透射电镜常规样品制备流程

透射电镜样品制备流程

由于透射电镜能观察的样品必须很薄（60～70nm），所以透射电镜的样品准备要求很严格，方法也很单一，仅有一下两种方法：

一．负染色技术

负染色技术简单快速，可以显示生物大分子、细菌、分离的细胞器以及蛋白晶体等样品的形态、结构、大小以及表面结构的特征。尤其在病毒学中，负染色技术有着广泛的应用。

样品要求：①样品悬液的纯度不要求很纯，但是如果杂质太多，如大量的细胞碎片，培养基残渣，糖类以及各种盐类结晶的存在都会干扰染色反应和电镜的观察。尤其是不能有过多的糖类，因为在电子束的轰击下，糖类容易碳化而有碍观察，因此样品要适当提纯。②样品悬液的浓度要适中，太稀在电镜下很难找到样品，太浓样品堆积影响观察。

操作流程：吸取样品悬液滴到有膜的铜网上，静置数分钟，然后用滤纸吸去多余的液体，滴上负染色液，染色1～2min后滤纸吸去负染色液，待干后用于电镜观察。

二、超薄切片技术

超薄切片技术是为透射电镜观察提供薄样品的专门技术，是生物学中研究细胞超微结构最常用的技术。广泛应用于生物体的各种细胞的超微结构观察。一般厚度在10～100nm的切片称为超薄切片，制作这种切片的技术叫做超薄切片技术。超薄切片制作的过程包括取材、固定、脱水、渗透、包埋、聚合、切片和染色等几个环节，和一般光学显微镜的石蜡切片过程相似。但是，超薄切片切片过程更为细致与复杂，要求更严格，而且所用的试剂比较昂贵、配制复杂、强致癌。具体操作步骤、注意事项如下：

1．取材和前固定：快速的切取大小为0.5～1.0mm3的样品块，一分钟内把组织（样品）块浸入2.5％戊二醛（进口品质）溶液（取样前来平台领取），每个离心管内装20个以上的样品块，作为一个样送到平台。要求：①取材前一定要和工作人员取得电话联系！②取材选择部位要准确可靠，确保每块材料都是要观察的部位。③所有植物样品一定要抽真空，能够沉底的样品也抽真空15mins，不能沉底的样品一定要抽真空致沉底！④细菌、散在细胞等不能成块的样品，加戊二醛固定液，离心沉淀后送到平台，由平台工作人员处理。⑤泡在前固定液的材料最多可以放2周。

2．漂洗：用1M PBS Buffer Ph 7.2冲洗3次，每次15mins。

3．后固定：加入1％锇酸处理到样品变黑。植物样品一般处理2.5hours，真菌、细菌一般处理2hours，动物样品处理1hours。注意事项：①锇酸剧毒物质，易挥发，操作时要在毒品柜中谨慎使用。②锇酸比较昂贵，需特别节约使用。

4．漂洗：用1M PBS Buffer Ph 7.2冲洗3次，每次15mins。

5．脱水：室温下，丙酮30％－50％－70％－80％－90％每级作用30mins，纯丙酮在作用3次，每次作用30mins。

6．渗透：其目的是使包埋剂逐步渗入组织细胞内。植物样品需要的渗透梯度多、渗透时间长。其他样品可以适当减少或缩短渗透梯度和时间。以二叶龄水稻叶片为例，其渗透流程如下：无水丙酮/包埋剂＝5：1作用12hours→无水丙酮/包埋剂＝3：1作用12hours→无水丙酮/包埋剂＝1：1作用12hours→无水丙酮/包埋剂＝1：3作用12hours→无水丙酮/包埋剂＝1：5作用12hours→纯包埋剂作用45℃作用12hours。

注意事项：包埋剂为强致癌剂，特别要注意规范操作！

7．包埋：用牙签将渗透好的样品挑到包埋板中，45℃聚合12hours，60℃聚合36～48hours。

8．超薄切片：超薄切片的切片面积最大不能超过0.5mm×0.3mm，比较难切的植物样品要求切片面积更小。超薄切片是在超薄切片机上进行，但是切出比较理想的超薄切片，却是一件不容易的工作。做好需要有渗透、包埋好的包埋块，还要有好的切刀以及操作者的熟练技术等。超薄切片前期需要准备载网和支持膜、修块、制刀等，前期准备工作至少需要半天时间。超薄切片是极其精细、耗费眼力的工作，需要静下心来慢慢操作，切好一个样品至少需要1小时。

9．正染色：由于生物样品主要由碳、氢、氧、氮等轻元素组成。这些元素原子对电子的散射能力很弱，相互之间的差别也很小。尤其生物超薄切片被树脂所包埋，这些包埋树脂对电子的散射能力与样品本身差别很小。因此生物样品超薄切片观察时像的反差极弱。为了提高图像的反差，要对超薄切片进行电子染色。这里所谓电子染色是根本不同于光学显微镜的染色，它是利用重金属盐（如铅盐、铀盐等）与细胞的某些成分或结构结合，由于重金属对电子散射能力很强，使那些与其结合的结构或成份对电子散射能力增强，从而达到提高样品本身反差的。目前最常用的染色剂是醋酸铀和柠檬酸铅染色液。操作流程是：超薄切片先柠檬酸铅染色10分钟，去二氧化碳的双蒸水清洗3次，再用醋酸铀染色30分钟，双蒸水清洗3次，等超薄切片干燥后，即可上透射电镜观察。注意事项：①醋酸铀具有放射性，使用时要特别注意。②柠檬酸铅染液极易和空气中的二氧化碳反应形成不溶解的黑色颗粒，污染切片。柠檬酸铅染液一定要现用相配，所用的双蒸水一定要煮沸除去二氧化碳。③由于染色不可控制因素较多，产生污染的几率有40％，所以每个样品的切片一定要留出铜网作备份。