微生物学实验指导

实验一光学显微镜的使用及微生物形态的观察、大

小的测定和计数

一、实验目的

1、掌握光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养

2、观察细菌、真菌、原生动物的标本装片，学会绘制生物图

3、掌握使用测微尺测量微生物大小的方法

4、了解血球计数板的结构，掌握使用和计算方法

二、实验器材

1、显微镜

2、微生物标本装片

3、目、物镜测微尺

4、血球计数板

5、酵母菌液或霉菌孢子液

6、载波片、盖波片、烧杯、滴管、擦镜纸、香柏油、二甲苯等

三、显微镜的构造、原理及使用方法

1、构造

现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜，由机械装置和光学系统两大部分组成。机械装置包括镜筒、转换器、载物台、镜臂、镜座、调节器；光学系统包括目镜、物镜、聚光器、电光源。显微镜的总放大倍数为目镜和物镜的放大倍数的乘积。

2、操作

在目镜保持不变的情况下，使用不同放大倍数的物镜所能达到的分辨率及放大率都是不同的。一般情况下，特别是初学者，进行显微观察时应遵循从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序，因为低倍数物镜视野相对大，易发现目标及确定检查的位置。

四、微生物大小的测量原理和方法

微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小，只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和物镜测微尺。

1、目镜测微尺（图1-1）是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把10mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的

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中间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用物镜测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。

2、物镜测微尺（图1-2）是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将lmm 等分为100格，每格长l0μm （即0.0lmm ），是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将物镜测微尺放在载物台上，由于物镜测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成象进入视野，即物镜测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从物镜测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用物镜测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度，然后移去物镜测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。

3、目镜测微尺的校正

把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把物镜测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清物镜测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与物镜测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺重叠，再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度(图1-3)，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和物镜测微尺的格数。因为物镜测微尺的刻度每格长l0μm ，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。

例如目镜测微尺5小格正好与物镜测微尺5小格重叠，已知物镜测微尺每小格为l0μm ，则目镜测微尺上每小格长度为=5×10μm/5＝10μm

用同法分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。

由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件（特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用，当更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。

4、细胞大小的测定

移去物镜测微尺，换上待测菌体的装片，先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值，即等于该菌的长和宽。

结果计算： 长μm ＝平均格数×校正值

宽μm ＝平均格数×校正值

大小表示： 宽μm ×长μm

图1-1 目镜测微尺

图1-2 物镜测微尺 图1-3 目、物镜测微尺的校正

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五、微生物细胞数量的测定原理和方法

1、血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区（图1-4），计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。

计数区边长为1mm ，则计数区的面积为l mm 2，每个小方格的面积为1/400mm 2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm ，所以每个计数区的体积为0.1mm 3，每个小方格的体积为1/4000mm 3。

使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。

已知：1mm 3体积=10 mm ×10 mm ×10 mm=

1000mm 3

所以：1mm 3体积应含有小方格数为1000mm 3/1/4000mm 3=4×106个小方格，即系数

K=4×106 。

因此：每ml 菌悬液中含有细胞数= 每个小格中细胞平均数（N ）×系数（K ）×菌液稀释倍数（d ）

2、计数方法

（1）视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释，以每小格的菌数可数为度。 （2）取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。

（3）将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，

图1-4 血球计数板 图1-5 计数室