免疫印迹技术ANA谱测定
免疫印迹法检测可提取性核抗原多肽抗体谱的临床应用
免疫印迹法检测可提取性核抗原多肽抗体谱的临床应用刘靳波;梁军;陈红英;温向琼【期刊名称】《中华医学写作杂志》【年(卷),期】2004(011)015【摘要】目的：探讨ENA多肽抗体谱在自身免疫性疾病临床诊疗中的作用。
方法：应用免疫印迹技术(IBT)对临床常见的6种自身免疫性痰病132例进行了抗ENA抗体检查，同时观察了间接免疫荧光法检查抗核抗体(IFANA)的结果。
结果：132例送检标本抗ENA多肽抗体谱总阳性率64．4％，且检出一种或一种以上抗ENA 抗体，系统性红斑狼疮(SLE)35例(77．8％)，多发性皮肌炎／皮肌炎(PM／DM)8例(42．1％)。
系统性硬皮病(PSS)5例(50％)，干燥综合征(SS)14例(87．5％)，混合性结缔组织病(MCTD)19例(100％)，类风湿性关节炎(RA)5例(20．8％)。
IFANA总阳性率71％。
结论：ENA多肽抗体谱检测对多种自身免疫性疾病的诊断和鉴别诊断有重要意义，ANA检测仍可作为自身免疫性疾病筛查的常规指标。
【总页数】3页(P1272-1274)【作者】刘靳波;梁军;陈红英;温向琼【作者单位】泸州医学院附属医院儿科;泸州医学院附属医院检验科，泸州市646000;泸州医学院附属医院肾病内科，泸州市646000【正文语种】中文【中图分类】R446【相关文献】1.自动蛋白印迹仪在检测抗可提取核抗原多肽抗体谱中的应用 [J], 钟丽民;方忠俊;周丽萍;邹广珠2.免疫印迹法检测可提取核抗原多肽抗体谱的临床应用分析 [J], 陆瑜;叶萍;沈霞;陈顺乐3.免疫印迹法检测可提取核抗原多肽抗体的评价 [J], 朱钰钰;甘小丹4.149例系统性红斑狼疮患者核抗原多肽抗体谱的检测 [J], 李月文;金淑仙5.免疫印迹法检测系统性红斑狼疮患者血清中ENA多肽抗体谱的探讨 [J], 游正芸;洪华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
实验报告三--免疫印迹
实验三：免疫印迹1 原理免疫印迹又称Western印迹(Western blotting)，与DNA的Southern印迹技术相对应，两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为NC膜)，然后用探针检测特异性组分。
不同的是，Western blotting所检测的是抗原类蛋白质成分，所用的探针是抗体，它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。
该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点，具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测，以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。
该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。
目前，Western blotting广泛用于蛋白质研究、基础研究和临床医学的研究。
免疫印迹可分成两个步骤：蛋白质由凝胶转移至固相基质；特异性抗体检测。
蛋白质转移通常由电泳实现，现常用的方法有二：1 半干法：将凝胶和固相基质似三明治样夹在缓冲液湿润的滤纸中间，通电10-30分钟可完成转移；2 湿法：将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电45分钟或过夜课完成转移。
本试验采用湿法转移。
免疫印迹用膜通常有硝酸纤维素膜和尼龙膜两种。
大多数应用前者。
本实验也用硝酸纤维素膜进行转移。
转移结束后，蛋白质的检测可分成三个步骤进行：首先，将膜同特异性抗体孵育数小时或过夜，然后将膜同可特异性识别上述抗体（一抗）的第二抗体（二抗）孵育，通常二抗连接有如辣根过氧化物酶等标记物。
目的蛋白可由该酶催化的显色反应在膜上形成有色产物加以检测。
本实验用的是酶标抗IgG，故不加一抗。
2 试剂与仪器2.1 试剂（所有试剂均供两组用）2.1.1 转移缓冲液Tris 3.025g甘氨酸14.413g甲醇20mL加蒸馏水约800mL，调pH至8.3，定容1000mL2.1.2 Tris缓冲盐溶液(TBS)Tris 2.42gNaCl 27.750g加蒸馏水约800mL，调pH至7.5，定容1000mL2.1.3 TTBSTBS 800mLTween-20 400μl2.1.4 封闭液及抗体稀释液脱脂奶粉0.3gTBS 100mL2.1.5 底物溶液二氨基联苯胺（DAB） 5.0mgTBS 18mLH2O220μl 临用前配2.1.6 丽春红总蛋白质染色液丽春红1g4%乙酸100mL2.1.7 5%小牛血清生理盐水小牛血清7.5mL0.85%生理盐水定容至150mL2.1.8 酶标抗IgG（1：1500）酶标抗IgG 0.1mL5%小牛血清生理盐水定容至150mL2.2 仪器夹心式电泳槽，电泳仪，硝酸纤维素膜，直径9cm培养皿，剪刀，镊子，刀片，微量移液枪，普通滤纸3 试验步骤3.1 SDS-PAGE电泳分离所需试剂、仪器以及分离步骤完全与实验六相同，故此处从略。
欧蒙免疫印迹法（ANA谱3）模条本底颜色变深对结果影响2例分析
检测项目 病例 1 病例 2
ANA(S) ＜1:100 1:640
ANA核型 阴性 均质
表 1 2病例实验室检查结果
dsDNA(IU/mL) dsDNA荧光
4.58 633.34
阴性 强阳性
G(g/L) 64.3 37.6
IgG(mg/dL) -
2580
肝纤 4项 ↑ -
通讯作者：李 发 爵
有些研究中!在深色背景下!只要能观察到特 异性抗原位置条带阳性!均可视为明确阳性%若背 景颜色过深而严重影响到结果判读! 则样本不适 用于该检测体系!可考虑采用其他的检测方法(如 '3BD:)进行检测& 但本研究中血清稀释法再加上 BBC 作为补充也不失为一种简便易行的方法& 由于 观察样本例数有限! 在今后的工作中增加观察例 数及与临床的结合! 以对此类问题有一个比较全 面的了解& 参考文献
+530+
实验与检验医学 !"!# 年 $ 月第 %& 卷第 % 期 '()*+,-*./01 0.2 3045+0/5+6 7*2,8,.*9 :;<=!"!#9>51=%&9?5=%
·病例报告·
欧蒙免疫印迹法（ANA谱 3）模条本底颜色变深对 结果影响 2例分析
章晓霞 1，李发爵 2，李湘成 3，陈民 2，苏悦 2，付红 2，彭丽平 2，梁小燕 2
!"&M#N&&$"%D$&"= @MB魏 方=抗 核 抗 体 与 抗 &验 与 检 验 医
学 !""N !C & M&DM!= (收稿日期 2021-02-22Q
ANA谱检测及其意义
ANA谱汇总抗U1-n RNP抗体：高滴度的该抗体是混合性结缔组织病（MCTD，夏普综合征）的标志，阳性率为95—100%，抗体滴度与疾病活动性相关。
在30—40%的系统性红斑狼疮患者中也可检出该抗体，但几乎总是有抗Sm抗体。
抗Sm抗体：系统性红斑狼疮的特异性抗体，与抗ds DNA抗体一起，是系统性红斑狼疮的诊断标志。
但阳性率仅为5—10%。
抗SS-A抗体：与各类自身免疫性疾病相关，最常见于干燥综合征（40—80%）、也见于系统性红斑狼疮（30—40%）和原发性胆汁性肝硬化（20%）中，偶见于慢性活动性肝炎。
此外，在100%的新生儿红斑狼疮中抗SS-A抗体阳性。
该抗体可经胎盘传给胎儿引起炎症反应和新生儿先天性心脏传导阻滞。
抗SS-B抗体：几乎仅见于干燥综合征（40—80%）和系统性红斑狼疮（10—20%）的女性患者中，男女比例为：1∶29。
在干燥综合征中抗SS-A抗体和抗SS-B抗体常同时出现。
抗Scl-70抗体：见于25—75%的进行性系统性硬化症（弥散型）患者中，因实验方法和疾病活动性而异（Scl=硬化症）。
在局限性硬化症中不出现。
抗PM-Scl抗体：常见于多肌炎与硬化症的重叠综合征中，50%的该抗体阳性患者为肌炎与硬化症的重叠综合征，抗PM-Scl抗体也可见于单独的多肌炎患者中，阳性率为8%，在弥散型硬化症中的阳性率为2—5%。
抗Jo-l抗体：见于多肌炎，阳性率为25—35%。
常与合并肺间质纤维化有关。
抗着丝点抗体：与局限型进行性系统性硬化症（CREST综合征：钙质沉着、Raynaud＇s病、食管功能障碍、指硬皮病、远端血管扩张）有关，阳性率为70—90%。
在原发性胆汁性肝硬化患者中也可检测到该抗体（阳性率为10—30%）。
还可出现于雷诺氏综合征中。
抗PCNA抗体：PCNA为增殖性细胞核抗原，其表达与细胞周期有关。
抗PCNA抗体为系统性红斑狼疮的特异性抗体，但阳性率仅为3%。
有文献报道，抗PCNA抗体可能与系统性红斑狼疮患者发展为弥散性增殖性肾小球肾炎有关。
ana谱检查报告怎么看
ana谱检查报告怎么看当我们拿到一份 ana 谱（抗核抗体谱）检查报告时，可能会感到一头雾水，不知道如何解读其中的各项指标和结果。
别担心，接下来我将用通俗易懂的方式为您详细介绍如何看懂 ana 谱检查报告。
首先，我们来了解一下什么是 ana 谱检查。
抗核抗体谱是一组针对细胞核内各种成分的自身抗体的检测，它对于诊断自身免疫性疾病具有重要的意义。
常见的自身免疫性疾病包括系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、干燥综合征、系统性硬化症等等。
在 ana 谱检查报告中，通常会包含多种抗体的检测结果。
其中一些常见的抗体有抗双链 DNA 抗体（dsDNA）、抗 Sm 抗体、抗 RNP 抗体、抗 SSA 抗体、抗 SSB 抗体等等。
先来说说抗双链 DNA 抗体。
如果这个抗体呈阳性，尤其是高滴度阳性，那么对于系统性红斑狼疮的诊断具有较高的特异性。
但需要注意的是，有时候其他疾病也可能会导致这个抗体出现低滴度的阳性。
抗 Sm 抗体对于系统性红斑狼疮的诊断也非常特异，如果检测出这个抗体阳性，往往提示患有系统性红斑狼疮的可能性较大。
抗 RNP 抗体阳性，在混合性结缔组织病中较为常见，但在其他一些自身免疫性疾病中也可能会出现。
抗 SSA 抗体和抗 SSB 抗体与干燥综合征密切相关。
如果这两个抗体阳性，再结合患者的口干、眼干等症状，医生会考虑干燥综合征的诊断。
除了关注抗体是否阳性，抗体的滴度也非常重要。
一般来说，滴度越高，提示疾病的可能性越大，但这也不是绝对的，还需要结合患者的具体症状、体征以及其他检查结果来综合判断。
此外，ana 谱检查报告中还可能会有一些其他的指标，比如核型。
常见的核型有均质型、斑点型、周边型等等。
不同的核型可能提示不同的疾病倾向，但同样不能仅凭核型就做出诊断。
当我们拿到报告后，首先要看清报告上的各项指标名称和对应的结果。
如果是“阳性”，要注意后面标注的滴度值。
同时，要将报告拿给医生进行解读。
医生会综合考虑患者的症状、病史、体格检查以及其他相关的检查结果，比如血常规、尿常规、肝肾功能、免疫球蛋白等等，来做出最终的诊断。
免疫印迹法
自身免疫性疾 病的筛选试验 ANA检测
（－）
SLE治疗缓解
病情特重（大量IC沉积消耗抗体）
（＋）低滴度 高滴度 常见于RA等其它自身免疫性疾病 可作为诊断SLE的依据
ENA抗帮助诊断SLE
硬皮病 PM/DM 干燥综合症 抗AMA-M2：PBC
确诊试验
抗dsDNA、Sm、rib抗体
抗Scl-70 抗Jo-1抗体 抗SSA和抗SSB 胞浆自身抗体
自身免疫性疾病检测的应用原则
免疫球蛋白、 补体等检测
+
ANA筛选
抗胞浆型抗体鉴定
ENA抗体谱
其它自身抗体
怀疑自身免疫性疾病
怀疑系统性自身免疫疾病
怀疑器官特异性自身免疫疾病
类风湿因子、抗中性粒细 胞胞浆抗体、抗磷脂抗体 及其它自身抗体检测
④ 加入酶标二抗反应
③ 洗去未反应蛋白 ② 加入标本反应
E ENA检测方法 E
自身抗体
非特异 蛋白
① 纯化抗原膜条（膜条试剂盒）
临床常检测的抗ENA抗体谱主要包括： 抗U1-RNP 抗Sm 抗SSA 抗SSB 抗Scl-70 抗Jo-1 抗rib-P蛋白
抗可提取性核抗原（ ENA ）抗体 anti-extractable nuclear antigen antibodie
SS？
雷诺现象 干燥综合征？ 面肌痉挛，神经痛 睡眠障碍，头痛
1:3200颗粒型
1:1000颗粒型着丝点 型 1:320颗粒型 1:100颗粒型 1:100胞浆型
高效价斑点型常见于MCTD
核膜型（或周边型）
相关抗体：抗dsDNA抗体 与胶原病、PBC、慢性活动性肝炎等相关
核仁型
相关抗体：抗RNA聚合酶-1抗体、抗SCL-70抗体 与硬皮病相关
免疫荧光检测
免疫荧光技术（检测抗核抗体（ANA）的实验方案）荧光免疫技术是以荧光物质标记的特异性抗体或抗原作为标准试剂，用于相应抗原或抗体的分析鉴定和定量测定。
荧光免疫技术包括荧光抗体染色技术和荧光免疫测定两大类。
荧光抗体染色技术是用荧光抗体对细胞、组织切片或其他标本中的抗原或抗体进行鉴定和定位检测，可在荧光显微镜下直接观察结果，称为荧光免疫显微技术，或是应用流式细胞仪进行自动分析检测，称为流式荧光免疫技术。
荧光免疫测定主要有时间分辨荧光免疫测定和荧光偏振免疫测定等。
本次实验以荧光免疫显微技术检测抗核抗体(ANA)为例进行实习。
抗核抗体(antinuclear antibody，ANA)又称抗核酸抗原抗体，是一组将自身真核细胞的各种成分脱氧核糖核蛋白(DNP)、DNA、可提取的核抗原(ENA)和RNA等作为靶抗原的自身抗体的总称，能与所有动物的细胞核发生反应，主要存在于血清中，也可存在于胸水、关节滑膜液和尿液中。
抗核抗体实验原理以小鼠肝细胞或某些培养细胞(如Hep-2)作抗原片，将病人血清加到抗原片上。
如果血清中含有ANA，就会与细胞核成分特异性结合。
加入荧光素标记的抗人IgG抗体又可与ANA结合，在荧光显微镜下可见细胞核部位呈现荧光。
试剂与器材1．抗原片现多用商品试剂。
如需自行制备，方法如下：(1)肝印片制备：取4-8周龄小鼠，断颈杀死后，剖腹取肝。
将肝脏剪成平面块，用生理盐水洗去血细胞，用滤纸吸干渗出的浆液。
将切面轻压于载玻片上，使其在载玻片上留下薄层肝细胞。
冷风吹干，乙醇固定，冰箱可保存1周。
(2)Hep-2细胞抗原片制备：Hep-2细胞是建株的人喉癌上皮细胞。
经适宜培养在载玻片上形成单层细胞抗原片，用洗涤洗去培养基。
干燥后，用无水乙醇固定。
(3)肝切片制备：取小鼠肝组织作冰冻切片，厚4μl。
-30℃保存备用。
2．异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗人IgG抗体(FITC-抗人IgG抗体)有商品供应，临用时按效价稀释。
ANA谱3在自身免疫性疾病诊治中的临床应用
• 论 著 •215[15] 薛桥,王士雯,翟金月,等.国产伊贝沙坦与进口缬沙坦降压疗效的比较[J].中华老年心脑血管病杂志,2001,3(6):431.[16] 凌左明,陶绕生.缬沙坦治疗原发性高血压临床对比观察[J].药物流行病学杂志,2003,12(6):297-298.[17] 夏志勇.非洛地平缓释片并缬沙坦治疗老年高血压的临床观察[J].心血管康复医学杂志,2005,14(6):567-569.[18] 郑东诞,曾群英,王强,等.伊贝沙坦与缬沙坦治疗高血压病的疗效和安全性的临床研究[J].中西医结合心脑血管病杂志.2005,3(10):851-853.[19] 孙志刚,郭方明,杨国宽,等.缬沙坦治疗海员高血压的临床研究[J].中华航海医学与高血压医学杂志,2004,11(3):178-179.[20] 关红梅,杜玉彬,韩丽平,等.缬沙坦治疗原发性高血压的临床观察[J].心血管康复医学杂志,2004,13(1):61-62.[21] 杨昌民,张允霞.缬沙坦联合药物治疗原发性高血压的临床观察[J].山东医药,2004,44(25):26.[22] 林阳,白树功,朱小玲,等.厄贝沙坦治疗轻中度原发性高血压的临床研究[J].中国现代应用药学杂志,2003,2O (6):517-519.[23] 李伟,许波宁.贝那普利与缬沙坦合用治疗轻中度原发性高血压的临床观察[J].辽宁药物与临床,2003,6(2):71-72.[24] 范毅敏,曾群英,麦炜颐,等.A C E I 与A Tl 受体拮抗剂合用治疗轻中度原发性高血压的临床观察[J].国外医学.心血管疾病分册,2002,29(2):112-115.[25] 张云,李石,郭冀珍,等.国产缬沙坦治疗原发性高血压病的疗效和安全性评价[J].中国新药杂志,2001,10(5):363-365.[26] 王高频,陆红.缬沙坦与依那普利治疗原发性高血压70例[J].中国新药杂志,2001,10(5):374.[27] 曾群英,麦炜颐,何清,等.两种A T1拮抗剂治疗轻中度原发性高血压的临床研究[J].中国临床药理学杂志,2001,17(3):182-185.[28] 魏广和,高东升,张金国,等.缬沙坦和苯那普利治疗高血压病的临床对照研究[J].济宁医学院学报,2000,23(3):28-29.[29] 曾群英,麦炜颐,何清,等.缬沙坦治疗轻、中度原发性高血压的临床研究[J].新医学,2000,31(12):716-718.[30] 吴洪德.缬沙坦治疗轻中度高血压病的临床疗效[J].中国航天工业医药,2004,2(4):29-31.ANA谱3在自身免疫性疾病诊治中的临床应用陈效琴（广元市中心医院检验科，四川 广元 628000）【摘要】目的 讨论ANA 谱3检测在自身免疫性疾病诊治中的临床应用。
ANA谱（1）
抗核抗体（ANA）谱日期:2007-10-03 来源: 转载作者:管理员抗核抗体（antinuclear antibodies;ANA）是一组对细胞核内的DNA，RNA，蛋白或这些物质的分子复合物的自身抗体。
按其核内各个分子的性能不同可将各ANA区分开来，如：抗DNA抗体、抗组蛋白抗体、抗非组蛋白抗体、抗核仁抗体等。
每一大类又因不同抗原特性而再分为许多种类。
因此ANA在广义上是一组各有不同临床意义的自身抗体，更确切的名称应为抗核抗体谱。
ANA 主要存在于风湿病，是风湿病常用的筛查项目。
测定本抗体的方法有间接免疫荧光法（IFA）、放射免疫法（Farr法）、ELISA、血凝法等，我国的临床工作者多采用前两种方法，尤其是IFA法，免疫荧光法测定杭核抗体常见有以下几种图形：（1）均质型：核质染色均匀一致，这种染色型常与抗组蛋白和抗DNA抗体有关；（2）斑点型：核质染色呈斑点状，抗可提取性核抗原（ENA）抗体常呈这种染色型；（3）周边型：荧光染色围绕在核膜周围，它与抗DNA抗体有关；（4）核仁型：仅有核仁染色，具有抗4-6sRNA抗体呈现这种染色型；（5）着丝点型：在体外培养的细胞株（喉癌细胞）在核分裂相期时，可见到荧光染色的着丝点排列成特殊图型，而在鼠肝做底物中看不到此类图型，而被遗漏。
抗核抗体的分类由于核抗原不同，有多种不同的ANA1、抗DNA抗体：抗DNA抗体有抗双链DNA（ds-DNA）和抗单链(ss-DNA)抗体之分。
抗ds- DNA 抗体与SLE的关系密切，且随疾病的活动度而升降，病情好转者其滴度多下降甚或转阴。
抗ss- DNA抗体则与抗ds-DNA不同，可在多种疾病出现，包括一些非自身免疫性疾病，如细菌和病毒感染，故在临床上实用价值不大。
而抗ds-DNA抗体被认为是SLE所特有。
抗DNA的自身抗体在SLE发病中起一定作用。
在一些SLE患者，DNA大分子存在于循环中或粘附于多种器官的微血管结构，这些循环或器官原位抗原型DNA均可与循环自身抗体发生反应，形成免疫复合物，激活炎症系统，在一些器官如肾脏，肺和脑组织引起免疫复合物介导的疾病，导致组织损伤。
欧蒙抗核抗体谱ANA谱3临床意义
【项目名称】抗核抗体谱（ANA）『项目包含』nRNP/Sm、Sm、SS-A、Ro-52、SS-B、Scl-70、PM-Scl、Jo-1、CENP B、PCNA、dsDNA、核小体、组蛋白、核糖体P蛋白、AMA M2，共15项。
『检测方法』欧蒙印迹法『检测样本』人血清或（经EDTA、肝素或柠檬酸盐抗凝的）血浆。
『临床意义』抗nRNP抗体：高滴度的抗U1-nRNP抗体是混合性结缔组织病（MCTD，夏普综合征）的标志，阳性率为95-100%，抗体滴度与疾病活动性相关，在30-40%的系统性红斑狼疮患者中也可检出抗U1-nRNP抗体，但几乎总伴有Sm抗体。
抗Sm抗体：抗Sm抗体是系统性红斑狼疮的特异性抗体，与抗dsDNA抗体一起，是系统性红斑狼疮的诊断指标，但阳性率仅为5-10%。
抗SS-A抗体：与各类自身免疫性疾病相关，最常见于干燥综合征（40-80%）、也见于系统性红斑狼疮（30-40%）和原发性胆汁性肝硬化（20%）中，偶见于慢性活动性肝炎。
此处，在100%的新生儿红斑狼疮中抗SS-A抗体阳性。
该抗体可经胎盘传给胎儿引起炎症反应和新生儿先天性心脏传导阻滞。
抗Ro-52抗体：与其它抗体（如：SS-A）同时出现时则高度提示（SS-A）的相关疾病。
抗SS-B抗体：几乎仅见于干燥综合征（40-80%）和系统性红斑狼疮（10-20%）的女性患者中，男女比例为1：29。
在干燥综合征中SS-A抗体和抗SS-B抗体常同时出现。
抗Scl-70抗体：见于25-75%的进行性系统性硬化症（弥散型）患者中，因实验方法和疾病活动性而异（Scl=硬化症），在局限型硬化症患者中未检出该抗体。
抗Jo-1抗体：见于多肌炎、阳性率为25-30%。
常与合并肺间质纤维化相关。
抗着丝点抗体（CENP B）：与局限型进行性系统性硬化症（CREST综合征：钙质沉着、Raynaud病、食管功能障碍、指硬皮病、远端血管扩张）有关，阳性率为70-90%。
ana检测方法
ana检测方法
ANA（抗核抗体）是一种自身免疫性疾病的重要指标，其检测方法对于诊断和治疗自身免疫性疾病具有重要意义。
目前常见的ANA检测方法包括间接免疫荧光法、酶联免疫吸附试验、间接免疫吸附法等。
下面将对这些方法进行详细介绍。
首先，间接免疫荧光法是目前最常用的ANA检测方法之一。
它通过检测患者血清中是否存在抗核抗体，从而判断是否存在自身免疫性疾病。
该方法操作简单，结果准确可靠，是临床上常用的首选方法之一。
其次，酶联免疫吸附试验（ELISA）也是一种常用的ANA检测方法。
该方法通过将患者血清中的抗核抗体与特定的酶标记抗体结合，然后用底物显色测定酶的活性，从而判断抗体的存在与否。
ELISA方法操作简便，且可以同时进行多个样本的检测，因此在临床上也得到了广泛的应用。
另外，间接免疫吸附法也是一种常见的ANA检测方法。
该方法通过将患者血清中的抗核抗体与抗人球蛋白抗体结合，然后用酶标记的抗人球蛋白抗体检测抗体的存在与否。
该方法操作简单，结果准确可靠，适用于大规模的样本检测。
除了上述方法外，还有一些新型的ANA检测方法正在不断发展和完善，如流式细胞术、固相化学发光法等。
这些新方法在提高检测灵敏度、减少假阳性率等方面具有一定的优势，但仍需要进一步的临床验证和应用。
综上所述，目前常见的ANA检测方法包括间接免疫荧光法、酶联免疫吸附试验、间接免疫吸附法等，它们各有优势和局限性。
在临床应用中，应根据具体情况选择合适的检测方法，以确保诊断的准确性和可靠性。
随着科学技术的不断进步，相信会有更多更准确的ANA检测方法出现，为自身免疫性疾病的诊断和治疗提供更好的帮助。
10772例患者抗核抗体谱检测结果的回顾性分析
临床医学研究与实践2021年2月第6卷第6期调查分析DOI :10.19347/ki.2096-1413.202106002作者简介：秦妍妍（1982-），女，汉族，河北沧州人，副主任检验师，博士。
研究方向：临床检验。
*通讯作者：杨延敏，E -mail :yanminyang@.近年来，随着人们生活方式的改变，自身免疫性疾病（autoimmune disease,AID ）等一些慢性病的发病率呈逐年升高的趋势。
自身抗体是AID 的重要标志，每种AID 都伴有特征性的自身抗体谱，高效价自身抗体也是临床确诊该病的重要指标。
自身抗体检测在诊断AID 、判断疾病活动程度、观察治疗效果、指导临床用药等中具有重要的临床意义[1-2]。
自身抗体先于临床症状出现前若干年就已经出现在患者血清中[3]，这对患者的早期诊断、早期干预、早期治疗、提高预后及生存质量有至关重要的意义。
抗核抗体（ANA ）作为自身抗体最主要的一个成员，是一个很好的筛查项目，在大多数确诊的AID 患者中都能检测到高滴度的ANA [4]，因此ANA 在AID 检测中一直有着无可替代的作用，基于此，笔者对我院2017年6月至2019年12月进行ANA 谱检测的10772例患者的结果进行回顾性分析，以期了解ANA 谱筛查检测的重要性。
1资料与方法1.1一般资料回顾性分析本院2017年6月至2019年12月门诊和住院部进行ANA 谱检测的10772例患者的临床资料，其中女性患者6041例，年龄10~104岁，中位数61（50，73）岁；男性患者4731例，年龄15~101岁，中位数63（54，74）岁。
排除重复送检的患者标本。
所有标本均为患者的空腹静脉血，并经过了离心、分离处理，得到血清。
1.2方法采用抗核抗体谱IgG 检测试剂盒（欧蒙免疫印迹法）及欧蒙全自动免疫印迹仪EUROBlotOne 进行检测。
可检测抗nRNP/Sm 抗体、抗Sm 抗体、抗SSA 抗体、抗Ro-5210772例患者抗核抗体谱检测结果的回顾性分析秦妍妍，杨延敏*（北京丰台医院检验科，北京，100070）摘要：目的探讨抗核抗体（ANA ）谱检测结果及筛查的意义。
抗核抗体谱(ANA意义)
(二).抗组蛋白抗体：具有H1、H2A、H2B、H3和H4四个亚单位，常以四聚体形式存在,与DNA构成的复合物称为染色质,染色质最基本的单位是核小体(nucleosome).所有组蛋白各成分均可能成为自身抗体的靶抗原.1.SLE的阳性率约30%-80%,并常伴有抗dsDNA抗体阳性,主要以抗H2A、H2A-H2B复合物和抗H1的IgG型抗体为主.2.药物性狼疮的阳性率达95％以上，但不伴有抗dsDNA抗体阳性,主要以抗H2A-H2B为主.常见的药物有肼苯达嗪、异烟肼及氯丙嗪.(三).抗非组蛋白抗体：1.抗可提取性核抗原抗体（ExtractableNuclearAntigen,ENA）：此类抗蛋白可以溶于盐水而被提取，故称为可提取性核抗原.对弥漫性结缔组织病的诊断尤为重要，但与疾病的严重程度及其活动度无明显关系。
(1).抗Sm抗体:以患者Smith名字命名,Sm抗原是U族小分子细胞核核糖核蛋白（UsnRNP），具有抗原性的蛋白的分子量是29KD、28KD、13.5KD。
Sm抗体和SnRNP是同一分子复合物中的不同抗原位点，故抗Sm抗体很少单独出现，它常于U1RNP抗体相伴，约60％抗U1RNP抗体与抗Sm抗体中的28/29KD有交叉反应。
抗Sm抗体阳性均伴有抗U1RNP抗体，而抗U1RNP抗体可以单独存在。
①.在SLE中阳性率为30.2%。
虽然敏感性较低，但特异性较高。
在全部抗Sm阳性的病例中，92.2%为SLE。
因此，抗Sm抗体为SLE的标记抗体。
②.另外，有人还发现SLE病人由活动期转为缓解期后，狼疮细胞可转阴，ANA、抗DNA 抗体效价可降低，但Sm抗体依然存在。
因此，对早期、不典型的SLE或经治疗缓解后的回顾性诊断有一定意义(2).抗nRNP抗体（nuclearRNP）：临床上应用较多为U1RNP抗体，U1snRNP由U1RNP和9种不同的蛋白质组成。
具有抗原性的分子量有70KD、32KD和22KD。
欧蒙印迹法检测ANA抗核抗体 实验报告
实验1：抗ANA自身抗体的检测（欧蒙斑点法）一、实验目的及原理抗核抗体（antinuclear antibody，ANA）是一组针对细胞核成分的自身抗体。
ANA阳性提示患有自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、混合性结缔组织病、干燥综合症、全身性硬皮病、原发性胆汁性肝硬化等。
根据细胞内各分子的理化特性和分布部位，ANA可分为抗DNA抗体、抗组蛋白抗体、抗非组蛋白抗体、抗核仁抗体和抗其他细胞成分抗体。
在本实验中，抗核抗体谱（IgG）检测试剂盒（欧蒙印迹法）的检测模条上平行包被了高度纯化的自身抗原。
用于体外定性检测人血清或血浆中的抗nRNP/Sm、Sm、SS-A（天然SS-A和Ro-52）、SS-B、Scl-70、PM-Scl、Jo-1)CENPB、PCNA、dsDNA、核小体、组蛋白、核糖体P蛋白和AMAM2共14种不同抗原IgG类抗体。
欧蒙印迹法的实验原理如下：样本血清与包被抗原的检测膜条温育，如果标本为阳性血清，则血清中的自身抗体将与膜条相应位点上的自身抗原特异性结合。
洗膜后添加碱性磷酸酶（AP）标记的羊抗人IgG（二抗），将与结合在膜条相应抗原位点上的自身抗体（一抗）结合，形成抗原-1st Ab-2nd Ab复合物。
最后，加入酶底物 NBT/BCIP（四唑硝基苯胺兰/5-溴-4-氯啶-磷酸盐）显色，阳性血清在对应膜条抗原条带处原位可形成蓝紫色的化合物沉淀。
二、实验材料1.包被抗原的检测膜条2.nRNP/Sm、Sm、SS-A、SS-B、Scl-70、PMScl、Jo-1、CENP B、PCNA 、dsDNA、核小体、组蛋白、核糖体P蛋白3.阳性对照：人IgG，100 倍浓缩，1x0.02ml4.酶结合物：碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG，10倍浓缩，1x3ml5.样本缓冲液，直接使用，1x100ml6.清洗缓冲液，10 倍浓缩，1x 50ml7.底物液：NBT/BCIP（四唑硝基苯胺兰/5-溴-4-氯啶-3-吲哚-磷酸盐），直接使用，1×30ml8.温育盘2x8槽三、实验步骤（一）预处理●试剂盒平衡至室温30分钟后使用，取出膜条。
欧蒙印迹法检测ANA抗核抗体 实验报告
抗核抗体（antinuclear antibody，ANA）是一组针对细胞核成分的自身抗体。ANA阳性提示患有自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、混合性结缔组织病、干燥综合症、全身性硬皮病、原发性胆汁性肝硬化等。
根据细胞内各分子的理化特性和分布部位，ANA可分为抗DNA抗体、抗组蛋白抗体、抗非组蛋白抗体、抗核仁抗体和抗其他细胞成分抗体。
2.抗原和血清（1st抗体）温育30min
枪头吸去槽内液体，在温育槽中分别加入已稀释血清，常温，摇床震荡30min。
3.清洗15min
用枪头吸去槽内液体，在摇摆摇床上用清洗缓冲液清洗膜条3次，每次5min。
4.加10X稀释的酶结合物（二抗），抗原-抗体-羊抗人IgG（二抗）温育30min
吸去槽内液体，在槽内分别加入ml酶结合物。常温摇床震荡30min。
作为核酸分子，dsDNA抗原与其他蛋白质抗原具有完全不同的带电荷能力。因此，dsDNA抗原包被的位置不易与血清样本中的其他物质结合。当样本为dsDNA阴性时，抗原包被区域反应较弱或者无反应，而同一膜片上的其它区域由于吸附少量杂质导致背景加深，从而形成dsDNA条带发白的现象。出现上述实验结果时，样本可判断为明确可靠的阴性结果。
二、实验材料
1.包被抗原的检测膜条
2.nRNP/Sm、Sm、SS-A、SS-B、Scl-70、PMScl、Jo-1、CENP B、PCNA、dsDNA、核小体、组蛋白、核糖体P蛋白
3.阳性对照：人IgG，100倍浓缩，
4.酶结合物：碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG，10倍浓缩，1x3ml
5.样本缓冲液，直接使用，1x100ml
根据结果示意图，本次实验在质控带上出现了深紫色条带，位于从上往下数的第一区域，说明实验操作正确。
免疫印迹技术ANA谱测定
操作步骤
加酶：每槽加入稀释后酶标抗体1.5mL，混匀，缓 慢在室温摇床上孵育30分钟。 洗涤：同前洗涤。
显色：每槽加入显色液1.5mL，室温反应10分钟
终止：每槽弃去反应液，用蒸馏水洗涤三次，取 出膜条，有序贴于结果分析页上，待膜条干后进 行结果判断。
影响因素
未用完的洗涤液弃之，不可留作下次用。
E ENA检测方法 E
自身抗体
非特异 蛋白
① 纯化抗原膜条（膜条试剂盒）
试剂
样本稀释液:直接使用 工作洗涤液：直接使用（已配好） 酶标记二抗:直接使用（已配好） 底物:直接使用
操作步骤
润膜：取出反应槽，每槽加入 1.5ml样本稀释液，缓慢于 室温孵育5分钟,将膜条充分润湿，倒掉样本缓冲液 加样：然后在每个槽中加入样本缓冲液 1.5mL ，并加入待 检血清或质控血清 15μ L，充分混匀，缓慢在室温振摇孵 育30分钟。 洗涤：弃去槽内液体，在吸水纸上拍干，用洗涤液洗涤 3 次，每次每槽加稀释洗涤液1.5ml，洗涤5分钟/次。
反应板和吸水纸 样本缓冲液1瓶 样本洗涤液（已稀释）1瓶 酶标记抗体（已稀释）共用
底物1瓶
结果解释
首先观察第一条质控线应显色才可判读结果，若 不显色则说明试剂失效或实验失败，需复查。 将膜条上显色区带与抗体位置对应抗体带对照， 即可判断出阳性抗体.
抗可提取性核抗原（ENA）抗体
抗nRNP抗体：MCTD 95 -100%（高滴度） 抗Sm抗体：SLE标记性抗体（20%-30%） 抗SSA抗体：PSS 60 -75%，其它CTD 抗RO52抗体:意义不明 抗SSB抗体： PSS 10 -40%，其它CTD 抗Scl-70抗体：SSc 25 -75%, 标记性抗体 抗Jo-1抗体：PM/DM 25%，标记性抗体 抗rib抗体： SLE特异性抗体（10%-30%）
免疫印迹法检测161例自身免疫性疾病抗核抗体的结果分析
免疫印迹法检测161例自身免疫性疾病抗核抗体的结果分析柳明波;熊彪;黄素兰【摘要】目的探讨免疫印迹法(LIA-ANAs)检测自身免疫性疾病(AID)患者抗核抗体(ANA)的临床价值.方法采用LIA-ANAs检测161例AID 患者血清ANA,其中系统性红斑狼疮(SLE)58例、干燥综合征(SS)24例、类风湿关节炎(RA)69例、多发性肌炎/皮肌炎(PM/DM)5例、系统性硬化症(SSc)2例、自身免疫性肝炎(AIH)3例.并与175例非AID作对照(对照组),其中炎症性疾病126例,肿瘤49例.结果两组患者共336例,ANA阳性检出率为44.3%,其中男性阳性检出率为30.5%,低于女性的51.8%(P＜0.01).AID组患者ANA阳性率为78.3%,高于对照组的13.1%(P＜0.01);SLE的阳性率最高为96.6%(P＜0.05).结论免疫印迹法检测ANA对诊断自身免疫性疾病有重要的临床意义.【期刊名称】《广西医学》【年(卷),期】2013(035)001【总页数】3页(P69-71)【关键词】自身免疫性疾病;抗核抗体;免疫印迹法【作者】柳明波;熊彪;黄素兰【作者单位】广西钦州市第一人民医院检验科,钦州市,535000;广西钦州市第一人民医院检验科,钦州市,535000;广西钦州市第一人民医院检验科,钦州市,535000【正文语种】中文【中图分类】R593抗核抗体(ANA)与自身免疫性疾病(AID)密切相关，ANA对AID的诊断与鉴别诊断、病情监测、疗效观察、预后判断有重要作用［1］。
免疫印迹法(line immunoassay，LIA)可检测血清或血浆中的人抗nRNP/Sm、Sm、SS-A、Ro-52、SS-B 和线粒体-M2(AMA-M2)等15种不同抗原IgG类抗体。
2008年1月至2012年1月在钦州市第一人民医院就诊的AID患者161例，采用LIA-ANAs检测血清ANA，现将结果分析如下。
间接免疫荧光法检测ANA标准操作程序
间接免疫荧光法(idirect immunoflorescence, IIF )检测ANA标准操作程序【目的】保证检测结果准确可靠，为临床诊断提供可靠的参考依据【该SOP变动程序】本标准操作程序的变动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。
【方法】间接免疫荧光法(idirect immunoflorescence, IIF)。
【标本的采取和保存】随机静脉血3ml，分离血清备用。
也可使用血浆标本进行检测。
标本宜新鲜，无污染，避免溶血，避免反复冻融，不可用NaN3防腐。
【原理】稀释后的待检血清或脑脊液、胸水、腹水等体液标本滴加在Hep -2细胞(人喉癌上皮细胞)抗原基质上，如果被检清中存在抗细胞抗原成分的抗体，则可以特异性地和抗原基质片上Hep-2细胞中的抗原成分结合形成抗原抗体复合物(主要是IgG类)，再与兔或羊抗人免疫球蛋白IgG荧光标记抗体结合，在荧光显微镜下可观察到Hep-2细胞细胞核和/或细胞浆抗原位置发出特异的亮绿色荧光，为抗核抗体(antinuxlear antibodies, ANA )阳性。
【仪器】荧光显微镜【试剂】ANA IIF试剂盒，德国欧蒙公司产品，每个反应区有两种抗原复合基质：猴肝组织和人Hep-2细胞。
【操作程序】1.准备检查加样板是否反应区亲水而周边疏水。
如果不是，用湿纸巾擦干净，必要时可用一点家用洗涤剂，再用足量的水冲洗。
随后从试剂盒中取出载片，等平衡到室温时方可打开包装。
注意不要触及生物薄片。
必要时可用笔编号、标记：(为了使实验操作标准化，欧蒙开发了滴定平板技术：滴加标本或标记抗体至加样板的反应区，然后将生物薄片载片盖在加样板表面的凹槽里，这时，载片上的所有生物薄片均与液滴接触，反应同时开始。
系统的几何结构决定了液滴的位置和高度。
因为液体被局限在一封闭的空间里，所以不再需要传统的“湿盒”。
并且可在一致的反应条件下同时温育任何数量的标本。
抗核抗体谱检测（免疫印迹法）
抗核抗体谱检测（免疫印迹法）1 目的熟悉自身免疫性疾病抗核抗体谱检测标准操作规程，以便于更加规范化的操作，提高免疫检验质量，保证结果的准确性。
2 适用范围适用于免疫室内自身免疫性疾病抗核抗体谱检测3 职责检验科主任负责组织人员制定自身免疫性疾病抗核抗体谱检测标准操作程序，免疫室组长负责组织人员具体实施。
4 该SOP变动程序本标准程序的变动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，，并报经下述人员批准签字：专业组长、科主任。
5原理该欧蒙印迹法试剂盒用于体外定性检测血清或血浆中的人抗nRNP、Sm、SS-A（天然SS-A 和Ro-52）、SS-B、Scl-70、PM-Scl、Jo-1、CENP B、PCNA、dsDNA、核小体、组蛋白、核糖体P蛋白和AMA M2等14种不同抗原IgG类抗体。
实验膜条上平行包被了这些高度纯化的抗原。
在第一次温育时，已稀释的血清与实验膜条反应。
如果标本阳性，特异性的IgG（也包括IgA和IgM）与相应抗原结合。
为检测已结合的抗体，加入酶标抗人IgG（酶结合物）进行第二次温育，然后加入酶底物，以产生可观察的颜色反应。
6标本采集及实验标本要求采取静脉血2-3ml，待分离血清后，离心（1500-3000转/分）15分钟，待测。
随机静脉血2ml，分离血清备用。
也可使用EDTA、肝素或柠檬酸盐抗凝血浆。
稳定性：标本宜新鲜，无污染，避免溶血，避免反复冻融，不可用NaN3防腐。
7标本存放：待检患者标本于2-8 C可稳定14天，稀释后的标本应在同一个工作日内检测。
8标本运输：2-8℃密闭运输。
9标本拒收条件：蛋白变性标本，标本中含有颗粒物质，细菌污染，严重溶血或脂血标本不能做测定。
10试剂附:nRNP/Sm：小牛和兔胸腺提取物，经亲和层析纯化的天然U1-nRNP。
Sm：牛脾脏和胸腺提取物，经亲和层析纯化的天然Sm。
SS-A：牛脾脏和胸腺提取物，经亲和层析纯化的天然SS-A。
Ro-52：重组的Ro-52（52kDa），相应的人cDNA用杆状病毒系统在昆虫细胞中表达。
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罗俐梅
Westernblot法
SDS-PAGE电泳
转移电泳
酶免疫检测
条带印迹法: ANA谱
纯化抗原的免疫印迹法
纯化可提取性细胞核抗原（ENA）包 被于硝酸纤维膜上，待测血清标本 与之反应，如存在相应抗体，则会 结合上去，并进一步结合酶标记的 二抗，经酶底物显色即可观察到相 应的抗体。
全部操作应振摇进行，否则检测敏感性会有所下 降。 不同血清标本，显色强度会有不同，弱阳性结果 需仔细观察。
试剂需恢复至室温方可使用，否则会影响检测结 果。
试验准备
分为 5组 ,每组取 1个病人标本 , 在一个反应板上试 验。 其中一组增加阴性和阳性质控。
各组需领取以下物资：
待测标本1份
阴性和阳性质控1份（第1组）
操作步骤
润膜：取出反应槽，每槽加入 1.5ml样本稀释液，缓慢于 室温孵育5分钟,将膜条充分润湿，倒掉样本缓冲液 加样：然后在每个槽中加入样本缓冲液 1.5mL ，并加入待 检血清或质控血清 15μ L，充分混匀，缓慢在室温振摇孵 育30分钟。 洗涤：弃去槽内液体，在吸水纸上拍干，用洗涤液洗涤 3 次，每次每槽加稀释洗涤液1.5ml，洗涤5分钟/次。
操作步骤
加酶：每槽加入稀释后酶标抗体1.5mL，混匀，缓 慢在室温摇床上孵育30分钟。 洗涤：同前洗涤。
显色：每槽加入显色液1.5mL，室温反应10分钟
终止：每槽弃去反应液，用蒸馏水洗涤三次，取 出膜条，有序贴于结果分析页上，待膜条干后进 行结果判断。Fra bibliotek影响因素
未用完的洗涤液弃之，不可留作下次用。
免疫印迹法检测ENA谱的原理 ⑥ 加底物显色，观察结果 ⑤ 洗去多余酶标二抗
④ 加入酶标二抗反应
③ 洗去未反应蛋白 ② 加入标本反应
E ENA检测方法 E
自身抗体
非特异 蛋白
① 纯化抗原膜条（膜条试剂盒）
试剂
样本稀释液:直接使用 工作洗涤液：直接使用（已配好） 酶标记二抗:直接使用（已配好） 底物:直接使用
反应板和吸水纸 样本缓冲液1瓶 样本洗涤液（已稀释）1瓶 酶标记抗体（已稀释）共用
底物1瓶
结果解释
首先观察第一条质控线应显色才可判读结果，若 不显色则说明试剂失效或实验失败，需复查。 将膜条上显色区带与抗体位置对应抗体带对照， 即可判断出阳性抗体.
抗可提取性核抗原（ENA）抗体
抗nRNP抗体：MCTD 95 -100%（高滴度） 抗Sm抗体：SLE标记性抗体（20%-30%） 抗SSA抗体：PSS 60 -75%，其它CTD 抗RO52抗体:意义不明 抗SSB抗体： PSS 10 -40%，其它CTD 抗Scl-70抗体：SSc 25 -75%, 标记性抗体 抗Jo-1抗体：PM/DM 25%，标记性抗体 抗rib抗体： SLE特异性抗体（10%-30%）