重组巴斯德毕赤酵母高密度培养中铵离子浓度的影响

V o l .30N o.62004212

华　东　理　工　大　学　学　报

Journal of East Ch ina U niversity of Science and T echno logy

基金项目:教育部科学技术研究重点项目(99166);上海市重点学科基金

E -ma il :qye @ecust .edu

.cn

收稿日期:2003212208

作者简介:谢静莉(19742),女,江苏南京人,博士研究生,研究方向为

发酵工程。

研究简报

文章编号:100623080(2004)0620723204

重组巴斯德毕赤酵母高密度培养中铵离子浓度的影响

谢静莉1,　周庆玮2,　杜　鹏2,　甘人宝2,　叶　勤13

(1.华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海200237;

2.中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所,上海200031)

摘要:采用M u t S 表型的重组毕赤酵母生产血管生长抑制素,表达阶段流加甘油2甲醇混合碳源以提高菌体密度和血管生长抑制素的表达水平,菌体密度可达174g L ,约是表达阶段采用甲醇为单一碳源的发酵过程的3倍。菌体密度的提高导致表达阶段发酵液中铵离子浓度下降很快,当发酵液中的铵离子浓度低至40mm o l L 时,影响了血管生长抑制素的表达。改变pH 调节方式并在发酵后期添加25mm o l L (N H 4)2SO 4使发酵液中铵离子浓度维持在150mm o l L 以上,血管生长抑制素的表达产量达到108m g L 。

关键词:巴斯德毕赤酵母;血管生长抑制素;发酵;铵离子浓度中图分类号:TQ 920.6文献标识码:A

Effect of Amm on iu m Concen tration on the Expression of Ang iostati n i n H igh Cell D en sity Culture of Recom bi nan t P ich ia p astoris

X IE J ing 2li 1

,　ZH OU Q ing 2w ei 2

,　DU P eng 2

,　GA N R en 2bao 2

,　Y E Q in

13

(1.S ta te K ey L abora tory of B ioreactor E ng ineering ECU S T ,S hang ha i 200237,Ch ina ;2.Institu te of B ioche m istry and Cell B iology ,S hang ha i Institu te of B iolog ica l S cience ,

Ch inese A cad e m y of S cience ,S hang ha i 200031,Ch ina )

Abstract :In fed 2batch cu ltivati on of recom b inan t P ich ia p astoris (M u t S

pheno type ),feeding w ith

glycero l and m ethano l w as conducted du ring the exp ressi on phase to enhance the cell grow th and angi o 2statin exp ressi on .T he cell den sity reached 174g L at the end of fer m en tati on ,w h ich w as abou t 3fo ld of that ob tained w ith m ethano l as the so le carbon sou rce in the inducti on phase .H igh cell den sity resu lted in a qu ick drop of amm on ium concen trati on in the fer m en tati on b ro th ,and w hen the amm on ium concen trati on w as below 40mm o l L ,the p roducti on of angi o statin also decreased .T he change of pH con tro l strategy and additi on of 25mm o l L (N H 4)2SO 4w ere app lied to release the effect cau sed by low amm on ium concen 2trati on .T he amm on ium concen trati on w as m ain tained above 150mm o l L in the inducti on p hase ,and 108m g L angi o statin w as ach ieved at the end of fer m en tati on .

Key words :P ich ia p astoris ;angi o statin ;fer m en tati on ;amm on ium concen trati on

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血浆纤维蛋白溶酶原片段,通过抑制毛细血管内皮细胞的移行和增殖,阻断新生毛细血管的形成而达到阻断肿瘤细胞转移通路、萎缩肿瘤的治疗目的[1],是较为看好的抗癌新药。采用巴斯德毕赤酶母(P ich ia p astoris)表达重组人血管生长抑制素时,由于M u t S表型的重组毕赤酵母利用甲醇能力弱,诱导阶段以甲醇为唯一碳源时生长缓慢,血管生长抑制素的产量低,同时高浓度的铵离子(高于100 mm o l L)对菌体生长有明显的抑制作用[2]。为提高菌体密度和血管生长抑制素产量,在表达阶段采用流加混合碳源的方式,菌体浓度较以甲醇为诱导剂和唯一碳源时有很大提高,在发酵中后期,发酵液中较低的铵离子浓度对血管生长抑制素的表达产生了明显影响。本文报道诱导阶段采用甘油2甲醇混合碳源的发酵过程中铵离子浓度对血管生长抑制素表达的影响。

1　材料与方法

1.1　菌种和培养基

重组毕赤酵母菌由中科院上海生物化学研究所甘人宝课题组构建[3],具有H is4+M u t S表型。

1L种子培养基(BM GY)含:YNB(D ifco,美国)13.4g,甘油10mL,生物素0.4m g,1m o l L pH6.0磷酸缓冲溶液100mL,酵母提取物(O x i od,英国)10g,酪蛋白胨(Po lyp ep ton,日本制药株式会社,日本)20g。1L发酵培养基(B S M)含:w=0.85磷酸26.7mL,CaSO40.93g,K2SO418.2g,M gSO4・7H2O14.9g,KOH4.13g,甘油40g,PTM1溶液4.35mL,w=0.28氨水调节pH至5.0。1L PTM1溶液含:CuSO46.0g,K I0.8g,M nSO43.0g, N a2M oO40.2g,H3BO30.2g,CoC l20.5g,ZnC l2 20.0g,FeSO4・7H2O65.0g,生物素0.2g,硫酸5mL。所用试剂除已标注者均为国产分析纯。

1.2　培养方法

一级种子:将菌种冷冻甘油悬液融化后,接0.7 mL于装有25mL种子培养基的250mL摇瓶中, 30°C旋转摇床250r m in培养14h。

二级种子:将一级种子接种于3个分别装有50 mL种子培养基的500mL摇瓶中,30°C旋转摇床250r m in培养7h。

发酵:5L发酵罐装2.5L发酵培养基,接种量7%,温度30°C,pH5.0,通气量4L m in,DO不低于20%。甘油耗尽后,饥饿0.5h开始流加500g L g L左右时饥饿0.5h后,开始诱导重组血管生长抑制素表达,流加甲醇(每升加12mL PTM1溶液),同时流加500g L甘油(每升加12mL PTM1溶液),甘油流加速率调节参见文献[4]。发酵开始至表达开始采用5m o l L KOH调节pH,此后至发酵结束采用123g L氨水调节pH。发酵过程由国家生化工程技术研究中心(上海)开发的发酵罐控制系统Top haw k软件进行控制和数据采集。

1.3　甲醇在线检测与控制

采用甲醇检测及控制系统进行发酵液中甲醇浓度的在线测定,并对甲醇的流加进行反馈控制。甲醇检测控制系统包括甲醇采样器、检测器和FC2180B 型甲醇浓度监控仪3个部分[5],由生物工程学院李凡超研制提供。发酵过程中表达阶段的甲醇浓度控制在5g L。

1.4　测定方法

菌体浓度测定采用浊度法,发酵液经稀释后于波长600nm测光密度(OD600)。菌体干重与OD600的关系为1OD600单位相当于0.36g L。血管生长抑制素的测定采用EL ISA方法[3]。铵离子浓度采用B erthelo t比色法[6]检测。

2　结果与讨论

2.1　诱导阶段采用混合碳源的发酵

张励等发现,重组毕赤酵母在诱导阶段,以甲醇为诱导剂和唯一碳源表达血管生长抑制素时,过高的铵离子浓度(高于100mm o l L)抑制菌体的生长,当在发酵过程中采用2m o l L KOH取代123g L氨水调节pH,使发酵液中铵离子浓度不高于100 mm o l L,菌体达到60g L,血管生长抑制素的表达量提高至20m g L[2]。为了改善菌体的生长,诱导阶段采用流加甲醇2甘油混合碳源,最终菌体浓度可达174g L(图1),是以甲醇为诱导剂和唯一碳源时的3倍。图1所示发酵过程中,发酵27.5h开始诱导表达,表达43h(全发酵时间为70.5h),发酵液中血管生长抑制素浓度达68m g L,同时,发酵液中铵离子浓度从开始诱导表达时的200mm o l L下降到40 mm o l L;此后至发酵结束,铵离子浓度一直低于40 mm o l L,虽然菌体能维持一定生长,但血管生长抑制素浓度呈下降趋势。诱导阶段采用流加混合碳源的方法后,由于菌体生长有很大改善,铵离子的消耗大大增加,从发酵的70.5h至发酵结束,发酵液中铵离子浓度较低,虽然对菌体的生长影响不大,但血

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