常规组织切片染色制作中常见问题及其解决方法

常规组织切片染色制作中常见问题及其解决方法
吕俊耀1, 于晓军1, 刘卯阳2
( 1.汕头大学医学院法医学教研室, 广东汕头515031; 2.北华大学医学院法医学教研室, 吉林吉林132003)
常规组织切片的制作过程较繁琐, 按具体制作效能分为固定、取材、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色、封片等九大步骤。

其中脱水有12 个步骤、透明有2 个步骤、浸蜡有3 个步骤、染色有23 个步骤, 一般要经过总计40～45 个步骤, 各个实验室根据自身的实际情况及工作习惯各有不同。

事实上, 从尸体储藏到切片染色的整个过程中, 任何步骤出现问题均可影响切片的质量, 因此, 要提供高质量的石蜡切片, 必须对各种潜在的影响因素严加注意, 同时, 观察组织切片时, 还应对可能出现的切片染色质量问题给予充分考虑, 以避免制片过程中的人为假象干扰而作出错误诊断。

现综合有关文献及笔者的经验, 讨论常规组织切片染色制作中常见问题及其解决方法( 表1) 。

1 固定和取材
组织切片的固定剂主要为甲醛和酒精, 固定剂可与蛋白质交联结合、使之变性, 组织硬化、结构固定,此外其本身的变性物质可与染料结合, 增强着色能力。

同时, 固定交联和沉淀蛋白质、脂肪、糖、酶等细胞内物质成分, 产生不同的折光率, 使得光学显微镜下易于更清晰地观察组织细胞的微细结构。

常见的与固定过程相关的组织切片染色问题及解决方法见表1。

在诸多影响切片质量的因素中, 尤以固定较为重要。

1.1 减少或去除组织切片中甲醛颗粒
甲醛饱和液偏酸, 影响细胞核的染色, 特别是放置较久后, 易析出沉积在组织切片中, 呈细小的黑褐色或黄黑色颗粒物, 影响观察。

以甲醛饱和液和pH7.2 的PBS 缓冲液配制的10%中性甲醛固定液( 体积比为1∶9) 应用最普遍, 效果也相对较好, 可以减少和消除甲醛颗粒。

如果现场无法配制PBS 缓冲液, 可在固定溶液中加入一些普通白粉笔, 使溶液呈中性或弱碱性。

甲醛颗粒易于出现在血液和血浆分布区, 以及自然腐败较重的组织, 可作为组织出血和血浆渗出指示剂。

1.2 防止组织固定不良
固定液过浓或过稀释, 渗透组织的能力就差, 组织固定不均匀, 出现中央区组织固定不良。

不仅取材时,组织软硬不均, 切面不平整, 影响切片时修平组织观察面, 组织固定不良还会影响脱水、浸蜡、染色等效果( 表1) 。

一般固定液与检材体积比为1∶10 左右为宜, 器官组织完全浸泡于固定液中, 固定时间3～7 d。

自溶腐败严重组织检材固定时间应适当延长几天, 或增加固定液中甲醛浓度( 可按1∶8 比例配制) 。

环境寒冷时, 亦应适当增加固定液浓度。

固定液每天浸透组织约2～3mm, 为快速完全固定组织检材, 脑、肝、肺、心、肾、脾等较大器官, 均应切开后再固定。

全脑应线绳悬吊固定( 普通病理检验, 先正中矢状切开胼胝体后固定, 可加速全脑固定) , 心应常规切开各房室腔, 肺和肾应分别从最大外缘向肺门和肾门正中切一刀, 肝、脾常规平行长轴切成2～3 cm厚片, 再予固定。

如果固定的器官较大、容器较小或固定液较少时, 应于固定3 d 内, 翻动器官或更换固定液, 以免大器官贴壁面压平和固定不良。

1.3 避免组织切片厚薄不均和不规则腔隙
取材一般在解剖之后3～7 d 进行, 取材时要刀快手稳, 切面平整, 厚度3～5mm, 避免组织块厚薄不均、观察面不平整, 检材组织块大小应略小于所选用的盖玻片1～2mm, 以便封胶完全。

组织块记号纸应为70 g以上的复印纸, 必须碳素笔标记, 以免笔迹被脱水透明掉。

组织块应流动自来水充分冲洗12 h 以上, 尽量洗掉和稀释残留的甲醛溶质和颗粒。

2 脱水、透明、浸蜡和包埋
2.1 脱水和透明
脱水和透明是影响切片质量的重要环节, 要保证脱水的彻底而又不过度。

首先要保证梯度酒精试剂的浓度、容量, 要及时更换。

脱水不彻底导致透明时无法置换组织中水分, 浸蜡不完全, 切片时组织中间出现松软空洞, 摊片时切片容易散开, 染色时易于脱片、着色不良, 蜡块缩水。

脱水时要根据不同的组织、大小、年龄, 以及动物的标本, 调整各步时间。

由于丙酮易挥发, 要经常更换, 以保持浓度。

脱水过度组织块变硬,切片时易于碎裂。

2.2 浸蜡
第一缸石蜡中加入少量二甲苯或低熔点软蜡, 最后一缸浸蜡和包埋的石蜡的熔点要相同, 不然组织与石蜡不能紧密结合, 摊片时易解离。

浸蜡的时间不宜过长, 否则易造成组织块脆硬, 切片如豆腐渣样。

2.3 包埋
包埋的石蜡应预先溶解一段时间, 以保证石蜡密度均匀, 初熔石蜡中含有杂质, 应去除沉淀或絮状杂质, 保证石蜡干净、致密, 利于切片。

应根据不同的季节调整包埋蜡的熔点, 冬季用56～58 ℃低熔点蜡, 夏秋季用60～62 ℃高熔点蜡。

包埋时蜡缸温度不超过70 ℃, 防止石蜡挥发, 污染环境。

3 切片、摊片、烤片
3.1 切片
环境温度高时, 切片前可将蜡块放入冰箱冷藏柜预冷30min。

刚包埋好的热蜡块不能立刻冷冻, 速冷会造成蜡块裂痕, 组织块易碎。

在刀架上放置组织蜡块时, 应注意组织块包埋方向、组织层次等, 使纤维和肌肉走向与切片刀刃平行, 较难切的组织部分应放在上面, 如皮肤表皮、包膜、胃肠道浆膜等, 以减少组织断裂现象。

操作切片机时应用力均匀, 避免用力过重。

脱钙的组织、骨髓, 以及钙化组织, 应选用固定刀口,以减少刀刃过多的缺口。

用毛笔展片时, 要防止笔丝进入刀口, 以免增加刀刃缺口。

为了减少刀片损耗, 修片时用已经旧刀片, 切片时用新刀片, 保持新刀片刃锋利、不粘蜡, 避免切片皱褶和刀痕。

刀刃有缺口时, 切片出现豁口, 刀刃钝时,切片皱褶、易碎, 应及时更换刀口位置或刀片。

蜡块夹不紧或刀片变钝时, 易跳刀, 应重新调整夹板或更换刀片。

切片时, 动作要轻柔, 用力均匀, 避免切片厚薄不均。

每切一个蜡块都应该把切片刀和刀架的碎片都清理干净, 避免组织间的相互污染。

如遇难切的蜡片时, 可用与蜡块切面大小相仿的薄纸潮湿后贴蜡块表面上切片, 然后将附有切片一面朝上放入水中漂片。

切片不完整、皱缩或卷片, 可能刀不快或切片角度不对, 一旦调准最佳切片角度和磨刀角度( 传统的大切片刀) 后不要随意改变。

3.2 摊片
摊片的水温一般为40～45 ℃。

摊片时动作要匀速轻柔, 避免皱褶和产生气泡。

水温过高时, 切片易离散。

出现小气泡时, 可用眼科镊尖端在水下小心地移除气
泡, 以减少脱片和组织破损的机会。

室温低时, 捞片时将载玻片放入水中片刻, 防止切片褶皱而导致脱片。

3.3 烤片
烤片温度应为70℃左右, 烤片时间不少于30min。

温度过高和时间太长, 组织易干固、皱缩, 折光增强。

4 染色、封片、归档
染色过程中, 首先应保证各种试剂的浓度、体积,不能有沉淀。

用Harris 苏木精液时, 染色前要先用一张滤纸除去液体表面的结晶, 以免污染切片。

脱蜡彻底, 不然易出现嗜碱性片状模糊, 毛玻璃样现象, 染色不均。

严格控制酒精梯度时间, 以免水分过快进入细胞, 破坏细胞结构, 影响染色效果。

染色时调节pH 值很重要, 在甲醛溶液中固定时间长的组织块, 组织酸化而影响细胞核着色, 故应自来水冲洗时间长一些或在稀氨水中处理1～2min, 以使细胞核着色较深[4]。

胞浆伊红着色不佳时, 可在伊红溶液中滴加1～2滴冰醋酸。

脱蜡之后, 在无水乙醇中时间要足够长, 以完全洗去二甲苯。

严格控制分化时间, 最好在显微镜下观察分化效果, 一般以细胞核染色清晰而细胞质基本无色为佳。

如果过分延长分色时间将导致染色太浅, 应重新染色后再行分色。

盐酸酒精分化之后冲水时间不少于5min, 尽可能洗去胞质中苏木素染液, 增强返蓝效果, 使背景不遗留过多染色。

染色过程中不要让切片干枯, 以免切片收缩、变形, 影响细胞形态。

切片经酒精脱水后, 入二甲苯时出现白色不透明状态, 脱水不彻底, 应更换酒精、二甲苯, 将切片退回无水酒精, 重新彻底脱水与透明。

透明完全的切片显得干净、透亮便于观察。

封片树胶浓度要适中, 过稀易出现大气泡、溢胶污染切片, 影响观片。

过稠易出现后薄不均、折光差, 及细小气泡。

封固过程中, 最好直接从二甲苯中取出封片,保持二甲苯不挥发, 避免组织大片破裂。

切片封固后应放置一段时间, 树胶完固后, 才能归档, 以免溢胶切片相互粘连重叠。

根据环境温湿度, 一般应放置7～15 d。

归档切片应放置干燥避光处, 避免切片褪色。

5 结束语
组织切片染色的制作步骤和影响因素繁多, 许多因素与效果的关联性重叠, 不易简单确定那一个步骤出现问题, 所以, 必须认真对待每一个步骤环节, 严格按照要求操作, 才能制作出合格的常规HE 染色切片。