反胶束萃取方法步骤

此外，离子型表面活性剂的反离子并不都固定在反 胶束表面，对于AOT反胶束，约有30%的反离子处 于解离状态，同时，在反胶束“水池”内的离子和 主体于水相中的离子会进行交换，这样，在萃取时 会同蛋白质分子竞争表面活性剂离子，从而降低了 蛋白质和表面活性剂的静电作用力。
另一种解释则认为离子强度（盐浓度）影响蛋白质 与表面活性剂极性头之间的静电作用力是由于离解 的反离子在表面活性剂极性头附近建立了双电层， 称为德拜屏蔽，从而缩短了静电吸引力的作用范围， 抑制了蛋白质的萃取，因此在萃取时要发尽量避免 后者的影响。
临界胶束浓度，是胶束形成所需表面活性剂的最 低浓度，用CMC来表示，这是体系特性，与表面 活性剂的化学结构、溶剂、温度和压力等因素有 关。CMC的数值可通过测定各种物理性质的突变 （如表面张力、渗透压等）来确定，见图10.2。
从图9.2中可以看出表面活性剂十二烷基硫酸钠与溶液 物理化学性质之间的关系，在浓度为0.008mol/L时各 性质都有一个突变现象。
9.2.2 “水壳”模型 （Water-shell Model）
反胶束系统中的水通常可分为两部分， 即结合水和自由水。结合水是指位于反 胶束内部形成水池的那部分水：自由水 即为存在于水相中的那部分水。蛋白质 在反胶束内的溶解情况，可用水壳模型 作解释：大分子的蛋白质被封闭在“水 池中”，表面也存在一层水化层与胶束 内表面分隔开，从而使蛋白质不与有机 溶剂直接接触。
常使用的阳离子表面活性剂名称和结构如下：
– CTAB （cetyl-trimethyl-ammonium bromide） 溴化十六烃基三甲胺
– DDAB（didodecyldimethyl ammonium bromide） 溴化十二烷基二甲铵
– TOMAC（trioctylmethyl ammonium chloride） 氯化三辛基甲铵
反胶束萃取
随着基因工程和细胞工程的发展，尽管传统的分离方法 （如溶剂萃取技术）已在抗生素等物质的生产中广泛应 用，并显示出优良的分离性能，但它却难以应用于蛋白 质的提取和分离。其主要原因有两个：一是被分离对 象—蛋白质等在40~50℃便不稳定，开始变性，而且绝大 多数蛋白质都不溶于有机溶剂，若使蛋白质与有机溶剂 接触，也会引起蛋白质有变性；二是萃取剂问题，蛋白 质分子表面带有许多电荷，普通手离子缔合型萃取剂很 难奏效。因此研究和开发易于工业化的、高效的系列化 物质分离方法已民为当务之急。反胶束萃取法就是在这 一背景下发型起来的一种新型分离技术。
1977年，瑞士的Luisi等人首次提出用反胶束萃取蛋白 质，但并未引起人们的广泛注意。直到80年代，生物 学家们才开始认识到其重要性，荷兰的Van’t Riet和 Dekker、美国的Gokelen和Hatton首先进行了反胶束萃 取蛋白质的研究。近年来该项研究已在国内外深入展
开，从所得结果来看，反胶束萃取具有成本低、溶剂
由于实验方法不同，所得的CMC值往往给于完全一致， 但是突变点总是落在一个很窄的浓度范围内，故用 CMC范围来表示更为方便。
表9.2是几种类型表面活性剂的CMC值，可以看出， CMC值与活性剂的结构有一定的联系。在非极性溶剂 中CMC值的变化范围是
1.0×10-4~1.0×10-3mol/L。
9.1.3 胶束与反胶束的形成
正常胶束（，结构示意图见图10.3（a）。
– 在胶束中，表面活性剂的排列方面是极性基团在外，与 水接触，非极性基团在内，形成一个非极性的核心，在 此核心可以溶解非极性物质。
反胶束，其结构示意图见图10.3（b）。
– 在反胶中，表面活性剂的非极性基团在外与非极性的有 机溶剂接触，而极性基协和则排列在内形成一个极性核 （polar core）。此极性核具有溶解极性物质的能力，极 性核溶解水后，就形成了“水池”（water pool）。
当W0超过60（最大含水量）时，透明的反胶束溶液将 变浑浊，并发生分相。对于季铵盐形成的反胶束， W0一般小于3。在列平衡水相存在的情况下，W0可以 人为地在一定范围内调节。
9.2 反胶束萃取蛋白质的基本原理
9.2.1 三元相图及萃取蛋白质 对一个由水、表面活性剂和非极性有机
溶剂构成的三元系统，存在有多种共存 相，可用三元相图表示，如图10.5是水AOT-异辛烷系统的相图示例。
将阳离子表面活性剂如CTAB溶于有机溶 剂形成反胶束时，还需加入一定量的助 溶剂（助表面活性剂）。
反胶束的必要几何条件是堆砌率
(V/L)/a0>1
（为V为在碳表氢面链活平性均剂体极积性，头L面为积碳）氢。链的长度，a0
9.1.2 临界胶束浓度 （Critical Micelle Concentration）
（2）位阻效应 许多亲水性物质、如蛋白质、核酸及氨基酸等，都可
以通过溶入反胶束“水池”来达到它们溶于非溶剂中 的目的，但是反胶束“水池”的物理性能（大小、形 状等）及其中水的活度是可以用W0的变化来调节的， 并且影响大分子如蛋白质的增溶或排斥，达到选择性 萃取的目的，这就是所谓的位阻效应。
反 胶 束 萃 取 中 的 W0 ， 随 表 面 活 性 剂 的 HLB增大而提高，对于离子型表面活性 剂，还与极性头所处环境的介电性能有 关，水溶液的介电常数K有影响，如下式 所示：
Rm 3W0 MW / aau N a W
式中 MW、ρW分别为水的相对分子质量和密度；Na为 阿伏伽德罗常数； aau为表面活性剂，在室温下， aau=0.5~0.7nm，并可近似认为是一常数；
W0为每个反胶束中水分子与表面活性剂 分子数值的比值，假定表面活性剂全用 于形成反胶束并忽略有机溶液中的游离 水、则W0等于反胶束溶液中水与表面活 性剂的摩尔浓度比值：
实际上，似乎存在着一个临界水含量W临，当 W0>W临，水含量对蛋白质萃取充影响很小，而 当W0<W临时萃取率急剧下降。例如在CTAB-正 已醇-正辛烷系统萃取BSA实验时得到W临≈30， 由式（10.1）计算出Rm=4.48nm（取a0=0.6nm2）， BSA的流体力学半径r=3.59nm，再考虑水壳厚度
在反胶束萃取蛋白质的研究中，用得最多 的 是 阴 离 子 表 面 活 性 剂 AOT （AerosolOT），其化学名为丁二酸-2-乙 基已基酯磺酸钠，结构式见图10.1。
这种表面活性剂容易获Fra Baidu bibliotek，其特点是具有双链， 极性基团较小，形成反胶束时不需加助表面活性 剂，并且所形成的反胶束较大，半径为170nm， 有利于大分子蛋白质进入。
d ln k
d1/
e2 2K BT
Z
2
r
Z
2
r
式中 e为单位电荷；KB为波尔兹曼常数； T为热力学温度，Z-、Z+分别为负离子和 正离子的价数；r-、r+分别为负离子和正 离子半径。
从上式可见，降低介电常数ε，将使解离平衡 常数K减小，即解离平衡偏向未电离的一边， 此时离子型表面活性剂变得更加疏水，即HLB 变小，因此可通过调节水相及有机相的参数， 来影响表面活性剂的HLB大小，从而改变W0的 增减方向。
当含有此种反胶束的有机溶剂与蛋白质的水溶 液接触后，蛋白质及其他亲水物质能够通过螯 合作用进入此“水池”，由于周围水层和极性 基团的保护，保持了蛋白质的天然构型，不会 造成失活。蛋白质的溶解过程和溶解后的情况 示意于图10.4中。
9.1.4 反胶束的形状与大小
从上可知，用于萃取蛋白质等生化物质的胶束是反胶束， 反胶束的形状通常为球形，也有人认为是椭球形或棒形； 反胶束的半径一般为10~100nm，可由理论模型推算， 计算公式如下：
约为1nm，因此从几何角度来看，这一临界值是
合理的。
通常，反胶束溶液在W0>40，两相间界面 张力<0.2mN/m时，系统就不稳定了，因
此能用的反胶束最大半径Rm=6nm，所以 反胶束萃取适用于相对分子质量低于
100000（r=5nm）的蛋白质分子。
9.2.3.2 反胶束萃取中蛋白质的分配特性
当pH=pI时，蛋白质呈电中性；pH<pI时,蛋白质带正电 荷；pH>pI时，蛋白质带负电荷，即随着pH的改变， 被萃取蛋白质所带电荷的符号和多少是不同的。
因此，如果静电作用是蛋白质增溶过程的主要 推动力，对于阳离子表面活性剂形成的反胶束 体系，萃取只发生在水溶液的pH>pI时，此时蛋 白质与表面活性剂极性头间相互吸引，而pH<pI 时，静电排斥将抑制蛋白质的萃取，对于阴离 子表面活性剂形成的反胶束体系，情况正好相 反。
P nM PM n
反应达到平衡时，其平衡常数Ka为：
9.1 反胶束溶液形成的条件和特性
反胶束溶液是透明的、热力学稳定的系统。 反胶束（reversed micelle）是表面活性剂 分散于连续有机相中一种自发形成的纳米 尺度的聚集体，所以表面活性剂是反胶束 溶液形成的关键，应该首先介绍。
9.1.1 表面活性剂
表面活性剂是由亲水憎油的极性基团和亲 油憎水的非极性基团两部分组成的两性分 子，可分为阴离子表面活性剂、阳离子表 面活性剂和非离子表面活性剂，它们都可 用于形成反胶束。常用的表面活性剂及相 应的有机溶剂见表10.1。
W0≈[H2O]/[Surfactant]。
在反胶束溶液与水相平衡的情况下，W0值取决 于表面活性剂的种类、助表面活性剂、水相中 盐的种类和浓度等等。
对AOT/异辛烷/H2O体系
当W0=50时，反胶束的流体力学半径为18nm，每个反 胶束中的表面活性剂分子数为1380，而极性核表面 的AOT分子的有效极性基团面积可达0.568nm2。
蛋白质进入反胶束溶液是一种协同过程，即在宏 观两相（有机相和水相）界面的表面活性剂层， 同邻近的蛋白质发生静电作用而变形，接着在两 相界面形成了包含有蛋白质的反胶束，此反胶束 扩散有机相中，从而实现了蛋白质的萃取，其萃 取过程和萃取后的情况见图10.6。
改变水相条件（如pH值和离子种类及其强度等） 又可使蛋白质由有机相重新返回水相，实现反萃 取过程。
许多反胶束萃取的实验研究已经表明，随着W0的降低， 蛋白质的萃取率也减少，说明确实存在一定的位阻效 应。如有人用正已醇作助表面活性剂与CTAB一起形成 混合胶束来萃取牛血清蛋白（BSA），由于正已醇会 使池内溶液的ε减少从而使HLB减小，因此W0变小，使 BSA的萃取率降低，由于醇分子不带电荷，所以正已 醇含量对萃取率的影响，不可能是静电作用，而只有 是位阻效应（W0变化）所引起的。
反胶束萃取过程的分配特性不仅取决于起始两相联系 结构和性能，并且随着蛋白质进入反胶束还会使反胶 束的结构发生变化，所以定量分子热力学模型的建立 既复杂又困难。根据上面介绍的“水壳”结构模型， 可提出一种唯象热力学模型。
假设一分子的蛋白质P与n个空胶束M作用，形成了蛋 白质-胶束配合物PMn，其化学平衡式可写为：
水壳模型很好地解释了蛋白质在反胶束内的状况， 其间接证据较多，
①从似弹性光散射的研究证实在蛋白质分子周围至少存 在一个单分子的水层；
②a-糜蛋白酶在胶束中的荧光特性与主体水中很相像； ③反胶束中酶所显示的动力学特性接近于主体水中等，
这些事实都有力地支持了水壳模型。
此外，尚有几种别的解释模型，但以水壳模型证 据最多，也最为常用。
9.2.3 蛋白质溶入反胶束溶液的推动力与 分配特性
9.2.3.1 推动力 蛋白质溶入反胶束溶液的推动力主要包
括表面活性剂与蛋白质的静电作用力和 位阻效应。
（1）静电作用力
在反胶束萃取体系中，表面活性剂与蛋白质都是带电 的分子，因此静电相互作用肯定是萃取过程中的一种 推动力。其中一个最直接的因素是pH值，它决定了蛋 白质带电基团的离解速率及蛋白质的净电荷。
可反复使用、萃取率和反萃取率都很高等突出的优点。
此外，反胶束萃取还有可能解决外源蛋白的降解，即
蛋白质（胞内酶）在非细胞环境中迅速失活的问题，
而且由于构成反胶束的表面活性剂往往具有溶解细胞
的能力，因此可用于直接从整细胞中提取蛋白质和酶。
可见，反胶束萃取技术为蛋白质的分离提取开辟了一 条具有工业开发前景的新途径。