重组巴斯德毕赤酵母高密度培养中铵离子浓度的影响
毕赤酵母的培养基1
毕赤酵母的培养巴斯德毕赤酵母是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌。
与其它酵母一样，在无性生长期主要以单倍体形式存在，当环境营养限制时，常诱导2个生理类型不同的接合型单倍体细胞交配，融合成双倍体。
比赤酵母表达常用的培养基：1 LB培养基胰蛋白胨1% 酵母粉0.5% 氯化钠1% PH 7.0----------------大肠杆菌培养制作平板加入2%的琼脂粉，121摄氏度20分钟，可于室温保存。
用于培养pPICZ αA 原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin 25ug / mL（博来霉素，抗菌素）宿主细胞His- -----------诱变造成的。
MD------------酵母转化筛选培养基（营养缺陷型His-）13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖用于表达的毕赤酵母都属于组氨酸缺陷型的只有染色体上成功整合入重组质粒载体基因的毕赤酵母菌株才能在组氨酸缺失的MD培养基生长，以此筛选出重组子。
MM--------------酵母转化进一步筛选培养基仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，成为基本培养基（minimal medium,MM），有时用符号“[ －]”来表示。
不同微生物的基本培养基是不相同的。
2 LLB 培养基胰蛋白胨1% 酵母粉0.5% 氯化钠0.5%PH 7.0制作平板时加入2％琼脂粉。
121℃高压灭菌20min。
可于室温保存数月。
用于培养pPICZ αA 原核宿主菌TOP10F’时，加入Zeocin 25ug / ml，可以4℃条件下保存1～2 周.3 YPD培养基酵母粉1%，胰蛋白胨2%，葡萄糖2%，固体加2%的琼脂粉，YPD 培养基可常温保存,是毕赤酵母的最基本培养基，琼脂YPD 平板在4℃可保存几个月。
加入Zeocin 100ug / ml，成为YPDZ 培养基，可以4℃条件下保存1～2 周。
4 BMGY培养基酵母粉1% 蛋白胨2%，磷酸钾缓冲溶液平PH 6 100mmol/L YNB（酵母氮源）1.34% 生物素（4×10 -5）%甘油1%，毕赤酵母诱导表达前培养基，YNB和Biotin过滤除菌。
毕赤酵母工程菌高密度发酵的研究进展_夏姗
毕赤酵母工程菌高密度发酵的研究进展夏姗1,2，武福军2,3，赵洪亮2，薛冲2，刘志敏21.安徽大学生命科学学院，安徽合肥230039；2.军事医学科学院生物工程研究所，北京100071；3.山西康宝生物制品股份有限公司，山西长治046000［摘要］近年来毕赤酵母已成为一种优越的异源蛋白表达系统。
而提高目的蛋白的表达水平，高密度发酵已成为关键技术环节之一。
我们从毕赤酵母工程菌的选择、培养基的优化设计，以及发酵工程过程控制等方面简要阐述毕赤酵母的高密度发酵，并提出了工程菌在高密度发酵过程中存在的问题。
［关键词］毕赤酵母工程菌；高密度发酵；培养基优化；发酵过程控制［中图分类号］Q78［文献标识码］A［文章编号］1009-0002（2013）01-0109-04Progess of Pichia pastoris Engineering Bacteria on High-Density Fer⁃mentationXIA Shan 1,2,WU Fu-Jun 2,3,ZHAO Hong-Liang 2,XUE Chong 2,LIU Zhi-Min 2*1.School of Life Science,Anhui Uniservity,Hefei 230039;2.Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100850;3.Shanxi Kangbao Biological Product Co.Ltd,Changzhi 046000;China*Corresponding author,E-mail:liuzhm@［Abstract ］Pichia pastoris has been utilized widely as an excellent heterologous gene expression system recently.High-density fermentation has been a key technique tache to improve the expression level of the protein of inter ⁃est.In this paper,we expounded the choose of engineering bacteria,designation and optimization of culture medi ⁃um,and control of fermentation course to increase P.pastoris on high-density fermentation.Moreover,the questionsexisting in industry high-density fermentation were put forward.［Key words ］Pichia pastoris ;high-density fermentation;optimization of culture medium;control of fermentationcourse综述doi:10.3969/j.issn.1009-0002.2013.01.02620世纪80年代以来，随着生物技术药物在人类疾病治疗和预防中的广泛应用，大大加速了微生物细胞表达产品的产业化进程。
Pichia pastoris表达论文
重组人血清白蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达摘要人血清白蛋白是一种在医学上应用广泛，需求量大的蛋白质药物。
而目前血浆提取生产的方式难以满足市场的要求，用基因工程方法生产人血清白蛋白无疑具有巨大的商业价值。
由于巴斯德毕赤酵母表达系统自身的许多优点，使得其在表达外源蛋白中具有十分大的优势。
本文的工作是用巴斯德毕赤酵母（Pichia Pastoris）构建并筛选分泌重组人血清白蛋白(rHSA)基因工程高产菌株，并对其发酵纯化条件进行初步研究。
在构建高产人血清白蛋白的基因工程菌时，采用了分泌型表达质粒pPIC9K构建成质粒pPIC9K-hsa。
构建的质粒经线性化后电转化整合进入毕赤酵母GS115染色体AOX1基因中，通过MD/MM平板筛选出his+Mut s型菌株。
在此基础上，用G418平板筛选出高拷贝表达子。
BMGY/BMMY摇瓶培养对不同的拷贝子进行筛选，发现随着拷贝子的增加表达量增加。
其中菌株GS115-rHSA-8表达量最高。
免疫印迹检测所表达的rHSA具有免疫原性。
采用工业基础盐培养基，用摇瓶对发酵条件进行了实验研究。
结果表明，组氨酸的加入量为0.15g/L时，蛋白表达量增加57.1%；加入0.10%体积比油酸时，蛋白量可增加43.4%；甲醇浓度控制在0.5％体积比左右时可以获得高产量，甲醇的加量超过1%体积比时，会对蛋白的分泌表达产生抑制，在2%时已经比较明显；甲醇诱导时添加甘油时可以提高产量，但当甘油添加量达到0.2%体积比时甘油已产生抑制表达作用；诱导表达时硫酸铵浓度为7g/L时蛋白浓度最高，高于9g/L时已开始出现抑制表达作用；改变培养时发酵液的pH为7.0，诱导表达时添加 1.5%的YP(Yeast extract,5g/L; Peptone, 10g/L)均可以有效的控制rHSA的降解，而温度对蛋白的降解没有显著性影响。
另外，添加100μm的PMSF也对降解有较好的控制作用，但因为毒性原因其安全性值得评价。
毕赤酵母工程菌高密度发酵中氨态氮含量的测定
微 生物 学杂 志 ２０ 年 １ 月第 ２ 卷第６期 Ｊ Ｕ Ｎ Ｌ ＦＭ Ｃ Ｏ ＩＬ Ｇ ｏ． ０８Ｖ １ ８Ｎ ． ０８ １ ８ Ｏ Ｒ Ａ ＩＲ ＢＯ Ｏ ＹＮｖ ２０ ｏ ２ ｏ Ｏ ． ６
毕 赤 酵 母 工 程茵 高密 度 发酵 中氨 态 氮 含量 的测 定
１ ｇ Ｌ的 范 围 内， 关性 好 （ ． ９ ） 精 确 度 （ Ｓ ０ｍ／ 相 ｒ ＝０ ９ ６ ５ ， Ｒ Ｄ＝２ １ ％ ～５ ３ ％ ） 精 密度 （ ｒｃ ｉｎ＝ ７ ～ ．４ ．２ 和 Ｐｅｉｏ ９ ％ ｓ １５ ） ， ０ ％ 高 更适 合 于 毕 赤 酵 母 发 酵 中氨 态 氮 含 量 的 检 测 。 并 对 其 检 测 条 件 进 行 优 化 ， 定 检 测 波 长 为 确
ｓ ｉ ｂｅｆｒｄ ｔｒ ｎｎ ｍｍｏ ｉ ｎｔ ｇｎ ｉ ｅｍｅ ｔｔ ｎ ｂ ｉｈａ ｗ ｔ ｏｄ ｒｃｐｏ ｉ （ ＝０ ９ ６ ５） ｃｕ ａｙ ｕｔ ｌ ｏ ｅｅｍｉｉｇａ ａ ｎａ ｉ ｏ ｅ ｎ ｆｒ ｎａｉ ｙ Ｐｃ ｉ ｉ ｇ ｏ ｅ ｉｒｃｔ ｒ ｒ ｏ ｈ ｙ ． ９ ，ａｃ ｒｃ
氮的 含 量后 ， 以 明 显控 制 目的蛋 白 的降 解 ， 高产 品 的 产 率 。 结 果 证 实 该 方 法 用 于 发 酵 液 中氨 态 氮 的 检 测 可 提 时， 准确 可靠 ， 实 可行 。 切 关键词 靛 酚 蓝 法 ； 氏 法 ； 态氮 ； 赤 酵 母 ； 密度 发 酵 纳 氨 毕 高 Ｑ ３ ．７ ９９ ９ 文献标识码 Ａ 文章 编 号 １０ ７ ２ （０ ８ ０ ０ ３ ０ ０ ５— ０ １ ２ ０ ） ６— ０ ０— ６
Ｚ ＨＡＮＧ Ｘｉ — ｕ ，Ｔ Ｇ Ｌ ，ＹＡＮ Ｌ — ｉ ｇ ｎ ｇ ｏ ＡＮ ｉ ｕ ｙ ｎ ，ＣＨＥ ｉ ｎ ｈ ａ Ｎ Ｊａ — ｕ ，Ｗ ＡＮ ｎ Ｇ Ｍｉ
毕赤酵母蚓激酶重组体的高密度发酵与活性
毕赤酵母蚓激酶重组体的高密度发酵与活性摘要一种用于重组蚓激酶（rPI239）的表达系统在巴斯德毕赤酵母的发展。
通过1L高密度发酵肉汤制得0.174g上清蛋白。
rPI239体外表现出纤溶活性。
在体内rPI239的活性是通过凝血酶原时间，高岭土部分凝血酶时间，凝血酶时间和纤溶活性测定。
这项工作显示通过巴斯德毕赤酵母和高密度发酵得到的rPI239重组蛋白在体内和体外都具有相似纤溶活性。
关键词蚓激酶；纤维蛋白溶解；毕赤酵母；发酵；活性传统中医学已经长期使用蚯蚓作为药物，因为它们的抗发热和利尿特性。
最近研究表明，在蚯蚓干燥粉末含有纤溶酶组分。
研究人员在日本，韩国和中国已经分离和研究蚯蚓中获得的蚓激酶。
目前的数据显示，在地龙F-Ⅲ-1和F-Ⅲ-2发现的6种同工酶。
1986年，Wu等人，从蚯蚓中分离出的一组蚓激酶组件并且证实他们有激活纤溶酶原的纤溶活性和降解纤维蛋白，而EFE-II证实是纤溶活性蚓激酶的基因。
该作者通过用I125标记患有肺血管阻塞症兔子血管中的内栓子并且显示口服药物EFE-II后有明显纤溶活性。
同工酶（PDBank1IJ7）通过晶体结构分析MIR（多同晶置换）表明它是一个特效弹性蛋白酶S1反应区，表现广泛的底物活性。
最近的研究已经表明蚓激酶是有潜力的溶栓药。
1999年，Sun等人，从地龙中单独分离出蚓激酶PI239，在纤维蛋白板上发现明显纤溶活性。
它的cDNA文库与F-Ⅲ-1/2和EFE-II有89.5％同源性。
该PI239蛋白与那些的的t-PA和u-PA具有相同的活性和底物位点。
在2001年，Manabu 和 Nobuyoshi通过蚓激酶FIII-2在巴斯德毕赤酵母首次表达。
随后的研究已经证明许多种类的重组蚓激酶可以在酵母和大肠杆菌中表达。
近年来，蚓激酶已经在山羊奶表达。
尽管一些报道表明，在制得有效的重组蛋白过程中，资料非常少，，表达条件（特别是高密度发酵条件）也很苛刻，但是在这项研究中，还是完成了一套完整实验过程关于蚓激酶的筛选，表达和在酵母菌中发酵。
毕赤酵母高密度发酵工艺的研究_林俊涵
中国生物工程杂志 China B i otechnol ogy,2009,29(5):120～125毕赤酵母高密度发酵工艺的研究林俊涵3(福建生物工程职业技术学院 福州 350002)摘要 高密度发酵是毕赤酵母提高蛋白表达量的一种重要策略,发酵工艺是高密度发酵的一个重要因素。
采用下列措施均可以有效地提高表达水平:调节基础培养基,采用变pH 和变温发酵,提高DO ,选择最适的诱导前菌体密度和比生长速率并降低甘油初始浓度和采用分段式指数流加进行调控。
选择合适的甲醇补料策略:甲醇限制补料(MLF B )、氧气限制补料(OLF B )、甲醇不限制补料(MNLF B )和温度限制补料(T LF B )。
采用两种方式调控补料:诱导阶段菌体生长时,甲醇比消耗速率(q M eOH )为0.02-0.03gg -1h -1,而菌体不生长时,q M eOH 采用较高值。
关键词 毕赤酵母 高密度发酵 发酵工艺中图分类号 Q815收稿日期:2008209216 修回日期:20082102173电子信箱:ljh047@ 巴斯德毕赤酵母(P ichia pastoris )是一种能高效表达外源蛋白的表达系统,具有遗传稳定、表达水平高、蛋白可翻译后加工、产物可分泌、可高密度发酵等许多优点[1],应用十分广泛,已有数百种外源蛋白在该系统中获得表达。
高密度发酵是基因工程菌提高外源蛋白表达水平的一种重要策略,迄今,已有许多蛋白通过高密度发酵获得高表达量,如巴西三叶胶腈水解酶的表达量高达22g/L[2],植酸酶表达量达12.2g/L[3],S AM 表达量达11.63g/L[4],1,321,42β2D 2葡聚糖酶表达量达3g/L[5]等。
但是,不同外源蛋白的表达水平相差很大,引起这种差异的重要因素有二:一是重组菌本身特性,如基因本身特性、基因拷贝数、密码子使用频率等,二是发酵工艺。
目前,针对甲醇毕赤酵母高密度发酵,业界已建立起较为成熟的补料分批发酵和连续发酵两种方式,主要针对补料分批发酵工艺的影响和调控进行阐述。
酵母工程菌细胞高密度发酵的研究进展
酵母工程菌细胞高密度发酵的研究进展用分子生物学技术将编码外源蛋白或多肽的基因引入酵母菌，构建重组酵母工程菌表达抗原或细胞因子等，用于制备相应的生物制品，是研究开发新生物制品的重要趋势之一。
20世纪80年代，默克和史克公司用重组酿酒酵母菌（Saccharomyces cere －visiae ）表达的乙型肝炎表面抗原（HBsAg ）制备乙型肝炎疫苗，是最早用重组酵母制备生物制品的成功范例。
现已用重组酵母工程菌制备乙型肝炎疫苗、HPV 疫苗、人血清白蛋白（HSA ）和细胞因子；近年来，用重组酵母工程菌，特别是甲醇营养型酵母工程菌高效表达外源蛋白或多肽已成为相关研究的热点之一。
用甲醇营养型酵母，主要是汉逊酵母（Hanse-nula polymorpha ）和毕赤酵母（Pichia postoris ）已实现了HBsAg 、HPV -VLP 、戊型肝炎病毒（HEV ）ORF2、sHSA 、水蛭素及多种细胞因子等的高表达。
由于装备技术与成本的限制及生物制品生产中对制品批次质量控制要求的综合考虑等，用于酵母工程菌培养的生产发酵罐容积一般小于1000L （葛兰素维康制备乙型肝炎疫苗的发酵罐容积为1500L ）。
在保持外源蛋白或多肽表达水平不降低的前提下，在容积有限的发酵罐中实现酵母工程菌的高密度发酵，是维持制品生产规模和控制成本的重要技术途径。
影响酵母细胞高密度发酵的主要因素有工程菌本身的生物学特性和发酵工艺特点、培养基种类与配方、发酵罐的结构和性能、发酵过程各项重要工艺参数或变量的控制等。
重要工艺参数或变量包括溶氧、pH 值、温度、培养基营养成分补料、压力、搅拌转速、通气流量、CO 2、有害代谢产物积累和发酵液流变学性质等。
培养基中甲醇含量、其消耗与补充流量的控制，是影响甲醇营养型酵母工程菌培养后期去阻遏和表达外源蛋白或多肽的表达效率的关键因素。
在确保工程菌表达产率不变和表达产物性质稳定的前提下，将众多因素及其相互影响整合优化为一项发酵工艺，实现酵母工程菌细胞的高密度发酵，是一项复杂的、综合性很强的研发工作；在实现酵母工程菌高密度发酵的同时，提高表达产物的产率和活性则更具挑战性，国内外学者及企业为实现上述目标进行了大量研究。
重组毕赤酵母的高密度发酵工艺[发明专利]
![重组毕赤酵母的高密度发酵工艺[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/1193d3cf4b35eefdc9d33329.png)
专利名称：重组毕赤酵母的高密度发酵工艺
专利类型：发明专利
发明人：才学鹏,侯俊玲,王颖,骆学农,丁军涛,张少华,郑亚东,赵松波
申请号：CN200810212868.2
申请日：20080908
公开号：CN101348820A
公开日：
20090121
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开一种重组毕赤酵母高密度发酵工艺，特别是采用全自动控制发酵罐进行发酵的工艺。
本发明的工艺方法是将工作种子接种于BSM培养基中，培养温度为28℃，并进行搅拌，加氨水或磷酸控制发酵体系的pH值为4.8，罐压为0.8个大气压，当发酵罐中的甘油耗尽后一次缓慢加入甘油溶液280ml，待甘油再次彻底耗尽后，分五次缓慢加入每升含PTM12ml的甲醇溶液进行甲醇诱导，诱导72小时后结束发酵。
申请人：中国农业科学院兰州兽医研究所
地址：730046 甘肃省兰州市城关区盐场路徐家坪1号
国籍：CN
代理机构：兰州振华专利代理有限责任公司
代理人：张晋
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毕赤酵母菌分泌表达重组抑肽酶的高密度发酵工艺研究
毕赤酵母菌分泌表达重组抑肽酶的高密度发酵工艺研究刘振云;沈露;解凤立;谭树华【期刊名称】《东南大学学报（医学版）》【年(卷),期】2011(30)5【摘要】目的:对毕赤酵母高密度表达重组抑肽酶的发酵工艺进行探讨.方法:先通过摇瓶培养方法,确定表达抑肽酶的毕赤酵母在BSM培养基中生长所需的最佳配方.在此基础上,采用分批补料培养方法,对毕赤酵母pSA/GS115进行高密度发酵.紫外吸收法测定重组抑肽酶竞争性抑制胰蛋白酶对底物BAEE的水解活性.结果:BSM培养基中毕赤酵母生长必需的最佳配方为甘油40 g·L-1、氨水单次补加量0.1%、甲醇流加量1%.经过毕赤酵母高密度发酵,发酵液上清中蛋白的表达量为37.08 mg·L-1,目的蛋白活性达到4 450 BAEEU·ml-1,比摇瓶培养表达提高了8倍.结论:本发酵工艺可实现酵母工程菌的高密度表达发酵,其发酵产物具有较高的生物活性,为下一步大规模化制备抑肽酶奠定了基础.%Objective: To evaluate the fermentation process of high-density expressed recombinant aprotinin by Pichia pastoris. Methods: The most optimal formulation of BSM medium for Pichia pastoris to grow using flask culture methods were determined. Based on the study of fermentation in shake flask, the optimal conditions were used for scaling up in 7 L fermentor. Engineering bacteria pSA/GS115 was fermented in fed-batch high density fermentation. The biological activity was determined by ultraviolet absorption assay, and the recombinant aprotinin competitively inhibited the hydrolytic activity of trypsin against substrate BAEE. Results: The best technological parametersof fermentation to BSM medium were glycerol 40 g·L-1, ammonia water 0. 1％ , methanol 1％.Afterbeing optimized, the yield of protein could reach up to 37. 08 mg·ml -1 . The biological activity determined was 4 450 BAEEU·ml-1, 8 folds higher compared to that of shaking flask. Conclusion: The engineering bacteria is successfully fermented in fed-batch high-density fermentation and fermentation produce has a high biological activity, which established a foundation for the large-scale production of aprotinin.【总页数】5页(P744-748)【作者】刘振云;沈露;解凤立;谭树华【作者单位】中国药科大学生命科学与技术学院,分子生物学教研室,江苏,南京,210009;中国药科大学生命科学与技术学院,分子生物学教研室,江苏,南京,210009;中国药科大学,药物分析教研室,江苏,南京,21009;中国药科大学生命科学与技术学院,分子生物学教研室,江苏,南京,210009【正文语种】中文【中图分类】TQ920.6;TQ925.9【相关文献】1.重组毕赤酵母胸腺肽α1-人血清白蛋白基因工程菌高密度发酵及分离纯化 [J], 马娇颖;章成昌;仇黎鹏;姜玉涛;闫璐颖;陈菁;陈建华2.猪IFNα在毕赤酵母中分泌表达条件的优化及高密度发酵 [J], 蓝胜芝;于瑞嵩;俞明月;董世娟;曹祥荣;李震3.重组人胰腺α-淀粉酶在毕赤酵母菌中的分泌性表达 [J], 王天成;徐国宾;夏铁安4.重组牛乳铁蛋白功能片段在毕赤酵母中的表达及高密度发酵 [J], 魏春;任郑;吴涛;钱晓芬;孙杰;汪钊5.产鸡α干扰素的毕赤酵母菌高密度发酵工艺研究 [J], 曹丁; 李学优; 肖宏艳; 昝继清因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
毕赤酵母高密度发酵产β-甘露聚糖酶的工艺优化
毕赤酵母高密度发酵产β-甘露聚糖酶的工艺优化张晓龙;肖静;王瑞明【摘要】以表达β-甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌为研究对象,采用摇瓶发酵确定碳源、接种量、温度、pH基础条件,通过30 L发酵罐高密度发酵,探究菌体浓度、甲醇浓度、甲醇补料方式、溶氧量等条件对目的蛋白产量的影响,并通过正交试验优化发酵工艺条件.结果表明,最佳产酶条件为接种量10％,初始葡萄糖质量浓度30g/L,诱导温度28℃,pH 5.0,溶氧量10％～20％.在此发酵条件下,最终细胞干重135 g/L,目的蛋白表达量5.04 g/L,最高酶活力29 600 U/mL,较优化前提高24倍,已满足工业化要求.【期刊名称】《湖北农业科学》【年(卷),期】2015(054)023【总页数】6页(P5978-5983)【关键词】β-甘露聚糖酶;巴斯德毕赤酵母;高密度培养;发酵优化【作者】张晓龙;肖静;王瑞明【作者单位】齐鲁工业大学生物工程学院/山东省微生物重点实验室,济南250353;齐鲁工业大学生物工程学院/山东省微生物重点实验室,济南250353;齐鲁工业大学生物工程学院/山东省微生物重点实验室,济南250353【正文语种】中文【中图分类】Q815β－甘露聚糖酶（β－1，4－D－mannan mannohydrolase，EC 3.2.1.78）是β－1，4 甘露聚糖甘露糖苷水解酶的简称，属于半纤维素酶类，广泛应用于食品、饲料、医药、纺织印染等方面［1］，在饲用酶制剂应用方面尤其重要［2］，添加β－甘露聚糖酶可以降解饲料中含有的β－甘露聚糖，有助于消除甘露聚糖对机体胰岛素分泌和胰岛素样生长因子（IGF）生成的抑制作用，提高葡萄糖吸收速率，促进碳水化合物代谢过程，提高日粮能量利用率，是一种良好的饲料添加剂，也是抗生素的理想代替品［3］。
毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统既具有原核表达系统易于培养、繁殖快速、表达量高的优点，又具有真核表达系统外源蛋白翻译后再加工修饰等特点，目前已有超过500种外源蛋白在毕赤酵母中获得成功表达。
Muts型基因重组巴斯德毕赤酵母高密度发酵过程中甲醇流加的控制
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材料与方法
菌种
重组毕赤酵母菌 !"#$"% & %’()*"’ （ ;<’’= ） 由中 ［:］ 科院上海生物化学研究所甘人宝课题组构建 ， 具 有 >5- ? *+,- 表型 ( ! " # 培养基
! （ @*;A ） 甘 ! ( # ( ! 种子培养基 AB@ ’$ ( : 8 C D， 油 ’% .D C D， 生物素 % ( : . 8 C D， ’ .34 C D E> F ( % 的
慢， 但有时外源蛋白的表达反而更高， 更有利于蛋
［)］ 白质的正确折叠 (
血管生长抑制素 （ 12 853-,1,52） 是一个相对分子 质量为 $9 %%% 的血浆纤维蛋白溶酶原片段， 通过抑 制毛细血管内皮细胞的移行和增殖， 阻断新生毛细 血管的形成， 从而达到阻断肿瘤细胞转移通路、 萎
［$］ 缩肿瘤的治疗目的 ( 已构建的表达血管生长抑制 ［:］ 素的重组毕赤酵母 具有 *+,- 的表型， 在发酵过 程的表达阶段， 甲醇质量浓度控制对蛋白质表达起
dkl溶液开始诱导重组蛋白表达流加方法参照文献发酵过程由国家生化工程技术研究中心上海开发的发酵罐控制系统l3e017q软件进行在线控制和数据采集甲醇的在线检测与控制甲醇的在线检测及流加控制系统包括甲醇采样器检测器和ohr9型甲醇质量浓度监控仪个部分由生物反应器工程国家重点实验室提供测定方法菌体浓度采用浊度法发酵液经稀释后于波长f2
甲醇利用能力， 具有 *+, （ ./,01234 +,54561,532 -437 ） 表型； *+,- 表型的毕赤酵母在甲醇诱导阶段生长缓
不低于 )%& ( 甘油耗尽后 ’ 0 开始流加质量分数为 （每升含 ’) .D KL *’ 溶液） ， 菌体密度 =%& 的甘油 （ 每 升 含 ’) .D 达 一 定 程 度 时 流 加 ’%%& 甲 醇 ［)］ ， 开始诱导重组蛋白表达， 流加方法 KL *’ 溶液 ） 参照文献 ［ )］ ( 发酵过程由国家生化工程技术研究 中心 （上海） 开发的发酵罐控制系统 L3E017Q 软件 进行在线控制和数据采集 ( !"% 甲醇的在线检测与控制 甲醇的在线检测及流加控制系统包括甲醇采 样器、 检测器和 OHR’9%@ 型甲醇质量浓度监控仪 $ 个部分， 由生物反应器工程国家重点实验室提供 ( !"& 测定方法 菌体浓度采用浊度法， 发酵液经稀释后于波长 （ "SF%% ） F%% 2. 测光密度 ( 血管生长抑制素的测定 采用 TDM<! 方法 (
甘油对毕赤酵母高密度发酵表达重组水蛭素Ⅱ的影响
甘油对毕赤酵母高密度发酵表达重组水蛭素Ⅱ的影响宋留君;周长林;窦洁;林健【期刊名称】《中国药科大学学报》【年(卷),期】2006(37)4【摘要】目的:考察甘油对毕赤酵母生长和重组水蛭素Ⅱ表达的影响。
方法:在摇瓶和10L发酵罐中用含有不同浓度甘油的培养基培养毕赤酵母,测定毕赤酵母的生长和重组水蛭素Ⅱ的表达。
结果:发酵培养基中初始甘油浓度为5 g/L时,毕赤酵母生长速度明显加快;补料过程中甘油浓度大于70 g/L时,毕赤酵母生长受到抑制。
与不加甘油相比较,诱导表达期维持培养基中甘油浓度在5 g/L以下,重组水蛭素表达可提前4 h,诱导30 h其活性达13 000 ATU/mL,比仅用甲醇诱导时效价提高了7.7%。
结论:降低初始培养基中甘油浓度有利于毕赤酵母生长,补料过程中培养基甘油浓度应维持在抑制毕赤酵母生长的浓度之下,诱导阶段培养基中少量的甘油有利于水蛭素的表达。
【总页数】4页(P371-374)【关键词】重组水蛭素;毕赤酵母;甘油【作者】宋留君;周长林;窦洁;林健【作者单位】中国药科大学生命科学与技术学院;上海美通生物科技有限公司【正文语种】中文【中图分类】R973.2;R394.8【相关文献】1.重组毕赤酵母高密度发酵表达活性hCTRP2的研究 [J], 李洪波;吴东海2.重组烟曲霉壳聚糖酶在毕赤酵母中高密度发酵表达及性质研究 [J], 裘梁;杨萍;董德刚;阳历;王曼莹3.不同甲醇流加策略对重组毕赤酵母高密度发酵生产水蛭素的影响 [J], 周祥山;范卫民;张元兴4.重组牛乳铁蛋白功能片段在毕赤酵母中的表达及高密度发酵 [J], 魏春;任郑;吴涛;钱晓芬;孙杰;汪钊5.重组毕赤酵母高密度发酵表达水蛭素过程中产物的生成和降解 [J], 周祥山;周卫斌;范卫民;张元兴;董美玉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
重组毕赤酵母中腺苷甲硫氨酸的纯化
重组毕赤酵母中腺苷甲硫氨酸的纯化傅梦月;张建国;张继宁【摘要】腺苷甲硫氨酸(S-Adenosy-L-methionine,SAM)是人体中重要的中间代谢物,具有重要的生理功能.从重组毕赤酵母中生产SAM是一个有应用潜力的方式.该研究报道了一个完整的从具有重组SAM合成酶的毕赤酵母中纯化SAM的工艺.首先利用1 mol/L乙酸乙酯和1 mol/L硫酸的混合溶液破碎细胞,然后利用弱酸性阳离子大孔树脂吸附SAM,最后以流速为0.2 mL/min的100 mmol/L的硫酸洗脱SAM.SAM的收率达到80.03％,纯度为92％.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2015(041)006【总页数】5页(P15-19)【关键词】腺苷甲硫氨酸;毕赤酵母;大孔阳离子树脂,离子交换法【作者】傅梦月;张建国;张继宁【作者单位】上海理工大学医疗器械与食品学院,上海,200093;上海理工大学医疗器械与食品学院,上海,200093;上海市农业科学院生态环境保护研究所,上海,201403【正文语种】中文腺苷甲硫氨酸(S-Adenosyl-L-methionine，SAM)在生物体中发挥着多种重要的生物功能［1］。
而且，SAM处于多种代谢物的代谢途径的中心位置。
实际上SAM分子中每一部分都会转化为有用的中间代谢物。
在临床上，SAM可以用来治疗抑郁症、骨关节炎、纤维肌痛、老年痴呆症等［2］。
1999年美国食品和药品监督管理局批准将其作为营养强化剂添加到食品中。
在欧洲，SAM在70年代就在市场上销售了。
近年来，有关SAM的生产一直是科研和工业界人员关注的热点。
SAM的生产可以来自化学合成法，以ATP和L-甲硫氨酸为底物的酶促反应，以带有高活力的腺苷甲硫氨酸合成酶的微生物发酵方法。
其中微生物发酵方法由于产量高，成本低，产物中S，SSAM比例高而获得广泛认可。
很多微生物都被报道用于积累 SAM，例如拟球酵母属［3］，面包酵母［4］，酿酒酵母［5］，产元假丝酵母［6］，乳酸克鲁维酵母［7－8］，大肠杆菌等［9］。
毕赤酵母高密度发酵产脂肪酶条件的研究
毕赤酵母高密度发酵产脂肪酶条件的研究徐明;付会兵;刘鹏;钱建阳;求赵明;王浩均;柳志强;郑裕国【摘要】以毕赤酵母基因工程菌为材料,通过单因素试验在15L发酵罐中对发酵的pH、通气量、接种量、搅拌转速及诱导剂的量进行优化;进而对影响明显的因素在700 L发酵罐中进行三因素三水平正交试验,最终确定最佳的发酵条件为:pH为5.0,温度为30℃,转速为250 r/min,接种量为5％,溶氧为20％～30％,诱导剂甲醇的量为129 L,培养时间为160～170 h,在开始诱导后分3次(48 h/次)向发酵液中添加0.5％的酵母膏(w/v)和1％的蛋白胨(w/v)可以显著提高发酵液酶活,酶活可以达到18 U/mL.【期刊名称】《发酵科技通讯》【年(卷),期】2015(044)001【总页数】5页(P33-37)【关键词】脂肪酶;毕赤酵母;正交试验;中试【作者】徐明;付会兵;刘鹏;钱建阳;求赵明;王浩均;柳志强;郑裕国【作者单位】浙江来益生物技术有限公司,浙江嵊州312400;浙江工业大学生物工程研究所,浙江杭州310014;浙江工业大学生物工程研究所,浙江杭州310014;浙江来益生物技术有限公司,浙江嵊州312400;浙江来益生物技术有限公司,浙江嵊州312400;浙江来益生物技术有限公司,浙江嵊州312400;浙江工业大学生物工程研究所,浙江杭州310014;浙江工业大学生物工程研究所,浙江杭州310014【正文语种】中文【中图分类】TQ920.1脂肪酶（EC 3.1.1.3），又称三酰基甘油酰基水解酶，是一类能够催化高级脂肪酸和丙三醇形成脂肪酸甘油酯键或者催化天然底物油脂（三脂酰甘油酯）水解产生脂肪酸和甘油的酶[1]。
目前，脂肪酶被广泛应用于食品、饲料、化工等工业领域[2-3]。
脂肪酶是人们研究最早的酶之一，其广泛存在于原核生物和真核生物中，由于哺乳动物和植物脂肪酶的量较少而且分离纯化难度也较大，而微生物脂肪酶在这方面表现出了很好的优越性[4]，所以微生物脂肪酶自发现后就得到了较深入的研究。
毕赤酵母高密度发酵菌株优选及分离纯化技术综述
毕赤酵母高密度发酵菌株优选及分离纯化技术综述发布时间：2021-11-01T06:56:24.297Z 来源：《科学与技术》2021年第21期作者：徐倩[导读] 巴斯德毕赤酵母，是甲醇营养型酵母中的一徐倩（义马煤业集团煤生化高科技工程有限公司，河南三门峡，472300）摘要：巴斯德毕赤酵母，是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌。
巴斯德毕赤酵母是单细胞真核生物，生长快，易于分子遗传学操作；巴斯德毕赤酵母的醇氧化酶I(Alcohol 0xidaSel，A0Xl)基因的启动子具有强诱导性和强启动性，适于外源基因的高水平诱导表达；目的基因整合在染色体上具有高稳定性；可高水平分泌表达重组蛋白，纯化方便；发酵工艺成熟，易放大，且培养成本低，产品易分离。
本文根据生产实践经验，就巴斯德毕赤酵母菌株的研究进展、高密度发酵菌株的优选及分离纯化技术进行了总结和综述。
关键词：毕赤酵母、菌株、优选、分离纯化1.前言1.1背景和意义近年来发酵工程迅速崛起，从“乐百氏奶”等乳酸菌饮料，到比黄金还贵的干扰素等药品，都是微生物对人类的无私奉献。
微生物在发酵过程里充当着生产者的角色，这与它的特性密不可分的。
它们对周围环境的温度、压强、酸碱度、干湿条件都有极强的适应力。
发酵的规模越大，批次所需的种子也就越多。
要使小小的微生物在短时间内完成如此巨大的发酵任务，那就必须使菌种扩大培养。
而扩大培养的前提就是必须要有相对数量、相对稳定、代谢旺盛的种子。
菌种纯化是指从菌种的细胞或孢子群体中淘汰衰退的个体，分离出优良的个体，从而保持菌种的纯度和优良的特性。
以巴斯德毕赤酵母为例：近年来毕赤酵母表达系统极受研究者的青睐，已有300多种外源蛋白在该表达系统中获得表达，主要用于人类药物的生产，还包括来自植物、动物和细菌的各种酶，膜受体蛋白，含辅基的蛋白质以及可用于研究晶体结构的蛋白质等。
它还可以同时表达酶组分比例适当的一个酶系，使全细胞作为生物催化剂。
流式细胞仪检测重组毕赤酵母发酵过程中的细胞活性
流式细胞仪检测重组毕赤酵母发酵过程中的细胞活性方曙光;黄立;储炬;庄英萍;张嗣良【期刊名称】《华东理工大学学报：社会科学版》【年(卷),期】2006(000)009【摘要】建立了流式细胞仪检测重组巴斯德毕赤酵母(P.p astoris)细胞活性的方法,并在高密度发酵过程中得到应用。
使用碘化丙锭染色法测定细胞活性,发现甲醇诱导时酵母细胞活性开始下降,随着细胞密度的增加,由于细胞胁迫和甲醇的影响,细胞活性明显下降,活细胞率最大下降了14%。
与此同时,细胞生长减缓,目的蛋白发生降解,表明细胞活性与发酵过程中细胞的生长和目的蛋白生成等参数密切相关。
实验证明:流式细胞仪可作为检测毕赤酵母发酵过程中细胞活性参数的一个便捷精确的有力工具。
【总页数】4页(P)【作者】方曙光;黄立;储炬;庄英萍;张嗣良【作者单位】华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室国家生化工程技术研究中心;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室国家生化工程技术研究中心;上海【正文语种】中文【中图分类】TQ920.1【相关文献】1.Muts型基因重组巴斯德毕赤酵母高密度发酵过程中甲醇流加的控制 [J], 谢静莉;张励;叶勤;周庆玮;辛利;杜鹏;甘人宝2.流式细胞仪检测重组毕赤酵母发酵过程中的细胞活性 [J], 方曙光;黄立;储炬;庄英萍;张嗣良3.重组毕赤酵母表达reteplase发酵过程中的降解现象 [J], 方曙光;储炬;黄立;庄英萍;张嗣良4.重组毕赤酵母表达reteplase发酵过程中的降解现象 [J], 方曙光; 储炬; 黄立; 庄英萍; 张嗣良5.重组毕赤酵母高密度发酵表达水蛭素过程中产物的生成和降解 [J], 周祥山;周卫斌;范卫民;张元兴;董美玉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
重组巴氏毕赤酵母高密度发酵表达人乳铁蛋白的研究
重组巴氏毕赤酵母高密度发酵表达人乳铁蛋白的研究应革;吴淑华;王静;赵小东;陈建明;张晓光;侯云德【期刊名称】《中华实验和临床病毒学杂志》【年(卷),期】2004(018)002【摘要】目的在保持生物学活性的前提下,实现人乳铁蛋白基因在巴氏毕赤酵母中的高密度发酵表达.方法从人外周血中分离中性粒细胞,提取总RNA,RT-PCR方法获得人乳铁蛋白前体全长cDNA序列,适当改造后克隆至巴氏毕赤酵母表达载体pPIC 3.5 K上并转化酵母宿主KM71,双层滤膜法筛选高表达株进行补料分批发酵,对发酵产物的理化及生物学活性进行初步检测.结果筛选到一株人乳铁蛋白表达量较高的重组巴氏毕赤酵母p3.5-k-7并对其进行了补料分批发酵.整个发酵历时约9 d,菌浓吸光度A600值最高达到260以上,重组人乳铁蛋白最高表达量为115 mg/L,是摇瓶培养条件下的7.67倍.结论成功实现了人乳铁蛋白基因在巴氏毕赤酵母中的高密度发酵表达,并对发酵参数的优化进行了初步探索.【总页数】5页(P181-185)【作者】应革;吴淑华;王静;赵小东;陈建明;张晓光;侯云德【作者单位】100052,北京,中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒基因工程国家重点实验室;100052,北京,中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒基因工程国家重点实验室;中国农业大学食品科学与营养工程学院生物工程系;100052,北京,中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒基因工程国家重点实验室;100052,北京,中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒基因工程国家重点实验室;100052,北京,中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所肿瘤病毒室;100052,北京,中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒基因工程国家重点实验室【正文语种】中文【中图分类】R3【相关文献】1.重组毕赤酵母高密度发酵表达活性hCTRP2的研究2.毕赤酵母菌分泌表达重组抑肽酶的高密度发酵工艺研究3.重组烟曲霉壳聚糖酶在毕赤酵母中高密度发酵表达及性质研究4.重组巴氏毕赤酵母高密度发酵表达rHSA5.重组牛乳铁蛋白功能片段在毕赤酵母中的表达及高密度发酵因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
培养条件对重组毕赤酵母高密度表达猪胰岛素前体的影响
培养条件对重组毕赤酵母高密度表达猪胰岛素前体的影响姚钰舜;储炬;杭海峰;庄英萍;张嗣良【期刊名称】《华东理工大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2006(032)004【摘要】研究了基因工程菌Pichiapastotis高密度、高表达的培养条件.在全合成摇瓶培养基的基础上,考察了诱导过程中甲醇浓度、温度、pH、(NH4)2SO4及磷酸盐浓度等因素对猪胰岛素前体(PIP)表达的影响.研究表明:甲醇的最佳诱导浓度为6 g/L,过高或过低的甲醇浓度都不利于菌体生长和蛋白表达;在菌体生长和蛋白表达阶段,pH应分别控制在5.5和4.0;诱导阶段,培养温度下降到28℃,可以提高重组蛋白质的表达量.上述结果用于15 L全自动发酵罐实验,PIP表达水平达到了1.69 g/L,是摇瓶结果的17倍.【总页数】5页(P397-401)【作者】姚钰舜;储炬;杭海峰;庄英萍;张嗣良【作者单位】华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237【正文语种】中文【中图分类】Q939.9【相关文献】1.拷贝数对毕赤酵母重组菌表达猪胰岛素前体的影响 [J], 陈丽;郭美锦;储炬;庄英萍;张嗣良2.毕赤酵母高密度表达重组猪胰岛素前体的研究 [J], 刘玉伟;黄明志;庄英萍;储炬;张嗣良3.中心复合实验设计法优化重组毕赤酵母表达猪胰岛素前体的培养基和诱导pH [J], 刘玉伟;黄明志;王永红;储炬;庄英萍4.重组毕赤酵母表达猪胰岛素前体代谢参数分析和动力学模型 [J], 陈文; 郭美锦; 储炬; 庄英萍; 张嗣良5.发酵条件对毕赤酵母高密度表达地特胰岛素前体DesB30的影响 [J], 郑华亮;贾小峰;马鲁南;刘忠;张贵民因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
重组巴斯德毕赤酵母高密度发酵表达植酸酶
重组巴斯德毕赤酵母高密度发酵表达植酸酶
李洪淼;王红宁;许钦坤
【期刊名称】《中国生物工程杂志》
【年(卷),期】2005(25)B04
【摘要】对巴斯德毕赤酵母的高密度发酵条件进行了试验,并根据摇瓶发酵的优化结果进行了补料方式的研究。
在摇瓶发酵时,最佳种龄为16h,接种量为3％,甲醇的诱导浓度为15g／L,生长阶段最适pH为5．0,诱导阶段最适pH为5．5。
在间歇补料、恒速补料、变速补料三种补料方式中以变速流加最优。
【总页数】4页(P295-298)
【关键词】毕赤酵母;高密度发酵;补料方式
【作者】李洪淼;王红宁;许钦坤
【作者单位】四川农业大学动物科技学院
【正文语种】中文
【中图分类】Q786;TQ460.38
【相关文献】
1.巴斯德毕赤酵母表达重组人对氧磷酶1的r发酵条件优化 [J], 廖一波;于子桐;潘力;叶燕锐
2.Muts型基因重组巴斯德毕赤酵母高密度发酵过程中甲醇流加的控制 [J], 谢静莉;张励;叶勤;周庆玮;辛利;杜鹏;甘人宝
3.重组毕赤酵母表达工程植酸酶发酵过渡相参数相关分析 [J], 郭美锦;储炬;庄英萍;
杭海峰;张嗣良
4.以葡萄糖为生长相基质的重组毕赤酵母表达植酸酶发酵 [J], 杭海峰;叶新暤;郭美锦;储炬;庄英萍;张嗣良
5.一种提高大肠杆菌植酸酶异源表达的巴斯德毕赤氏酵母发酵策略 [J], ChenCC;龚家玮;朱春宝
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V o l .30N o.62004212华 东 理 工 大 学 学 报 Journal of East Ch ina U niversity of Science and T echno logy 基金项目:教育部科学技术研究重点项目(99166);上海市重点学科基金E -ma il :qye @ecust .edu.cn收稿日期:2003212208作者简介:谢静莉(19742),女,江苏南京人,博士研究生,研究方向为发酵工程。
研究简报 文章编号:100623080(2004)0620723204重组巴斯德毕赤酵母高密度培养中铵离子浓度的影响谢静莉1, 周庆玮2, 杜 鹏2, 甘人宝2, 叶 勤13(1.华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海200237;2.中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所,上海200031) 摘要:采用M u t S 表型的重组毕赤酵母生产血管生长抑制素,表达阶段流加甘油2甲醇混合碳源以提高菌体密度和血管生长抑制素的表达水平,菌体密度可达174g L ,约是表达阶段采用甲醇为单一碳源的发酵过程的3倍。
菌体密度的提高导致表达阶段发酵液中铵离子浓度下降很快,当发酵液中的铵离子浓度低至40mm o l L 时,影响了血管生长抑制素的表达。
改变pH 调节方式并在发酵后期添加25mm o l L (N H 4)2SO 4使发酵液中铵离子浓度维持在150mm o l L 以上,血管生长抑制素的表达产量达到108m g L 。
关键词:巴斯德毕赤酵母;血管生长抑制素;发酵;铵离子浓度中图分类号:TQ 920.6文献标识码:AEffect of Amm on iu m Concen tration on the Expression of Ang iostati n i n H igh Cell D en sity Culture of Recom bi nan t P ich ia p astorisX IE J ing 2li 1, ZH OU Q ing 2w ei 2, DU P eng 2, GA N R en 2bao 2, Y E Q in13(1.S ta te K ey L abora tory of B ioreactor E ng ineering ECU S T ,S hang ha i 200237,Ch ina ;2.Institu te of B ioche m istry and Cell B iology ,S hang ha i Institu te of B iolog ica l S cience ,Ch inese A cad e m y of S cience ,S hang ha i 200031,Ch ina )Abstract :In fed 2batch cu ltivati on of recom b inan t P ich ia p astoris (M u t Spheno type ),feeding w ithglycero l and m ethano l w as conducted du ring the exp ressi on phase to enhance the cell grow th and angi o 2statin exp ressi on .T he cell den sity reached 174g L at the end of fer m en tati on ,w h ich w as abou t 3fo ld of that ob tained w ith m ethano l as the so le carbon sou rce in the inducti on phase .H igh cell den sity resu lted in a qu ick drop of amm on ium concen trati on in the fer m en tati on b ro th ,and w hen the amm on ium concen trati on w as below 40mm o l L ,the p roducti on of angi o statin also decreased .T he change of pH con tro l strategy and additi on of 25mm o l L (N H 4)2SO 4w ere app lied to release the effect cau sed by low amm on ium concen 2trati on .T he amm on ium concen trati on w as m ain tained above 150mm o l L in the inducti on p hase ,and 108m g L angi o statin w as ach ieved at the end of fer m en tati on .Key words :P ich ia p astoris ;angi o statin ;fer m en tati on ;amm on ium concen trati on327血浆纤维蛋白溶酶原片段,通过抑制毛细血管内皮细胞的移行和增殖,阻断新生毛细血管的形成而达到阻断肿瘤细胞转移通路、萎缩肿瘤的治疗目的[1],是较为看好的抗癌新药。
采用巴斯德毕赤酶母(P ich ia p astoris)表达重组人血管生长抑制素时,由于M u t S表型的重组毕赤酵母利用甲醇能力弱,诱导阶段以甲醇为唯一碳源时生长缓慢,血管生长抑制素的产量低,同时高浓度的铵离子(高于100 mm o l L)对菌体生长有明显的抑制作用[2]。
为提高菌体密度和血管生长抑制素产量,在表达阶段采用流加混合碳源的方式,菌体浓度较以甲醇为诱导剂和唯一碳源时有很大提高,在发酵中后期,发酵液中较低的铵离子浓度对血管生长抑制素的表达产生了明显影响。
本文报道诱导阶段采用甘油2甲醇混合碳源的发酵过程中铵离子浓度对血管生长抑制素表达的影响。
1 材料与方法1.1 菌种和培养基重组毕赤酵母菌由中科院上海生物化学研究所甘人宝课题组构建[3],具有H is4+M u t S表型。
1L种子培养基(BM GY)含:YNB(D ifco,美国)13.4g,甘油10mL,生物素0.4m g,1m o l L pH6.0磷酸缓冲溶液100mL,酵母提取物(O x i od,英国)10g,酪蛋白胨(Po lyp ep ton,日本制药株式会社,日本)20g。
1L发酵培养基(B S M)含:w=0.85磷酸26.7mL,CaSO40.93g,K2SO418.2g,M gSO4・7H2O14.9g,KOH4.13g,甘油40g,PTM1溶液4.35mL,w=0.28氨水调节pH至5.0。
1L PTM1溶液含:CuSO46.0g,K I0.8g,M nSO43.0g, N a2M oO40.2g,H3BO30.2g,CoC l20.5g,ZnC l2 20.0g,FeSO4・7H2O65.0g,生物素0.2g,硫酸5mL。
所用试剂除已标注者均为国产分析纯。
1.2 培养方法一级种子:将菌种冷冻甘油悬液融化后,接0.7 mL于装有25mL种子培养基的250mL摇瓶中, 30°C旋转摇床250r m in培养14h。
二级种子:将一级种子接种于3个分别装有50 mL种子培养基的500mL摇瓶中,30°C旋转摇床250r m in培养7h。
发酵:5L发酵罐装2.5L发酵培养基,接种量7%,温度30°C,pH5.0,通气量4L m in,DO不低于20%。
甘油耗尽后,饥饿0.5h开始流加500g L g L左右时饥饿0.5h后,开始诱导重组血管生长抑制素表达,流加甲醇(每升加12mL PTM1溶液),同时流加500g L甘油(每升加12mL PTM1溶液),甘油流加速率调节参见文献[4]。
发酵开始至表达开始采用5m o l L KOH调节pH,此后至发酵结束采用123g L氨水调节pH。
发酵过程由国家生化工程技术研究中心(上海)开发的发酵罐控制系统Top haw k软件进行控制和数据采集。
1.3 甲醇在线检测与控制采用甲醇检测及控制系统进行发酵液中甲醇浓度的在线测定,并对甲醇的流加进行反馈控制。
甲醇检测控制系统包括甲醇采样器、检测器和FC2180B 型甲醇浓度监控仪3个部分[5],由生物工程学院李凡超研制提供。
发酵过程中表达阶段的甲醇浓度控制在5g L。
1.4 测定方法菌体浓度测定采用浊度法,发酵液经稀释后于波长600nm测光密度(OD600)。
菌体干重与OD600的关系为1OD600单位相当于0.36g L。
血管生长抑制素的测定采用EL ISA方法[3]。
铵离子浓度采用B erthelo t比色法[6]检测。
2 结果与讨论2.1 诱导阶段采用混合碳源的发酵张励等发现,重组毕赤酵母在诱导阶段,以甲醇为诱导剂和唯一碳源表达血管生长抑制素时,过高的铵离子浓度(高于100mm o l L)抑制菌体的生长,当在发酵过程中采用2m o l L KOH取代123g L氨水调节pH,使发酵液中铵离子浓度不高于100 mm o l L,菌体达到60g L,血管生长抑制素的表达量提高至20m g L[2]。
为了改善菌体的生长,诱导阶段采用流加甲醇2甘油混合碳源,最终菌体浓度可达174g L(图1),是以甲醇为诱导剂和唯一碳源时的3倍。
图1所示发酵过程中,发酵27.5h开始诱导表达,表达43h(全发酵时间为70.5h),发酵液中血管生长抑制素浓度达68m g L,同时,发酵液中铵离子浓度从开始诱导表达时的200mm o l L下降到40 mm o l L;此后至发酵结束,铵离子浓度一直低于40 mm o l L,虽然菌体能维持一定生长,但血管生长抑制素浓度呈下降趋势。
诱导阶段采用流加混合碳源的方法后,由于菌体生长有很大改善,铵离子的消耗大大增加,从发酵的70.5h至发酵结束,发酵液中铵离子浓度较低,虽然对菌体的生长影响不大,但血427 华 东 理 工 大 学 学 报管生长抑制素的表达有显著下降,可能是由于铵离子不足引起的。
图1 诱导阶段流加甘油2甲醇混合碳源的发酵曲线F ig .1 T i m e courses of cell density ,angi o statin exp ressi onlevel and ammonium concentrati on during thefer m entati on fed w ith glycero l and m ethano l in theinducti on phase■—Cell ;○—A ngi o ststin ;▲—Ammonium 图1所示发酵过程中,发酵的前27.5h 菌体关于铵离子的得率为0.23g mm o l ;进入表达阶段后至发酵70.5h ,血管生长抑制素的比生产速率为0.019m g(g ・h ),菌体关于铵离子的得率为0.10g mm o l ,这一段发酵过程共流加123g L 氨水94g (含纯氨13.2g )。