02 CHIP染色质免疫共沉淀实验方法简介

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热点实验：CHIP染色质免疫共沉淀实验案例介绍

背景：真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。

与传统的EMSA技术相比，染色质免疫沉淀技术（CHIP）能真实完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前研究体内DNA与蛋白质相互作用的最佳方法。

原理：是在活细胞状态下以甲醛固定蛋白质－DNA复合物，超声将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后加入目的蛋白抗体，通过抗体沉淀靶蛋白-DNA复合物，通过洗脱的方法得到富集的靶蛋白-DNA复合物，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测（PCR分析），从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

应用：1.组蛋白修饰研究 2.转录调控分析 3.药物开发研究 4.有丝分裂研究 5.DNA损伤与凋亡分析。

步骤：1）甲醛处理细胞2）收集细胞，超声破碎3）加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合4）加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，沉淀5）对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合6）洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物7）解交联，纯化富集的DNA-片断8）PCR或基因芯片分析。

实验案例证明C/EBP与Tmub1启动子或增强子序列的结合实验背景：在IL－6诱导条件下,利用CHiP技术提取C/EBP－DNA复合物，以Tmub1基因的碱基序列设计引物，以提取的DNA为底物，进行扩增，从而证明C/EBP结合的DNA含有Tmub1基因，进一步确认C/EBP与Tmub1启动子或增强子序列的相互作用。

实验分组：分2个组进行实验普通PCR检测和WB检测（检测Tmub1蛋白表达水平，抗体嘉美生物实验室提供。

注：嘉美生物实验室提供绝大多数常用国外原装进口抗体，为实验委托者节约大量实验经费。

）第一组：A组第二组：B组转染3天后收集细胞做CHIP-PCR以及WB检测实验对照：设定的对照有1、阳性对照（系统阳性对照，Anti-RNA Polymerase II）2、INPUT对照（DNA片段在沉淀以前，收集下来的对照）3、阴性对照（非免疫IgG血清吸附，Normal Mouse IgG）细胞转染流程:略EZ-ChIP™染色质免疫共沉淀实验检测流程（Upstste Catalog # 17-371)1、Kit Description：试剂盒内含的RNA聚合酶II阳性对照抗体2、试剂盒组分：A. Provided Kit ComponentsStore at 4℃:ChIP Blocked Protein G Agarose 1.5 mlChIP Dilution Buffer, One vial containing 24 mlLow Salt Immune Complex Wash Buffer 24 mlHigh Salt Immune Complex Wash Buffer 24 mlLiCl Immune Complex Wash Buffer 24 mlTE Buffer 24 ml0.5 M EDTA 250 ul5 M NaCl 500 ulSDS Lysis Buffer 10 ml1 M Tris-HCl, pH 6.5 500 ul10X Glycine 11 ml10X PBS 24 mlStore at -20℃:Protease Inhibitor Cocktail II（蛋白酶抑制剂） 2×110 ulRNase A 600 ug of RNase A in 60 ul sterile water.Proteinase K 600 ug of Proteinase K in 60 ul 1M NaHCO3 600 ulAnti-RNA Polymerase II 25ug clone CTD4H8.Normal rat IgGStore at Room Temperature:20% SDS 242 ul of 20% SDS.Spin Filters One bag containing 22 Spin Filters with Collection TubesCollection Tubes 22 Collection Tubes.Bind Reagent A 25 ml of Bind Reagent A.Wash Reagent B 12.5 ml of Wash Reagent B.Elution Reagent C 1.5 ml of Elution Reagent C.B. 抗体及血清特异性抗体：Anti-CEBP Beta antibody [E299] (ab32358,嘉美生物提供)Normal rat IgGC. 仪器设备微量混匀器Vortex mixer,震摇器Rotating wheel/platform.计时器Timer,可调微量加样枪以及tip头，Variable volume (5-1000 ml) pipettes + tips高速离心机Microfuge,Variable temperature water bath,细胞刮子Cell scraper,Sonicator,1.5 Ml离心管Microfuge tubes,PCR管PCR tubes,D. 引物设计略4、CHIP 操作流程A. 细胞蛋白与染色质的交联及细胞裂解预先准备：1) 准备细胞，150 mm培养瓶（20ml培养液）密度为80-90%，细胞数量≥1 x 10-7个；2) 准备42 ml 1X PBS (4.2 ml 10X PBS +37.8 ml water),放入150 mm培养皿以冰块预冷；3) 取出SDS Lysis Buffer，放置至常温确保SDS溶解不析出；4) Protease Inhibitor Cocktail II恢复至室温。

染色质免疫沉淀法

染色质免疫沉淀法
染色质免疫沉淀法（Chromatin immunoprecipitation，ChIP）是一种用于研究染色质上特定蛋白质与DNA相互作用的实验方法。

该方法主要包括以下几个步骤：
1. 交联：将细胞或组织交联以固定染色质结构，一般使用甲醛作为交联剂。

2. 酶切：使用限制酶或超声波等方法将染色质切割成适当的片段。

3. 免疫沉淀：将特定抗体与染色质混合，使其与特定蛋白质结合。

随后使用蛋白A/G磁珠等材料将抗体结合的染色质选择性地沉淀下来。

4. 解交联：将染色质与抗体复合物从蛋白质上解离，并解开DNA与蛋白质之间的交联结构。

5. DNA纯化：将沉淀下来的DNA纯化出来，以供后续实验分析，如PCR、测序等。

通过染色质免疫沉淀法，可以研究特定蛋白质与DNA的相互作用、染色质结构与功能以及基因表达的调控机制等。

该方法在生物学研究中广泛应用，为研究基因组学、表观遗传学等领域提供了重要工具。

染色质免疫沉淀(ChIP)实验分析

染色质免疫沉淀（ChIP）实验分析ChIP实验被用来鉴定染色质相关蛋白的定位和/或它们的翻译后修饰状态。

这种方法依赖于特异识别目的蛋白或修饰蛋白（例如组蛋白H3 Lys9甲基化）的抗体进行免疫沉淀和分析免疫共沉淀DNA。

早期实验方法依赖于使用温和的裂解条件，以保护蛋白质--DNA相互作用，但这种方法只适用于和DNA直接结合的蛋白。

甲醛交联方法的使用使得这样的分析可以扩展到与染色质关联的几乎任何蛋白。

非变性、非交联免疫沉淀实验使用直接和特定DNA结合蛋白结合的抗体从细胞中分离蛋白质--DNA复合物依赖于抽提和免疫沉淀的条件，尤其是在该条件下怎样使蛋白可溶并保持蛋白质-DNA的结合。

有几种方法已被成功使用，但是要注意到这一点，要根据蛋白质-DNA复合物所需的条件来调整实验条件。

该方法本质来说是利用低渗透压裂解细胞，分离细胞核，在低盐条件下使用核酸酶（DNaseI或微球菌核酸酶—Mnase）溶解染色质，接着使用抗体进行免疫沉淀识别目标蛋白。

使用多肽可以从免疫复合物中最先洗下蛋白质-DNA复合物，这可以减少在更严格的洗脱下来的，与DNA非特异性结合的蛋白污染。

提取的DNA可以克隆用于进一步分析、测序或用于探针阵列分析。

甲醛交联免疫沉淀实验这已成为研究染色质中动态蛋白质--DNA的强有力方法。

甲醛交联的染色质免疫沉淀的实验步骤见图二。

甲醛交联使我们能够检测到可能不直接结合DNA的蛋白质--染色质的结合。

这种交联方法产生蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA和蛋白质-RNA交联，因此适合于染色质不同成分以及瞬时关联的分析。

这也有效地被用于分析染色质翻译后修饰的存在与否。

这种方法最初在果蝇体系中是由Varshavski及其同事开发的，由Paro 修正的由两个酵母小组广泛使用和修正的。

图二该技术实验步骤适用于所有的ChIP实验，由于研究系统的不同或研究小组的偏好，在实验细节上略有不同。

此外，在新研究系统的第一次实验需要优化实验步骤。

染色质与蛋白研究：染色质免疫共沉淀（ChIP）实验介绍（一）

染色质与蛋白研究：染色质免疫共沉淀（ChIP）实验介绍（一）前面的文章中已经向大家介绍了免疫共沉淀技术（IP）的原理和方法，这一技术可以帮助我们便捷地探究蛋白与蛋白之间的互相作用。

但若研究的靶蛋白可能发挥组蛋白修饰酶的功能，或是可能作为某种转录因子发挥作用，那么就要应用染色质免疫共沉淀技术（chromatin-immunoprecipitation，ChIP）方法来探究其与DNA 的直接调控了。

ChIP可以真实、完整地反映结合在DNA启动子区上的靶蛋白的调控信息，是目前基于全基因组水平研究DNA-蛋白质相互作用的标准实验技术。

接下来，我们一起来学习一下ChIP技术吧！1ChIP基本原理ChIP是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

ChIP不仅可以检测转录因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。

基因的转录是从启动子区开始，由一系列的转录因子结合到基因的启动子区，通用转录因子结合在基本启动子区起始转录，而这个过程通常需要一些特异的转录因子结合在上游调节序列，使基因特异表达并维持的合适水平。

此外，基因的转录还会受到表观遗传的调控，如组蛋白甲基化修饰、乙酰化修饰等，组蛋白特异位点的修饰均可以直接影响基因的转录水平。

因此，ChIP主要用于研究特异的转录因子或组蛋白修饰酶与下游基因启动子区的结合，如果ChIP发现二者可以结合，那么这说明该基因可能是其下游基因。

要想进一步证明，还要做高低表达和荧光素酶等实验。

目前，ChIP与一些高通量测序的结合，扩大了其应用范围：比如，ChIP与基因芯片相结合建立的ChIP-ChIP已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；ChIP-Seq是将深度测序技术与ChIP实验相结合，可分析全基因组范围内DNA结合蛋白结合位点、组蛋白修饰、核小体定位或DNA甲基化的高通量方法，可以应用到任何基因组序列已知的物种，并能确切得到每一个片段的序列信息；RNA-ChIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。

免疫共沉淀实验流程--chip

染色体免疫共沉淀（Chip）实验报告步骤一：样品准备试剂和仪器：Biopulverizer(biospec)37% formaldehyde甘氨酸(Glycine)PBSprotease inhibitors步骤二：细胞交联1. 向客户提供的细胞沉淀中加入1ml 细胞培养基，混匀细胞后转移到15ml离心管中。

2. 向15ml离心管中加入270ul 37%甲醛溶液，使得甲醛的终浓度为1%，室温温育10min。

3. 向反应体系中各加入505ul 2.5M甘氨酸到终浓度为125mM，室温温育5min以终止交联反应。

4. 135x g，4°C离心10min，去上清，并用冰冷的10ml 1XPBS迅速漂洗两次。

5. 吸净PBS后，加入1ml PBS+protease inhibitors混合液，并转移到1.5ml离心管中。

800Xg，4°C离心5min，小心去掉上清。

步骤三：细胞裂解试剂:裂解缓冲液1: 50mM Hepes-KOH pH7.5; NaCl 140mM; EDTA 1mM; glycerol 10%;NP-40 0.5%;Tritonx -100 0.25%。

裂解缓冲液2: 10mM Tris-HCl pH8.0; NaCl 100mM; EDTA 1mM pH8.0; Na-Deoxycholate 0.1% Protease inhibitors。

步骤:1. 加入蛋白酶抑制剂(终浓度为1x) 到所有的裂解缓冲液中。

2. 用1ml的裂解缓冲液1重悬上述处理的样品，4°C旋转混合10min后，800g，4°C离心5min，弃上清。

3. 用300ul 裂解缓冲液2重悬样品，冰上放置30min。

步骤四：超声破碎ＤＮＡ仪器:Bioruptor(Diagenode)步骤:(1)、将超声仪器Bioruptor 调到中档“Mid”(M)。

(2)、在超声池中注入一定量的冰水。

染色体免疫共沉淀(chip)步骤

染色体免疫共沉淀(chip)步骤
染色体免疫共沉淀（ChIP）是一种常用的实验技术，用于研究染色体上特定蛋白质与DNA的相互作用。

以下是染色体免疫共沉淀的基本步骤：
1. 交联：将细胞或组织与形成蛋白质-DNA复合物的交联剂（如甲醛）处理，使蛋白质与DNA之间形成致密的交联。

这一步骤有助于保持蛋白质与DNA的相互作用并固定其在细胞或组织中的位置。

2. 细胞破碎和核裂解：将交联后的细胞或组织进行破碎和核裂解，以释放细胞内的染色质。

这可以通过机械方法（如超声波处理）或化学方法（如利用细胞裂解缓冲液和蛋白酶进行破碎）完成。

3. 免疫共沉淀：在破碎的细胞或组织提取物中，加入特异性抗体，该抗体可以与目标蛋白质结合。

免疫抗体与目标蛋白质形成免疫复合物，并与形成蛋白质-DNA复合物的目标区结合。

4. 洗涤：通过一系列洗涤步骤，去除非特异性和非特定结合的蛋白质和核酸，以减少背景信号的干扰。

5. 解交联：通过加热或酶处理等方法，解除细胞或组织中的蛋白质-DNA交联，并将DNA释放出来。

6. DNA提取：通过加入DNA提取缓冲液和有机溶剂，从溶液中沉淀出DNA，并用适当的方法进行纯化和浓缩。

7. 分析：对提取的DNA进行进一步的分析，可使用PCR、测序等技术，以检测免疫共沉淀的蛋白质与目标DNA的相互作用。

这些步骤旨在允许研究人员从细胞或组织中获得特定蛋白质与DNA的结合信息，并进一步了解基因调控、表观遗传学等相关的生物学过程。

实际操作时，具体的步骤和条件可能会因实验目的和样本类型而有所不同。

因此，在进行染色体免疫共沉淀实验时，建议参考相关文献和实验室经验，以确保实验的准确性和
可重复性。

染色质免疫沉淀技术（ChIP）简介、原理及ChIP

染⾊质免疫沉淀技术（ChIP）简介、原理及ChIP ChIP简介：ChIP是染⾊质免疫沉淀技术（Chromatin ImmunoPrecipitation assay）的简称，属于免疫沉淀技术的⼀种，⽤于检测蛋⽩质与DNA的相互作⽤。

染⾊质免疫沉淀技术的⼀个重要⽤途是研究某个转录因⼦A（可以是发⽣某些特定修饰，如磷酸化、⼄酰化等修饰的蛋⽩）是否调控其预期靶基因B的特定转录调控区（主要是启动⼦区域）。

下⾯就以利⽤ChIP研究转录因⼦对基因的调控为例进⾏阐释。

检测⽔平：转录⽔平调控原理及操作流程：染⾊质免疫沉淀技术的原理及⼀般操作流程为：1. 在活细胞状态下，使⽤交联剂（常为甲醛）将蛋⽩质-DNA复合物固定下来；2. 然后通过理化⽅法（常为酶消化法或者超声破碎）将这种复合物中的DNA随机切割为⼀定长度范围内的染⾊质⼩⽚段；3. 继续使⽤蛋⽩质A的特异性抗体I（⼀般要求ChIP级别）处理，将含有蛋⽩质A的蛋⽩质-DNA⽚段特异性标记；4. 再利⽤⼀种可以结合抗体的Protein A（⼀般偶联到分选柱和磁珠上，便于分离），将含有抗体的复合物从作⽤体系中富集分离出来，未被抗体标记的蛋⽩质-DNA则被洗脱去除；5. 将得到的抗体-蛋⽩质-DNA复合物解交联，纯化富集其中的DNA⽚段；6. 利⽤针对⽬的基因B转录调控区的特异性引物（⼀般设计多个位点，覆盖多个区域）进⾏PCR（以前多为半定量PCR，现在随着设备的升级，使⽤荧光定量PCR也逐渐普及）等⼿段检测，如果其中有PCR检出阳性则表明蛋⽩质A可以与基因B的转录调控区有结合（可以是直接也可以是间接结合，具体区分还需要进⾏进⼀步的EMSA检测），⽽具体的结合位点就在引物覆盖区域及其周边位置。

ChIP-on-chip衍⽣技术：ChIP-on-chip有时也称ChIP-chip，要注意其中的⼤⼩写因为它们代表的意义不同，其中前⼀个ChIP表⽰染⾊质免疫沉淀技术，后⼀个chip表⽰基因芯⽚技术。

（原创）染色质免疫共沉淀（CHIP）

（原创）染色质免疫共沉淀（CHIP）说明：以下实验方法使用了millipore公司的ChromatinImmunoprecipitation (ChIP) Assay Kit （Catalog #17-295）。

第一天（一）细胞的甲醛交联与超声破碎。

1、取出三个10cm平皿均匀种下细胞，在转录的最佳条件下培养，三个分别用来计数、对照、实验，待细胞数目达到约1×106时，直接加入270 μl 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有10 ml）；2、37℃孵育10min；3、吸尽培养基，用冰冷的PBS（临用之前加入蛋白酶抑制剂PMSF使终浓度达到1mM）清洗细胞2次；4、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中，预冷后2000rpm 4℃离心 5min收集细胞；同时将SDS LysisBuffer从冰箱中取出平衡至室温；5、倒去上清，加入200 μl SDS LysisBuffer（对应细胞数为1×106，可以按照实际细胞数进行倍增）裂解细胞，并保证加入蛋白酶抑制剂PMSF，冰上孵育10 min；6、超声破碎：VCX750，25%功率，4-5S冲击，9S间隙。

共14次，使DNA断裂成200-1000bp的片段，（第一次试验前可以加入8μl 5 M NaCl，65℃水浴4 h解交链，然后提取DNA进行电泳检测，以获得最适的超声破碎条件）。

（二）除杂及抗体哺育。

7、超声破碎结束后，13000 rpm 4℃离心10 min，转移上清至2 ml离心管中，取做实验，其余可以保存于-80℃冰箱中；8、300 μl中，100 μl加抗体作为实验组；100 μl不加抗体做为对照组；100 μl加入4 μl 5 M NaCl（NaCl终浓度为0.2M），65℃处理4 h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果；9、在100 μl的离心上清液中，加入900 μl ChIP DilutionBuffer 和20 μl的50×PIC，再各加入60 μl ProteinA Agarose。

染色质免疫共沉淀技术

染色质免疫共沉淀技术
染色质免疫共沉淀技术（ChIP）是一种常用的分子生物学技术，也是
研究细胞基因组结构和功能的重要方法。

该技术可以用来鉴定某个转录因
子或其他核蛋白与某个特定DNA序列的结合关系，从而确定这个DNA序列
在基因表达调控中的重要性。

该技术包括以下步骤：（1）交联；（2）裂解；（3）免疫沉淀；（4）洗涤；（5）离解交联；（6）DNA提取。

在这个过程中，首先将细胞进行交联，使得染色质固定在原位。

之后，将染色质进行裂解并进行免疫沉淀，这里是将特定的抗体与目标蛋白质结合，从而使得目标蛋白质与某些DNA序列结合，并保持在染色质中。

然后
对免疫沉淀后的复合物进行洗涤，去除杂质物质，以提高免疫沉淀的特异
性和纯度。

之后，对免疫沉淀后的复合物进行离解交联，使免疫沉淀的蛋
白质与DNA分别被分解为单独的分子。

最后，从免疫沉淀复合物中提取DNA，用于进一步的分析，例如PCR扩增、Southern blotting、测序等。

该技术的优点是可以在整个基因组范围内寻找目标DNA序列的结合蛋白，相对快速、成本低、灵敏度高，并且可以直接从原位染色质富集DNA
序列。

缺点是免疫沉淀的特异性和纯度可能受到影响，需要对实验进行严
谨控制。

染色质免疫共沉淀技术原理

染色质免疫共沉淀技术原理一、前言染色质免疫共沉淀技术（ChIP）是生物学研究中常用的一种方法，它通过利用抗体特异性识别染色质上的特定蛋白质，进而从复杂的细胞核提取物中富集这些蛋白质，并对其进行鉴定和分析。

本文将详细介绍染色质免疫共沉淀技术的原理。

二、实验步骤1. 交联首先，需要对活细胞进行交联处理，以稳定染色质和蛋白质之间的相互作用。

常用的交联剂有甲醛和二氧化硅等。

2. 染色质片段化接下来，需要将交联后的细胞进行裂解，并将DNA片段化。

这可以通过超声波或者限制性内切酶等方法实现。

3. 免疫共沉淀然后，在裂解液中加入与目标蛋白特异性结合的抗体，并进行免疫共沉淀。

在共沉淀过程中，目标蛋白和与其结合的DNA片段会被富集到抗体上。

4. 分离DNA片段接下来，需要将DNA片段从抗体上分离出来。

这可以通过加入盐或者进行热处理等方法实现。

5. 鉴定和分析最后，对富集的DNA片段进行鉴定和分析。

这可以通过PCR扩增、测序或者芯片技术等方法实现，以确定目标蛋白在染色质中的作用位置和作用方式。

三、原理解析1. 抗体选择ChIP技术的核心是抗体的选择。

抗体需要特异性识别目标蛋白，并保持其活性。

通常情况下，使用多个不同来源的抗体可以提高富集效率和准确性。

2. 交联原理交联是通过甲醛或二氧化硅等化学物质与细胞核内的DNA、蛋白质发生共价结合而实现的。

交联后的染色质会更加稳定，避免了在裂解过程中DNA和蛋白质之间失去相互作用。

3. 片段化原理染色质片段化是为了将长链DNA切成适当大小的小片段，以便于后续步骤中与抗体结合并富集目标蛋白。

超声波法利用高频声波震荡使DNA分子破碎，而限制性内切酶法则利用特定的酶切割位点切割DNA分子。

4. 免疫共沉淀原理免疫共沉淀是利用抗体与目标蛋白之间的特异性结合，将目标蛋白及其相关DNA片段从裂解液中富集到抗体上。

这一步骤需要注意选择合适的抗体和免疫共沉淀条件，以提高富集效率和准确性。

5. DNA片段分离原理将DNA片段从抗体上分离出来是为了进一步进行后续鉴定和分析。

染色质免疫沉淀(ChIP)实验指南

染色质免疫沉淀（ChIP）实验指南ChIP是一项比较流行的研究转录因子（transcription factor, TF）与启动子（promoter）相互结合的实验技术。

由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。

这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的。

当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA 或RNA）之间会产生共价键。

细胞内，当TF与Promoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。

一般ChIP的流程是：甲醛处理细胞——收集细胞，超声破碎——加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合——加入Protein A，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀——对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合——洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物——解交联，纯化富集的DNA-片断——PCR分析。

在PCR分析这一块，比较传统的做法是半定量－PCR。

但是现在随着荧光定量PCR的普及，大家也越来越倾向于Q－PCR了。

此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。

例如RIP （其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合，具体方法和ChIP差不多，只是实验过程中要注意防止RNase，最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA）；还有ChIP-chip（其实就是ChIP富集得到的DNA-片段，拿去做芯片分析，做法在ChIP的基础上有所改变，不同的公司有不同的做法，要根据公司的要求来准备样品）。

第一天：（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。

1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243ul 37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％。

（培养基共有9ml）2、37摄氏度孵育10min。

3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。

染色质免疫共沉淀(ChIP)实验

染色质免疫共沉淀（ChIP）染色质免疫共沉淀可以：（1）组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记”；（2）转录调控分析；（3）药物开发研究；（4）DNA损失与凋亡分析。

1实验方法原理：在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。

IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。

目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

2实验材料、试剂、仪器耗材：细胞样品甲醛、甘氨酸、PBS、SDS、Lysis Buffer、洗脱液、RNaseA、蛋白酶K、omega胶回收试剂盒等离心管、超声仪、电泳仪、离心机等3实验步骤：一、细胞的甲醛交联与超声破碎（第一天）1. 取出1平皿细胞（10 cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有9 ml）。

2. 37℃孵育10 min。

3. 终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125 M。

450 ul 2.5 M甘氨酸于平皿中。

混匀后，在室温下放置5 min即可。

4. 吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。

5. 细胞刮刀收集细胞于15 ml离心管中（PBS依次为5 ml，3 ml和3 ml）。

预冷后2 000 rpm 5 min收集细胞。

6. 倒去上清。

按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。

使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。

这样每100 ul溶液含1×106个细胞。

再加入蛋白酶抑制剂复合物。

假设MCF7长满板为5×106个细胞。

本次细胞长得约为80%。

即为4×106个细胞。

因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。

染色质免疫共沉淀实验方法

染色质免疫共沉淀实验方法
染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是一种用于研究染色质调控因子与DNA结合的实验技术，主要用于研究转录因子与DNA结合位点的相互作用。

以下是染色质免疫共沉淀实验的主要步骤：
1. **样品准备**：对细胞进行特殊处理，使之成为适合进行基因转录的“活动”状态，然后进行细胞裂解，使染色体变得更为疏松，同时加入抗体。

2. **免疫沉淀**：将处理过的细胞裂解物与特异性抗体混合，利用免疫沉淀将与该抗体结合的DNA片段富集。

3. **DNA回收**：利用纯化的ChIP-enrich样品中是否含有待检定的靶基因的DNA片段。

4. **基因组DNA的回收和鉴定**：通过PCR或测序等方法对ChIP产物进行检测，鉴定是否存在靶基因的DNA片段。

如果存在，即可说明该转录因子能够结合到该基因的DNA上。

5. **基因组DNA的再次检测**：可以通过QPCR或高通量测序等方法，进一步验证ChIP实验结果的准确性。

需要注意的是，在实验过程中，抗体的选择非常重要，通常使用针对蛋白质的特异性抗体，如针对转录因子的抗体。

同时，实验需要严谨的操作流程和质量控制，以确保实验结果的准确性。

此外，染色质免疫共沉淀技术也可通过使用特异性核酸探针或引物进行高通量测序的方法进行大规模基因组研究。

以上内容仅供参考，建议咨询专业人士以获得更准确的信息。

CHIP染色质免疫共沉淀实验 Protocol

CHIP染色质免疫共沉淀实验是一种在全基因组水平上研究蛋白质与DNA相互作用的技术方法。

其实验原理是基于抗原抗体反应的特异性，从而实现对DNA结合蛋白及其DNA靶标的富集。

实验所需试剂和耗材包括：细胞培养及提取试剂、生物素标记试剂盒、抗体、蛋白质A琼脂糖珠、Triton X-100、ECL显影液等。

实验仪器包括：二氧化碳培养箱、倒置显微镜、离心机、染色质免疫沉淀仪等。

实验准备工作的要点包括：首先，要确认所用试剂和耗材的型号和保质期；其次，要确保细胞株和抗体的选择合适；最后，准备好实验所需的仪器设备并调试至最佳状态。

实验方法主要包括以下步骤：1.将细胞进行培养并提取染色质。

2.在染色质中加入对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，并用Triton X-100将抗原抗体混合物进行稀释。

3.在混合物中加入蛋白质A琼脂糖珠，以便吸附多余的抗体和未结合的蛋白质。

4.用洗涤液洗涤沉淀物，去除未结合的蛋白质和抗体，最后用变性液洗脱DNA。

5.用电泳法和显影法检测提取出的DNA片段。

注意事项包括：要保持细胞生长状态良好，并确保抗原抗体反应的时间和温度准确适宜；在加入蛋白质A琼脂糖珠后，要充分混匀以避免影响实验结果；最后，要注意控制好电泳参数和显影条件以保证结果的准确性和可靠性。

常见问题及解决方法包括：如果抗原抗体反应不充分，可以尝试增加抗体浓度或延长反应时间；如果未结合的蛋白质不能被有效清除，可以尝试增加洗涤次数或更换洗涤液；如果电泳条带不清晰或出现异常，可以尝试调整电泳参数或更换电泳液。

总之，CHIP染色质免疫共沉淀实验是一种研究蛋白质与DNA相互作用的有效方法，需要注意保持细胞生长状态良好、准确控制抗原抗体反应条件、充分洗涤未结合的蛋白质等关键点。

同时，针对实验中可能遇到的问题，要积极采取相应的解决方法，以保证实验结果的准确性和可靠性。

染色质免疫共沉淀技术ChIP介绍

染色质免疫共沉淀技术ChIP介绍
1.ChIP的分类
ChIP-Seq：将ChIP与**代测序技术相结合的技术，能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等相互作用的DNA区段。

ChIP-chip：将ChIP与DNA芯片相结合的技术，主要用于特定反式因子靶基因的高通量筛选以及组蛋白修饰和染色体重建。

RIP：RNA结合蛋白**沉淀技术，是研究细胞内RNA与蛋白质相互作用的一项技术。

主要用于研究RNA在基因表达调控中的作用。

ChIP-Re-ChIP：在次ChIP的基础上不解交联，而继续进行另一个目的蛋白的**沉淀，从而得到与两种目的蛋白都结合的DNA序列。

2.染色质免疫共沉淀测序技术优势：
检测覆盖范围广：全基因组范围内扫描目标区域；
检测分辨率高：更利于定位目标区域；
样本需要量低：需要的**沉淀后的DNA量可低至5-10ng；
可靠性好：避免了非特异性杂交，背景低；
性价比高：花费较少即可检测全基因组，获取准确丰富的信息。

3.ChIP试剂盒的选择
由于ChIP实验的操作繁琐、每一步反应需要注意的细节很多，常常需要花费实验者很长的时间才能完成整个实验，而且回收得到的DNA片段可能出现各种各样的问题。

因此，为了帮助广大科研用户解决这些问题，许多商业化的ChIP试剂盒问世。

ChIP 原理及实验方法

染色质免疫沉淀技术（ChIP）实验方法实验原理染色质免疫沉淀技术（ChIP）通过与染色质片段共沉淀和PCR技术，在体内检测与特异蛋白质结合的DNA片段。

ChIP技术最大的优点就是在活体细胞状态下研究了蛋白质和目的基因结合状况，减少了体外实验的误差。

在活体细胞中，先对与调节蛋白结合的染色质进行分离，然后通过一定的方法（例如：超声波）随机剪切染色质，用调节蛋白的抗体沉淀目的染色质，再通过一定手段把目的染色质上的蛋白质去除掉，最后用PCR等方法检测鉴定共沉淀的DNA片段的特性。

仪器和试剂真空设备、涡旋器、液氮、冷冻离心管、离心机、超声波粉碎仪、miracloth 37%甲醛，2M甘氨酸，ddHO，剪切的鲑精DNA/protein A琼脂糖珠(Sant cruz)，2蛋白酶K（14mg/ml）,RNaseA,酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）,氯仿,无水乙醇,提取缓冲液1（EB1）:0.4M蔗糖；10mM Tris-HCl，pH8.0；5mM β-ME；0.1mM PMSF；蛋白酶抑制剂混合物（aprotinin、pepstain A、Leupeptin、Antipain、TPCK、Benzamidine）•提取缓冲液2（EB2）:0.25M 蔗糖；10mM Tris-HCl，pH8.0；10mM MgCl2；1%Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)；5mM β-ME；0.1mM PMSF；蛋白酶抑制剂混合物（同上）提取缓冲液3（EB3）：1.7M蔗糖；10mM Tris-HCl，pH8.0；0.15%Triton X-100；2mM MgCl；5mMβ-ME；0.1mM PMSF；蛋白酶抑制剂混合物（同上）2核裂解缓冲液（NLB）：50mM Tris-HCl，pH8.0；10mM EDTA；1%SDS；PMSF和蛋白酶抑制剂混合物（同上）ChIP稀释缓冲液（ChIP DB）：1.1%Triton X-100；1.2mM EDTA；16.7 mMTris-HCl，pH8.0；167mM NaCl；PMSF和蛋白酶抑制剂混合物（同上）洗脱缓冲液（EB）：1%SDS；0.1M NaHCO3（现配）低盐洗脱液：150mM NaCl；0.1%SDS；1%Triton X-100；2mM EDTA；20mM Tris-HCl，pH8.0高盐洗脱液：500mM NaCl；0.1%SDS；1%Triton X-100；2mM EDTA；20mM Tris-HCl，pH8.0LiCl洗脱液：0.25M LiCl；1%NP-40；1%脱氧胆酸钠；2mM EDTA；20mM Tris-HCl，pH8.0TE缓冲液：1mM EDTA；10mM Tris-HCl，pH8.0实验方法植物材料的准备（以拟南芥为例）1．在覆盖有保鲜膜的土里播上拟南芥的种子。

染色质免疫共沉淀（ChIP）原理及注意事项

染色质免疫共沉淀（ChIP）原理及注意事项【前言】早期，人们就发现在细胞的生命活动中，DNA复制、mRNA转录与修饰以及病毒的感染等，都涉及基因-蛋白质相互作用，很多生理学家都探讨了这种现象的发生过程。

近年来，随着研究的深入，很多医学研究者已经将目光投向了基因-蛋白相互作用，期望在此水平上，另辟蹊径，深入分析癌症、心血管疾病、中央神经系统紊乱等疾病的主要代谢通路和发生机制。

染色质免疫共沉淀（ChIP）作为目前为止唯一的研究体内DNA与蛋白质相互作用的实验方法，深得人心。

很多人都希望接触和掌握此实验技术，希望从组蛋白修饰、转录调控、凋亡等角度深入研究病变机制，进而开发相应的药物。

总之，ChIP是一个有效且重要的实验技术。

下面就来聊聊它。

【正文】能够与DNA结合的蛋白有多种，主要分为组蛋白和非组蛋白。

一方面，染色体是由组蛋白和DNA构成的，组蛋白作为染色体的结构蛋白，可以与DNA形成核小体，组蛋白与DNA的结合关系是固定存在的，因此组蛋白的修饰作用成为研究的关键。

NaCl可解除组蛋白和DNA的交联关系。

（核小体结构图）另一方面，非组蛋白多是参与DNA复制、mRNA转录过程的一些功能蛋白，包括解链酶、切割酶、转录激活蛋白等等，它们与DNA、mRNA的结合关系是瞬时的，发挥完作用可能就及时脱离开了。

ChIP实验原理：在活细胞状态下，通过甲醛固定DNA-蛋白质复合物后，采用微球菌核酸酶（Micrococcal Nucleas）（注：早期使用的超声已经被淘汰了，不推荐使用）随机切断DNA，形成一个个一定长度范围内的染色质小片段，随后通过抗原-抗体特异性结合反应富集、沉淀这些小片段，然后通过对NaC、蛋白酶K解除蛋白质和DNA的交联，分离蛋白，纯化DNA，最后采用PCR检测DNA的序列信息，获取更多信息。

从上面的原理就可以看出，ChIP实验步骤大致可分5步：（1）1%甲醛处理使蛋白质与 DNA 交联；（2）细胞裂解，采用微球菌核酸酶消化形成染色质小片段；（3）抗原-抗体反应，促进免疫沉淀反应；（4）NaCl、蛋白酶 K 处理，解除DNA-蛋白交联；（5）DNA 纯化回收；（6）采用1.8%琼脂糖凝胶电泳、RT-PCR对DNA作进一步分析。

染色质免疫共沉淀(ChIP)实验 DNA实验技术方法汇总

1实验方法原理：在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。

IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。

目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

2. 37℃孵育10 min。

3. 终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125 M。

450 ul 2.5 M甘氨酸于平皿中。

混匀后，在室温下放置5 min即可。

4. 吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。

5. 细胞刮刀收集细胞于15 ml离心管中（PBS依次为5 ml，3 ml和3 ml）。

预冷后2 000 rpm 5 min收集细胞。

6. 倒去上清。

按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。

使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。

这样每100 ul溶液含1×106个细胞。

再加入蛋白酶抑制剂复合物。

假设MCF7长满板为5×106个细胞。

本次细胞长得约为80%。

即为4×106个细胞。

因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。

ChIP实验精讲(做科研的必看)

ChIP实验精讲(做科研的必看)染色质免疫共沉淀（ChIP）概述ChIP：chromatinimmunoprecipitation assay，染色质免疫沉淀技术。

研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。

ChIP是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法原理在活细胞状态下固定“蛋白质-DNA”复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

ChIP应用1、检测体内反式因子与DNA的动态作用，研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系；2、CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-ChIP 方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；3、CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；4、RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。

试验流程一、交联染色质免疫沉淀技术1. 细胞甲醛交联和收集注意事项：①需要优化甲醛使蛋白质和DNA交联的时间。

②交联的时间很关键。

交联的时间一般为2-30 分钟。

③交联过度会降低抗原的可结合性和超声的效率，也会被遮盖抗原的表位。

④甘氨酸可抑制甲醛的作用，终止交联反应。

1.1 取1直径10cm培养皿的细胞。

加入甲醛至终浓度为0.75%（V/V），使蛋白和DNA 交联。

1.2 室温下，轻摇10 分钟。

1.3 加入甘氨酸至终浓度为125 mM，室温下放置5 分钟，以终止交联。

1.4 吸去培养基，用冰冷PBS 洗细胞2 次。

1.5 使用细胞刮刀，加入5ml 冰冷PBS，刮下细胞，收集至一个50 ml 离心管中。

1.6 再用 3 ml 冰冷PBS 洗培养皿2次，至50ml 离心管中。

1.7 4℃，1000 g，离心5分钟收集细胞。

1.8 吸弃上清，用SDSLysis Buffer重悬沉淀（每1 X 107 个细胞加800 μl）。