免疫印迹技术ANA谱测定
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免疫印迹技术ANA谱测定
罗俐梅
Westernblot法
SDS-PAGE电泳
转移电泳
酶免疫检测
条带印迹法: ANA谱
纯化抗原的免疫印迹法
纯化可提取性细胞核抗原（ENA）包 被于硝酸纤维膜上，待测血清标本 与之反应，如存在相应抗体，则会 结合上去，并进一步结合酶标记的 二抗，经酶底物显色即可观察到相 应的抗体。
操作步骤
加酶：每槽加入稀释后酶标抗体1.5mL，混匀，缓 慢在室温摇床上孵育30分钟。 洗涤：同前洗涤。
显色：每槽加入显色液1.5mL，室温反应10分钟
终止：每槽弃去反应液，用蒸馏水洗涤三次，取 出膜条，有序贴于结果分析页上，待膜条干后进 行结果判断。
影响因素
未用完的洗涤液弃之，不可留作下次用。
免疫印迹法检测ENA谱的原理 ⑥ 加底物显色，观察结果 ⑤ 洗去多余酶标二抗
④ 加入酶标二抗反应
③ 洗去未反应蛋白 ② 加入标本反应
E ENA检测方法 E
自身抗体பைடு நூலகம்
非特异 蛋白
① 纯化抗原膜条（膜条试剂盒）
试剂
样本稀释液:直接使用 工作洗涤液：直接使用（已配好） 酶标记二抗:直接使用（已配好） 底物:直接使用
操作步骤
润膜：取出反应槽，每槽加入 1.5ml样本稀释液，缓慢于 室温孵育5分钟,将膜条充分润湿，倒掉样本缓冲液 加样：然后在每个槽中加入样本缓冲液 1.5mL ，并加入待 检血清或质控血清 15μ L，充分混匀，缓慢在室温振摇孵 育30分钟。 洗涤：弃去槽内液体，在吸水纸上拍干，用洗涤液洗涤 3 次，每次每槽加稀释洗涤液1.5ml，洗涤5分钟/次。
全部操作应振摇进行，否则检测敏感性会有所下 降。 不同血清标本，显色强度会有不同，弱阳性结果 需仔细观察。
试剂需恢复至室温方可使用，否则会影响检测结 果。
试验准备
分为 5组 ,每组取 1个病人标本 , 在一个反应板上试 验。 其中一组增加阴性和阳性质控。
各组需领取以下物资：
待测标本1份
阴性和阳性质控1份（第1组）
反应板和吸水纸 样本缓冲液1瓶 样本洗涤液（已稀释）1瓶 酶标记抗体（已稀释）共用
底物1瓶
结果解释
首先观察第一条质控线应显色才可判读结果，若 不显色则说明试剂失效或实验失败，需复查。 将膜条上显色区带与抗体位置对应抗体带对照， 即可判断出阳性抗体.
抗可提取性核抗原（ENA）抗体
抗nRNP抗体：MCTD 95 -100%（高滴度） 抗Sm抗体：SLE标记性抗体（20%-30%） 抗SSA抗体：PSS 60 -75%，其它CTD 抗RO52抗体:意义不明 抗SSB抗体： PSS 10 -40%，其它CTD 抗Scl-70抗体：SSc 25 -75%, 标记性抗体 抗Jo-1抗体：PM/DM 25%，标记性抗体 抗rib抗体： SLE特异性抗体（10%-30%）
罗俐梅
Westernblot法
SDS-PAGE电泳
转移电泳
酶免疫检测
条带印迹法: ANA谱
纯化抗原的免疫印迹法
纯化可提取性细胞核抗原（ENA）包 被于硝酸纤维膜上，待测血清标本 与之反应，如存在相应抗体，则会 结合上去，并进一步结合酶标记的 二抗，经酶底物显色即可观察到相 应的抗体。
操作步骤
加酶：每槽加入稀释后酶标抗体1.5mL，混匀，缓 慢在室温摇床上孵育30分钟。 洗涤：同前洗涤。
显色：每槽加入显色液1.5mL，室温反应10分钟
终止：每槽弃去反应液，用蒸馏水洗涤三次，取 出膜条，有序贴于结果分析页上，待膜条干后进 行结果判断。
影响因素
未用完的洗涤液弃之，不可留作下次用。
免疫印迹法检测ENA谱的原理 ⑥ 加底物显色，观察结果 ⑤ 洗去多余酶标二抗
④ 加入酶标二抗反应
③ 洗去未反应蛋白 ② 加入标本反应
E ENA检测方法 E
自身抗体பைடு நூலகம்
非特异 蛋白
① 纯化抗原膜条（膜条试剂盒）
试剂
样本稀释液:直接使用 工作洗涤液：直接使用（已配好） 酶标记二抗:直接使用（已配好） 底物:直接使用
操作步骤
润膜：取出反应槽，每槽加入 1.5ml样本稀释液，缓慢于 室温孵育5分钟,将膜条充分润湿，倒掉样本缓冲液 加样：然后在每个槽中加入样本缓冲液 1.5mL ，并加入待 检血清或质控血清 15μ L，充分混匀，缓慢在室温振摇孵 育30分钟。 洗涤：弃去槽内液体，在吸水纸上拍干，用洗涤液洗涤 3 次，每次每槽加稀释洗涤液1.5ml，洗涤5分钟/次。
全部操作应振摇进行，否则检测敏感性会有所下 降。 不同血清标本，显色强度会有不同，弱阳性结果 需仔细观察。
试剂需恢复至室温方可使用，否则会影响检测结 果。
试验准备
分为 5组 ,每组取 1个病人标本 , 在一个反应板上试 验。 其中一组增加阴性和阳性质控。
各组需领取以下物资：
待测标本1份
阴性和阳性质控1份（第1组）
反应板和吸水纸 样本缓冲液1瓶 样本洗涤液（已稀释）1瓶 酶标记抗体（已稀释）共用
底物1瓶
结果解释
首先观察第一条质控线应显色才可判读结果，若 不显色则说明试剂失效或实验失败，需复查。 将膜条上显色区带与抗体位置对应抗体带对照， 即可判断出阳性抗体.
抗可提取性核抗原（ENA）抗体
抗nRNP抗体：MCTD 95 -100%（高滴度） 抗Sm抗体：SLE标记性抗体（20%-30%） 抗SSA抗体：PSS 60 -75%，其它CTD 抗RO52抗体:意义不明 抗SSB抗体： PSS 10 -40%，其它CTD 抗Scl-70抗体：SSc 25 -75%, 标记性抗体 抗Jo-1抗体：PM/DM 25%，标记性抗体 抗rib抗体： SLE特异性抗体（10%-30%）