝色的 Fe2+-TPTZ,随后在 593nm测定蓝色的Fe2+-TPTZ即可获得样品中的总抗氧化能力。

由于反应在酸性条件下进行，可以抑制内源性的一些干扰因素。

并且由于血浆等样品中的铁离子或亚铁离子的总浓度通常低于10側，因此血浆等样品中的铁离子或亚铁离子不会显著干扰FRAP法的检测反应。

由于反应体系中的铁离子或亚铁离子是和TPTZ螯合的，样品本身含有的少量金属离子螯合剂通常也不会显著影响检测反应。

AntioxidantFe3+-TPTZ （橘黄色）---------- >Fe2+-TPTZ （蓝色）二、实验步骤1. FRAPT作液配制：0.3 M pH 3.6醋酸缓冲液：0.364g无水醋酸钠+3.2mL冰乙酸定容至200mL 用1M HCl调节pH至3.6 ;10mmol/L TPTZ溶液25mL 0.078g TPTZ 用40mM盐酸溶液定容至25mL 20mmol/L FeCl3溶液 50mL 2.78g 用 RO水定容至 50mL上述溶液以 10:1:1 的比例混合（现配现用）。

2. 取叶片0.1g，加入2.5mL蒸馏水研磨稍沉淀后取 1.5mL 12000g离心10min（4°C）,取上清液。

3. 在反应管中加入100uL上清液，再加入2.4mL工作液，37°C条件下水浴10min, 于593nm处测定吸光度，4. 标准曲线绘制：以0.1-1.6mmol/L的FeSQ的标准液替代样品绘制标准曲线。

三、结果计算以1.0mmol/L的FeSQ为标准，样品抗氧化活性以达到同样吸光度值为一个FRAP fi，计算结果。

精品文档2.8.2. Ferric Reducing/Antioxidant Power (FRAP) assayBriefly, the FRAP reagent contained 2.5 mL 10 mM L_1TPTZ solution in 40 mM L1HCI plus 2.5 mL 20 mM L1 FeCI^ and 25 mL 0+3 M L1acetate buffer, pH 3*6 was prepared freshly and warmed at 37°C・After addition of root ethanol extracts (prepared as in section 2.7) and incubation at 37°Cfor 5 min, absorbance of the reaction mixture was measured at 593 nm. The final result was expressed as the concentration of antioxidants having a ferric reducing ability equivalent to that of 1 mM L_1 FeSO4based on the standard curve for FeSO4 x 7H.0 at a concentration range between 100 and 1000 pM L_1 [3 口[1] Benzie I F F, Strain J J. The Ferric Reducing Ability of Plasma (FRAP) as aMeasure of “ntioxidant Power”： The FRAP Assay[J]. Analytical Biochemistry, 1996, 239(1):70-6.[2] Katarz yna Szafra nska, Rafa? Szewczyk, Kryst yna Maria Jan as. In volveme nt ofmelat onin applied to Vig na radiata, L. seeds in pla nt resp onse to chilli ng stress[J].Central European Journal of Biology, 2014, 9(11):1117-1126.精品文档欢迎您的下载，资料仅供参考!致力为企业和个人提供合同协议，策划案计划书，学习资料等打造全网一站式需求。

FRAP法测定大枣枣皮红色素的总抗氧化能力_赵文恩

1.1 主要仪器和试剂 721分光光度计 , 上海精密科学仪器有限公
司 ;RE-52AA旋转蒸发器 , 上海亚荣生化仪器厂 ;501型超级恒温水浴 , 上海浦东荣丰科技仪器有限公司 ;SHZ-D循环水式真空泵 , 巩义市予华仪器有限责任公司 ;PHS3 -3C型精密酸度计 , 上海大普仪器有限公司 .
的碱水提取效果极浅黄色橙黄色深枣红色
0.2mol/L 的酸水
浅黄色
蒸馏水黄色
采用 FRAP法测定不同溶剂提取的枣皮红色素粗提物的抗氧化能力 , 结果如图 2所示 , 抗氧化能力由高到低为 :0.8%NaOH粗提物 >50%乙醇粗提物 >蒸馏水粗提物 >0.2 mol/LHCl粗提取 >乙酸乙酯粗提物 .结果表明对于抗氧化活性物质的提取 ,碱性水溶液效果最好 , 乙酸乙酯最差 , 并且这一结果与枣皮红色素的提取效果是一致的 , 说明枣皮红色素中含有抗氧化活性成分 , 并且枣皮红色素含量与抗氧化活性存在一定的相关性 .
同样 , 按照上述方法 , 以 0.1 ～ 1.6 mmol/L的 FeSO4 的标准溶液代替样品绘制标准曲线 .
2 结果与讨论
2.1 FeSO4 标准曲线的绘制图 1为 FeSO4 标准曲线 , 由图 1可知 , FeSO4
浓度在 0.1 ～ 1.6 mmol/L范围内与其在 593 nm 处的吸光度成良好线性关系 .直线方程为 :Y= 0.003 55 +0.303 71X;Y为 593 nm处的吸光度 , X 为 FeSO4 浓度 , mmol/L;相关系数 R2 =0.999 6. 因此以 593 nm处的吸光值换算成 FeSO4 当量浓度是可行的 , 如果需要 , 允许个别测定点的 FRAP 值不在线性范围内 [ 6] .即样品最终的总抗氧化能力以硫酸亚铁的当量浓度表示 , 单位为 mmol/L.

抗氧化测定方法流程

一DPPH自由基清除能力仪器及药品：酶标仪、紫外-可见分光光度计、甲醇、DPPH等DPPH 即1，1-二苯基-2-苦肼基自由基，是一种稳定的自由基，其甲醇溶液呈紫色，并在517 nm处有强吸收。

参考Braca et al. (2001)的方法进行测量。

取0.1 ml样品，加入3 ml 0.004％DPPH 甲醇溶液（质量分数）。

（0.02g溶于500ml甲醇溶液。

）混合均匀后，静置30 min后在517 nm处测定吸光值。

抑制率采用公式[(A0－A1)/A0] · 100计算，其中A0（加0.1ml甲醇和3mlDPPH甲醇溶液）为加入样品前的吸光值，A1 为加入样品后的吸光值。

（空白样采用甲醇。

用甲醇溶液调零。

）配置各个级分不同浓度的甲醇溶液，浓度范围可以先做预实验，大致在1mg-1000mg/l 之间：测定吸光值计算DPPH自由基清除率，绘制吸收曲线，找出其IC50二FRAP法测定抗氧化能力药品：醋酸纳、醋酸、三吡啶基均三嗪（2,4,6-Tripyridyl-s-triazine，TPTZ）、盐酸、FeCl3·6H2O、维生素C（L-Ascorbic Acid）（1）300mmol/L的醋酸盐缓冲液（pH=3.6）：3.1g C2H3NaO2·3H2O ＋16mL C2H4O2 溶于1L容量瓶中定容。

（或着是1.869g醋酸钠）（2）10mmol/L三吡啶基均三嗪（2,4,6-Tripyridyl-s-triazine，TPTZ，分子量312.33）溶于40mmol/L HCl中：称取0.312g三吡啶基均三嗪溶于50ml小烧杯中，加入0.34ml浓HCl（约11.7mol/l）搅拌均匀，然后定容到100ml容量瓶中。

（3）20mmol/L FeCl3·6H2O溶液，称取2.703gFeCl3·6H2O溶解于200ml蒸馏水中，然后定容到500ml容量瓶中FRAP试剂：25mL 醋酸盐缓冲液＋ 2.5mL TPTZ溶液＋ 2.5mL FeCl3·6H2O溶液（10:1:1）标准样：0.1-1mmol/L的维生素C（L-Ascorbic Acid）溶液FRAP分析步骤：取0.1 ml 样品放入10ml试管中，加入新鲜的FRAP试剂3.0 ml，然后置于25℃恒温水浴中，5 min后用紫外分光光度计在波长为593 nm处测吸光值，（空白样采用去离子水。

DPPH、ABTS和FRAP微量法测定山奈酚的抗氧化能力

为 y = 11. 4156x+0. 1717, 相关系数 R2 = 0. 9945。
2. 1. 2 山奈酚对 DPPH·清除能力
称取适量山奈酚, 加入无水乙醇配制成浓度为 160 μmol / L
的溶液, 后用无水乙醇稀释成浓度梯度为 160、 80、 40、 20、
10、 5、 2. 5 μmol / L 的溶液。精密吸取梯度样品溶液 100 μL 和
to evaluate the scavenging ability of Kaempferol against DPPH free radical and ABTS free radical. The antioxidant activity
of Kaempferol was evaluated by measuring a micro - model of FRAP. The scavenges DPPH and ABTS free radicals of
∗
第 49 卷第 3 期
59
王荣, 等: DPPH、 ABTS 和 FRAP 微量法测定山奈酚的抗氧化能力
Hale Waihona Puke 2 方法与结果2. 1 DPPH·清除能力的测定
2. 1. 1 DPPH·标准曲线的绘制
避光称取 DPPH 粉末 82 mg, 无水乙醇定容于 50 mL 量瓶
中, 得 1. 64 mg / mL 的 DPPH 母液。以无水乙醇为溶剂将上述母
Kaempferol increased with the increase of the concentration. IC50 of the scavenge DPPH and ABTS free radicals were

FRAP

分光光度计测：40mmol/L盐酸溶液：取浓盐酸(12mol/L)0.1ml加水至30ml，置于避光处，备用。

，用蒸馏水定容至50ml，置于避光处，备三氯化铁溶液：称取0.1625g的FeCl3用。

0.3mol/L醋酸钠缓冲溶液：称取醋酸钠5.1g，加冰醋酸20ml，用水稀释定容至250ml，置于避光处，备用。

10mmol/L TPTZ溶液：称取TPTZ样品31．233mg，用40mmol/L的盐酸定容至10ml，置于冰箱中冷藏备用。

(2)番茄乙醇提取物总抗氧化能力的测定FRAP法Fe3+吡啶三吖嗪可被样品中还原物质还原为二价铁形式，呈现出蓝色，并于593nm处具有最大光吸收，根据吸光度大小计算样品抗氧化活性的强弱。

取0.3ml样品，加2.7ml预热至37o C的FRAP工作液，摇匀后放置10min，于593nm 测其吸光度值(A值)。

样品分别作10倍、20倍、40倍稀释，做三个稀释度(用无水乙醇作为参比)，以无水乙醇代替样品加入FRAP工作液作为空白，每个稀释度做3次平行试验，求平均值。

根据反应后A值，在标准曲线上求得相应FeSO4的浓度(μmol/L)，定义为FRAP值。

FRAP值越大，抗氧化活性越强。

标准曲线的绘制：准确称取6．08mg硫酸亚铁溶于适量的水中，加入FeSO418mol/L的硫酸0.25ml，再加水稀释至50ml定容，并置入小铁钉。

取上述溶液标准溶液。

预先用小试5ml于5ml的水，定容至50ml，即为800μmol/L FeSO4(800μmol/L)标准溶液加入试管中，配制得400μmol/L 管装5ml水，取5mlFeSO4标准溶液，按此方法依次进行，配制200μmol/L、100μmol/L。

50μmol/L、25μmol/L标准溶液，绘制标准曲线(图1)，得回归方程为：Y=0．0023X+0．191，R2=0．9996。

[4]Benzie IFF，Strain J．The ferric reducing ability of plasma(FRAP)asa measure of“antioxidant power”：the FRAP assay．Analytical Biochemistry，1996，239(3)：70-76．参照Benzie etal.(1996)的方法，原理为Fe3+-三吡啶三吖嗪(TPTZ，sigma)可被样品中还原物质还原为二价铁形式，呈现出蓝色，并于593nm处具有最大光吸收，根据吸光度大小计算样品抗氧化活性的强弱。

抗氧化性测定方法

抗氧化性测定方法
抗氧化性测定方法是一种用于测试物质对氧气自由基、过氧化物和其他氧化性物质的抵抗能力的方法。

以下是常见的抗氧化性测定方法：
1. DPPH自由基清除法：使用一种紫色自由基DPPH，通过测定反应前后DPPH 吸收峰的差异来评估样品的自由基清除能力。

2. ABTS自由基清除法：使用一种蓝色自由基ABTS，通过ABTS的光谱变化来衡量样品对自由基的清除能力。

3. ORAC法：利用ORAC反应器测量被测样品对氧化过程中产生的自由基的清除能力。

4. FRAP法：利用FRAP反应器测量被测样品对铁离子的还原能力。

5. TAC法：通过测量总抗氧化能力评价样品的抗氧化能力。

6. 超氧化物歧化酶(SOD)活力测定法：利用SOD对超氧化物的清除作用来评估物质的抗氧化能力。

以上方法中，DPPH和ABTS自由基清除法是较常用的评估抗氧化性的方法。

抗氧化性是很多食品和保健品评估其品质和功效的重要指标，因此，准确测定物质
的抗氧化性对于推广新产品、提高产品质量和开发功能性食品有着重要意义。

抗氧化性测定方法

抗氧化性测定方法1.1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）法这是一种广泛应用的测定方法。

DPPH是一种深紫色的自由基，在接触到具有抗氧化能力的物质后会发生漂白反应。

在测定中，样品与DPPH 一起加入观察和记录，在吸收强度的变化可以反映出物质的抗氧化能力。

2.金属还原力抗氧化活性法（FRAP法）FRAP法基于物质的还原能力，测定物质对铁（Fe3+）的还原能力。

在该方法中，加入已知浓度的Fe3+溶液，并随着物质还原能力的增强，Fe3+逐渐被还原成可溶性Fe2+。

通过检测Fe2+的浓度变化，可以评估样品的抗氧化能力。

3.缩合亚硝酸盐法（NBT法）NBT法利用物质对亚硝酸盐的还原能力来测定其抗氧化能力。

NBT是一种黄色水溶性化合物，在接触到自由基后会转变为蓝色NBT还原物。

通过测定蓝色NBT还原物的吸光度，可以评估样品的抗氧化能力。

4.过氧化物过氧化物是一类非常有活性且具有氧化性的分子，在测定中被用作产生自由基的刺激源。

通过观察或测定样品与过氧化物产生的氧化反应，可以评估样品的抗氧化能力。

5.水溶性抗氧化能力（ORAC）法ORAC法是一种相对来说较复杂但更接近生物体内抗氧化能力的测定方法。

通过测定物质与自由基的竞争反应，以及维持反应平衡的时间，可以评估样品的抗氧化能力。

6.单线态氧发射（SOS）法SOS法是一种测定样品对单线态氧（1O2）的能力的方法。

在该方法中，通过检测样品对单线态氧的发射能力，评估其对自由基氧化损伤的能力。

在实际应用中，可以根据需要选择适当的抗氧化性测定方法，或者使用多种方法综合评估样品的抗氧化能力。

除了上述几种方法，还有其他一些方法如总抗氧化能力（TAC）法和细胞抗氧化测试（CAT）等方法也可以用于抗氧化性测定。

总抗氧化能力测定(FRAP法)

小麦叶片总抗氧化能力测定（FRAP法）一、实验原理FRAP法测定总抗氧化能力的原理是酸性条件下抗氧化物可以还原Ferric-tri-pyridyl-tria-zine(Fe3+-TPTZ)产生蓝色的Fe2+-TPTZ，随后在593nm测定蓝色的Fe2+-TPTZ即可获得样品中的总抗氧化能力。

由于反应在酸性条件下进行，可以抑制内源性的一些干扰因素。

并且由于血浆等样品中的铁离子或亚铁离子的总浓度通常低于10μM，因此血浆等样品中的铁离子或亚铁离子不会显著干扰FRAP法的检测反应。

由于反应体系中的铁离子或亚铁离子是和TPTZ螯合的，样品本身含有的少量金属离子螯合剂通常也不会显著影响检测反应。

AntioxidantFe3+-TPTZ（橘黄色）——————> Fe2+-TPTZ (蓝色)二、实验步骤1.FRAP工作液配制：0.3 M pH 3.6 醋酸缓冲液：0.364g无水醋酸钠+3.2mL冰乙酸定容至200mL，用1M HCl调节pH至3.6；10mmol/L TPTZ溶液25mL：0.078g TPTZ用40mM 盐酸溶液定容至25mL；20mmol/L FeCl溶液50mL：2.78g用RO水定容至50mL；3上述溶液以10:1:1的比例混合（现配现用）。

2.取叶片0.1g，加入2.5mL蒸馏水研磨稍沉淀后取1.5mL 12000g离心10min（4o C），取上清液。

3.在反应管中加入100uL上清液，再加入2.4mL工作液，37o C条件下水浴10min，于593nm处测定吸光度，4.标准曲线绘制：以0.1-1.6mmol/L的FeSO的标准液替代样品绘制标准曲线。

4三、结果计算以1.0mmol/L的FeSO为标准，样品抗氧化活性以达到同样吸光度值为一个4FRAP值，计算结果。

[1]Benzie I F F, Strain J J. The Ferric Reducing Ability of Plasma (FRAP) as a Measure of “Antioxidant Power”: The FRAP Assay[J]. Analytical Biochemistry, 1996, 239(1):70-6.[2]Katarzyna Szafrańska, Rafał Szewczyk, Krystyna Maria Janas. Involvement of melatonin applied to Vigna radiata, L. seeds in plant response to chilling stress[J]. Central European Journal of Biology, 2014, 9(11):1117-1126.。

farp抗氧化标准曲线y=

farp抗氧化标准曲线y=
FRAP抗氧化标准曲线的y值是通过测量一系列不同浓度的FeSO4的吸光度得到的。

这个过程包括，首先，吸取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mmol/L的FeSO4标准液，然后加入3ml FRAP工作液和0.3ml 超纯水，混匀后准确反应5min。

然后在593nm处测定其吸光度，并用超纯水调零。

通过这些步骤，就可以得到一个浓度-吸光值曲线，该曲线的数学模型通常为y=3.9242x-0.0006。

总抗氧化能力是以从标准曲线上获得的抗氧化剂Trolox的量来表示样本的总抗氧化能力。

计算公式如下： y = 2.4832x + 0.0134, R2 = 0.9996。

这里的x代表的是Trolox的浓度(μmol/mL)，y代表的是吸光值差值A。

这个公式可以用来计算样本的总抗氧化能力，根据需要，可以按样本质量或样本蛋白浓度来计算。

总抗氧化能力测定FRAP法

小麦叶片总抗氧化能力测定（ F R A P 法）一、实验原理FRAP 法测定总抗氧化能力的原理是酸性条件下抗氧化物可以还原Ferric-tri-pyridyl-tria-zine（Fe 3+-TPTZ）产生蓝色的Fe2+-TPTZ,随后在593nm测定蓝色的Fe2+-TPTZ即可获得样品中的总抗氧化能力。

由于反应在酸性条件下进行，可以抑制内源性的一些干扰因素。

并且由于血浆等样品中的铁离子或亚铁离子的总浓度通常低于10 yM,因此血浆等样品中的铁离子或亚铁离子不会显着干扰FRAP法的检测反应。

由于反应体系中的铁离子或亚铁离子是和TPTZ螯合的，样品本身含有的少量金属离子螯合剂通常也不会显着影响检测反应。

AntioxidantFe3+-TPTZ （橘黄色） ------------- > Fe2+-TPTZ （蓝色）二、实验步骤1.FRAP工作液配制：0.3 MpH3.6醋酸缓冲液：0.364g无水醋酸钠+3.2mL冰乙酸定容至200mL用1MHCI 调节pH至3.6 ;10mmol/L TPTZ溶液25mL 0.078g TPTZ 用40mM盐酸溶液定容至25mL20mmol/L FeCh溶液50mL 2.78g 用RO水定容至50mL上述溶液以10:1:1 的比例混合（现配现用）。

2.取叶片0.1g，加入2.5mL蒸馏水研磨稍沉淀后取1.5mL 12000g离心10min （4o C）,取上清液。

3.在反应管中加入100uL上清液，再加入2.4mL工作液，37°C条件下水浴10min,于593nm 处测定吸光度，4.标准曲线绘制：以0.1-1.6mmol/L的FeSO的标准液替代样品绘制标准曲线。

三、结果计算以1.0mmol/L的FeSQ为标准，样品抗氧化活性以达到同样吸光度值为一个FRAP fi,计算结果Z82 Ferric Reducmg/Antioxidant Power (FRAP) assay Briefly, the FRAP reagent contained 2.5 mL 10 mM L1 TPTZ solution in 40 mlVI L1 HGI plus 2,5 mL 20 mM L1 FeCI3 and 25 mL 0.3 M L1acetate buffer, pH 3.6 was prepared freshly and warmed at 37c C. After addition of root ethanol extracts (prepared as in section 2.7) and incub^tion at 37°C for5 absorbanee of the reactionmixture was measured at 593 nm. The final result was expressed as the concentration of antioxidants having a ferric reducing ability equivalent to that of 1 mM L_1 FeSO4 based on the standard curve for FeSO4 x 7H2O at a concentration range between 100 and 1000 uM L_1[31].[1]Be nzie IF F, Strain J J. The Ferric Reduci ng Ability of Plasma (FRAP) as a Measure of “ An tioxida ntPower” ： The FRAP Assay[J]. Analytical Biochemistry, 1996, 239(1):70 -6.[2]Katarz yna Szafra n ska, Rafa? Szewczyk, Krysty na Maria Jan as. In volveme nt of melato nin applied toVigna radiata, L. seeds in pla nt resp onse to chilli ng stress[J]. Cen tral Europea n Jour nal of Biology, 2014,9(11):1117-1126.。