原代和传代细胞的培养和维持

原代和传代细胞的培养和维持

一、原代细胞的培养与维持

1、静置贴壁细胞(包括半贴壁细胞的培养)

凡经消化液处理实体组织来源的细胞要通过充分漂洗，以尽量除去消化液的毒性，细胞接种时浓度要稍大一些，至少为5×108细胞/L，培养基可用Eagle(MEM)或DNEM培养，小牛血清浓度为10%～80%．在起始的2天中尽量减少振荡，以防止刚贴壁的细胞发生脱落，漂浮。

贴壁细胞长成网状或基本单层时，由于营养缺乏，代谢产物增多，pH变酸，不适宜细胞生长，此时细胞还未长成单层，未达到饱和密度，仍需继续培养，因此，需采取换液方式来更新营养成分以满足细胞继续生长繁殖的需要。其换液方法比较简单，即弃去旧液，加入与原培养液相同的等量完全培养基。

2、悬浮细胞的培养

凡来自外周血、胸腹水、脾脏、淋巴结、骨髓的淋巴细胞、造血干细胞以及

白血病细胞，在原代培养时要尽量去除红细胞．若要将淋巴细胞及白血病细胞进行长期培养，淋巴细胞中要加入生长因子，白血病细胞中要加入少量的原患者血清，以利细胞生长，待细胞开始增殖甚至结成小团块，培养基中pH变酸，说明细胞生长繁殖良好，一般每隔3天需半量换液一次（换液时尽量使细胞不丢失），待细胞增殖加快，浓度明显增加，pH发生明显变化时，此时可考虑传代。

悬浮细胞在未达到饱和密度时，但培养基中的营养成分并不能维持细胞的营养需求时，只能采用半量换液的方式．

二、原代细胞培养的首次传代 (Subculture)

这种使原代细胞经分散接种的过程称之为传代。每进行一次分离再培养称之为传一代，传至5～10代以内的细胞通常称为次代培养细胞，传至10~20代以上的细胞，通常确定为传代细胞（或称传代细胞系）。传代细胞系的建立，关键是初代培养的首次传代。应注意如下几点：

(1)细胞生长密度不高时，或未能达到覆盖整个瓶底时不能急于传代。

(2)原代培养的贴壁细胞多为混杂细胞，形态各异，往往是上皮样细胞和成纤维样细胞并存，采用胰蛋白酶消化时要掌握好消化时间，因成纤维细胞易于脱壁，上皮细胞不易脱壁，因此，可根据需要选用适当的消化时间及时中止消化。在早先传代时，其消化时间比一般已建系的细胞相对长一些。

(3)吹打已消化的细胞要轻巧，既不能听到有明显的吹打声，又不能有大量泡沫在悬液中形成，以尽可能减少对细胞的机械损伤。

(4)首次传代时细胞接种数量要多一些，以利于细胞的生存和繁殖。如果消化分离的细胞悬液有组织块，也一并传入到培养瓶，尽量减少细胞损失。

(5)首次传代培养时的pH不能高，宁可偏低一些。此外，小牛血清浓度可适当加大至15%～20%左右。

三、传代细胞的传代培养

(1)吸除或倒掉原瓶中的旧培养基（以25mL培养瓶为例）。

(2)每瓶加入2mL，无钙、镁PBS，漂洗一次后倒掉。

(3)每瓶加入1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.02%EDTA或混合液），轻轻摇动培养瓶，经消化液铺满所有细胞表面，待细胞层略有松动，肉眼可观察到“薄膜”现象时，倒掉消化液，再继续作用2～3分钟，轻轻摇动，细胞层可随残留的消化液呈片状从瓶壁上脱落下来，在显微镜下可发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大，此时应立即终止消化。

(4)加入完全培养基5mL，用吸管反复吹打瓶壁上的细胞，吹打时要按顺序进行，以确保

所有瓶壁均吹打到，吹打时动作要轻柔，不要用力过大，尽可能不要出现泡沫，以避免

细胞的机械损伤．

(5)用计数板计数，计算细胞的浓度，并用培养基调整适当的细胞浓度后再分瓶培养。

四、传代细胞的建系和维持

1.细胞档案

细胞档案要记录好，如组织来源、生物学特性（由形态、生长繁殖曲线、染色体核型情况、代谢特性、分化特性、病毒敏感性、致瘤特性、有无支原体和潜存病毒等）、培养基的要求、传代换液时间、扩增时间(分裂指数)，细胞的特殊遗传标志(标记染色体)等，这些记录对于保证细胞的正常生长，保持细胞的一致和经长期培养细胞特性的变异比较，都有十分重要的意义。

2.换液传代

(1)细胞系的传代、换液方法与前相同，但一般都有自身的规律性，因而在继续传代时，要注意保持其稳定的规律性，这样可以减少由于传代时细胞密度的频繁增减或换液时间的不规律而导致细胞生长特性的改变，给以后的实验带来影响。

(2)多种细胞系维持传代，要严格操作程序，对所用的试剂各系不能交叉．每传5代后，细胞种子均应冻存。传代时均应作好记录，培养瓶上要有明显标记，标记细胞系名称和传代的代数及传代时间。细胞种子的及时冻存不仅可防止污染丢失，而且还可防止因盲目传代而造成细胞变异，此外还可提供不同代次的细胞同时进行对比试验。

3.细胞系（或株）的鉴定和管理

细胞的纯化和克隆

细胞培养常用培养基有：DMEM（高、中、低糖），M199，IMEM，BME，CMRL，Ham'sF10/F12/F14,MEM,RPMI1640和细胞培养用相关试剂：细胞冻存培养基，血清，胰蛋白酶EDTA消化液，TNS胰蛋白酶中和液，DPBS,HBSS缓冲盐，P/S青链霉素，L-谷氨酰胺等等。

细胞消化中的胰蛋白酶和EDTA：

胰蛋白酶(胰酸)溶液是一种常用的细胞消化液，原代培养时用于处理组织块，使细胞分离下来。胰蛋白酶主要采自牛或猪的胰脏，呈白色粉末状，易潮解，应在低温干燥处保存。胰蛋白酶对细胞的分离效果与细胞的类型、特性和瓶壁表面特性有关。胰酶在pH 8.0、37℃时消化能力最强。溶液中的Ca2+、Mg2+和血清会降低胰酶活力，所以配制胰酶时须用无Ca2+、Mg2+的D-Hanks液。当消化结束时，可加入少量血清或含血清的培养基以终止胰酶作用。细胞传代使用的胰酶浓度是0．25％或0．2％。用于原代细胞培养消化组织块则为0．1％或0．125％; EDTA溶液：EDTA溶液也常用来解离细胞，它的作用机制是破坏细胞间的连接。对于一些贴壁特别牢固的细胞，还可以用EDTA和胰酶的混合液进行消化。EDTA溶液的使用浓度为0.02%，配制时应加碱助溶，配制后可过滤除菌，也可高温消毒灭菌

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