07 生物催化剂的改造-酶定向进化

须尽可能地把各种突变基 因包含在其中，并且能够完整地序列的完整性。
反复重复2-4步后，可获得全长DNA片段
其基本操作过程：
1）靶基因经随机突变产生含不同突变类型的亲本 基因群, 用DNase I 随机切割; 2）得到的片段经过不加引物的多次PCR 循环, 在 该过程中, 这些片段之间互为引物和模板进行扩增, 直至获得全长基因; 3）再加入基因的两端引物进行常规PCR, 最终获得 发生改组的基因库。
此方法又称为有性PCR ( Sexual PCR) , 通过将亲本基因 群中的突变尽可能组合在一起, 以导致更大的变异, 最终获 得具有最佳突变组合。
1994年由Stemmer等人首次提出，使用该技术使β-内酰 胺酶定向进化，催化效率提高32000倍。
DNA 重组装原理图 （DNA shuffling）
定向进化
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学习重点
定 概念及本质 向 方法（原理） 进 亲本酶的选择原则
进化策略
化 高通量筛选方法
为什么要定向进化？
一般情况下, 一个目的基因通过易错PCR引起的错配 碱基数目控制在2-5个。
易错PCR特点
操作简便因片段( < 800bp) 的定向进化
。
二、DNA 重排技术
DNA 重排（DNA shuffling）技术又称DNA改组技术， 是从两种以上的同源正突变基因出发，用酶切成随机片段， 经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新 排布而引起基因突变的技术过程。
特性，方法有基因组重排技术等。 基因组重排技术通过把诱变与细胞融合技术
相结合，对细胞进行基因组重排，从而大幅度增 加细胞的正突变频率。
酶分子定向进化 是模拟自然进化过程（随机突变和自然选择），
在体外得到具有优良催化特性的酶的突变体的技术过 程。 简称酶定向进化
目标分子的结构、功能和特性，主要包括：
酶分子定向进化 蛋白质定向进化 核酸分子定向进化
分子定向进化 分子定向进化首先要通过从细胞内提取或者
通过PCR等方法获取目标分子的基因，在体外采用 易错PCR,DNA重排，基因家族重排等技术进行人工 突变，然后进行定向选择而获得所需突变体。
细胞定向进化 以细胞为进化对象，目的是改良细胞的各种
定向进化= 随机突变+ 选择 定向进化的基本规则是, 获取你所筛选的突变体
定向进化虽然人工模拟自然进化, 但两者却 不相同:
1 进化动力不同。 2 进化方向不同。 3 进化速度不同。 4 进化目标不同。
定向进化按照对象不同分为： 分子定向进化和细胞定向进化等。
分子定向进化 以各种生物大分子为进化对象，目的是改良
3、基因家族重排技术
基因家族重排技术（gene family shuffling）又 称为基因家族改组技术，是从基因家族的若干同 源基因出发，用酶（NDaseⅠ）切割成随机片段， 经过不加引物的多次PCR循环,使DNA的碱基序列 发生重新排布而引起基因突变的技术过程。
DNA shuffling
1993年，美国科学家Arnold F H首先提出酶分子的定向进化 的概念，并用于天然酶的改造或构建新的非天然酶。
酶定向进化示意图
酶定向进化的基本过程
主要内容
1
第一节 酶基因体外随机突变三节 酶分子定向进化的应用
第一节 酶基因体外随机突变
基因体外随机突变方法的特点1.的包容性 突变基因的包容性是变信息，包 括正突变、负突变和中性突变，以尽可能完整地反映基因的结构和功能信息， 以便通过筛选得到的突变基因能够通过表达获得 完整的具有催化功能的进化酶。
一、易错PCR技术
易错PCR技术(Error prone PCR)是指从酶的单一基因出发， 在改变反应条件的情况下进行聚合酶链反应（PCR）, 使扩 增得到的基因出现碱基配对错误, 从而引起基因突变的技术 过程。
1.易错PCR反应过程 1）双链DNA变性：85-95℃ 2）引物与单链DNA退火结合：50-70℃ 3）引物延伸：70-75℃
何特点？
应用过程对酶的要求
在酶催化过程的研究和应用过程中，人们总是 期望酶的活力和稳定性越高越好，并具备良好的 催化性能：能在非水溶剂、极端温度和pH等特殊 条件下催化反应，尤其重要的是能接受自然界中 不存在的各种底物。
正是由于天然酶的性质与实际应用过程中人们对 酶的期望之间的巨大差距，使对天然酶在分子水 平上进行改造显得十分重要和迫切。
从目前的情况来看，具有新功能和特性的酶可以 通过从大量未知的自然种系中寻找以及对现有的 天然酶进行改造，其中对于在自然进化过程中没 有经过特性和功能选择的酶而言，对现有的天然 酶进行改造比大量筛选可能更加合适。
对酶进行改造的理论基础: 无数的研究工作已经表明，酶分子内某些氨基
酸残基的微小改变可使酶的催化能力和立体选择 性产生很大的改善。
（1）依据细胞生长情况筛选突变基因
热稳定性：温度梯度和高温环境 抗生素耐受性：抗生素浓度梯度 pH稳定性：pH梯度 极端环境：高盐、低温、高浓度物质
（2）依据颜色变化筛选突变基因 反应产物显色
（3）依据透明圈情况筛选突变基因
重点
1、何谓酶的定向进化？有何特点？ 2、定向进化各种方法的主要过程 3、简述突变基因定向选择的基本过程。 4、突变基因的高通量筛选技术主要有哪些？各有
生物体系之所以能够相对独立地存在于自然界中 ，并维持其独立性和生命的延续性，都是因为生 物体内的一系列酶在发挥着作用。
酶保证了生物体内组成生命活动的大量生化反应 得以按照预定的方向有序、精确而顺利地进行， 几乎所有生物的生理现象都与酶的作用紧密相关 ，可以这样说，没有酶的存在，就没有生物体的 一切生命活动。
易错PCR示意图
易错PCR, 遗传变化只发生在单一分子内部, 所以属于无性 进化（asexual evolution）。
采用易错PCR时，要控制好适当的突变频率。
当突变频和中性突变。
但突变率也不能太低, 否则未发生突变的野 生型将占据突变群体 的优势, 也很难筛选 到理想的正突变体.
根源: 天然酶的局限性源于酶的自然进化过程。
天然酶的进化过程:
在自然进化过程中，进化保证了酶对环境任何 改变的适应能力，但是自然进化既没有特定的方 向，也没有特定的目标，它是在整个生物的繁殖 和生存过程中自发进行.
酶的进化主要不是表现为某个酶分子的活力和 稳定性的不断提高，而是在于生物整体的适应能力 、调控能力的增强，因此，通常只要求酶在生物体 内对特定的生物学功能有专一性。
遗憾的是，由于技术的限制，酶分子中氨基酸残 基与它的空间结构以及结构—功能之间相互关系 等信息严重匮乏，加上这些关系又非常复杂，迄 今为止，人们对它们的理解和认识仍然非常肤浅
非常有研究意义和应用前景
定向进化
模拟自然进化的过程，进行人工随机突变，并在特 定的环境条件下进行选择，使进化朝着人们所需要 方向发程主要包括：
载体的选择 基因重组 形成基因等二、突变基因的筛选 根据定向进化的目的要求，在一定）定向选择环境条件的设定 根据定向进化的目的设定选择环境 在每一次“突变-筛选”的循环中加以调整选择环境 （1）提高酶的热稳定性： 较高温度下培养重组细胞，每次循环提高温度。 （2）提高β-内酰胺酶的催化效率： 一定浓度的β-内酰胺类抗生素中培养，每次提高浓度。
（二）高通量筛选技术
高通量筛选技术要求
通量大、效率高，在较短时间内简便的判断出正 突变基因，并易于排出那些无效的突变基因。
常用高通量筛选方法
平板筛选法 荧光筛选法 噬菌体表面展示法 细胞表面展示法 核糖体表面展示法
1、平板筛选法 平板筛选方法是将含有随机突变基因的重组细胞，
涂布在平板培养基上，在一定条件下培养，依据重 组菌细胞的表型鉴定出有效突变基因的筛选方法。 特点：简便、快速、直观、容易控制和调整环境条 件。 依据：重组细胞的表型 细胞生长情况 颜色变化情况 透明圈情况
酶的工业应用: 利用酶作为催化剂进行生物催化与生物转化，
已成为生产精细化学品、手性药物、食品添加剂 等的重要工具,获得了广泛应用。
天然酶的局限: 随着酶催化应用范围的不断扩大和研究的逐步
深入，研究者已经越来越发现，现有的天然酶的 催化特性常常不能很好地满足酶学研究和工业化 应用的要求。
主要原因： 1 、天然酶的稳定性差、对某些底物的催化活性 低，以及缺乏有商业价值的催化功能及其他性质 2 、越来越多的情况需要一些酶催化很多在自然 界中并不存在的各种底物来完成特定的反应过程
当以单一的酶分子 基因进行定向进化 时, 基因的多样化 起源于易错PCR 等 反应中产生的随机 突变, 所以采用这 种过程累积有益突 变的速度比较慢。
Family shuffling
从自然界中存在的基因 家族出发, 利用它们之间 的同源序列进行DNA 改组。 由于每一个天然酶的基因 都经过千百万年的进化, 并且基因之间存在比较显 著的差异, 所以获得的重 组基因库充分体现了基因 的多样化，排除了不必要 的突变，大大加速了基因 的体外进化速度。
第二节 酶突变基因的定向选择
酶基因突变的定向选择是在人工控制条件的特殊环境下， 按照人们所设定的进化方向对突变基因进行选择，以获得 具有优良催化特性的酶种不同的突变基因与 载体重组，再转入适宜的细胞或包装成重组λ噬 菌体的技术过程。
2.易错PCR反应条件 1）Mg2+浓度较高，以稳定非互补的碱基对。普通PCR Mg2+浓度0.5-2.5mmol/L，易错PCR提高Mg2+浓度。 2）添加Mn2+，以降低聚合酶对模板的特异性。 3）4种底物的浓度比改变，即采用浓度不平衡的各种底物， 使碱基配对错误出现频率增加。