免疫分析技术基本原理

免疫分析技术基本原理

免疫分析技术基本原理

利用抗原、抗体之间的特异性结合来测定、分析特定物质的方法

✧抗原：可诱导动物免疫系统产生免疫应答的物质。按

其引起免疫应答的能力分半抗原、抗原、超抗原。

✧抗体：由动物免疫系统产生，可特异性结合某种物质

的免疫球蛋白。分IgG、IgM、IgE、IgA、IgD 五个亚型。不同亚型针对同一抗原表位的结合位点的结构相同。不同亚型出现的先后顺序不同，在血清中的含量不同，在机体中出现的地点不同。

抗原抗体反应的特性

1可逆性

抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：

Ag+Ab→Ag·Ab

抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab] ,Ag·Ab的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性

2特异性

抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。

测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。

3最适比例

4敏感性

化学比色法的敏感度为mg/ml水平。

酶反应测定法的敏感度约为5-10μg/ml。

免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿。

标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平。例如，HBsAg，其敏感度可达0.1ng/ml。

固相免疫测定的原理

基础:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。

双抗体夹心法原理

此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。

双抗原夹心法原理

用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBsAg的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。

间接法原理

间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。

竞争法的原理

小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。

俘获法原理

IgM的检测常用于传染病的诊断。用抗人IgM抗体包被

固相，以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）。此法常用于病毒性感染的早期诊断。

生物素－亲合素法

①：固相支持物；

②：固相化抗原；

③：特异性IgG（待检物）；

④：生物素化抗小鼠IgG （Biotin）；

⑤：辣根过氧化物酶HRP-酶标链亲和素（Avidin）；

⑥：底物及显色剂；

⑦：显色。

阳性/假阳性

阳性（positive, P）：在给定的某一判定标准下，某一测量结果符合存在条件的称为阳性。例如ELISA实验中规定，标本的测量结果大于界值判定为阳性。

假阳性：真实结果不满足存在的条件，由于某些因素的干扰，导致测量结果满足存在条件的称为假阳性。

在表述阳性或者假阳性时，测量方法、测量对象和适用范围一定要具体。例如，我们经常说某人HCV阳性，严格的说这是一个不规范的说法。因为可以理解为这么多的意思：此人是丙肝患者；此人HCV抗原阳性；此人HCV 抗体阳性（可能是患者也可能不是患者）；此人HCV RNA 阳性；等等等等。

阴性/假阴性

阴性（Negtive,N）：在给定的某一判定标准下，某一结果不符合存在条件的称为阳性。

假阴性：真实结果满足存在的条件，由于某些因素的干扰，导致测量结果不满足存在条件的称为假阴性。

在表述阴性和假阴性时，和表述阳性/假阳性一样，测量方法、测量对象和适用范围一定要具体。

样本/标本/临床标本

样本：在统计里, 我们把所要考察对象的全体叫做总体, 其中每一个考察对象叫做个体, 从整体中所抽取的一部分个体叫做总体的一个样本。样本是一个统计学的概念，样本往往不只包含一个个体。

标本（Sample, S）：在给定的考察或测量方法中的具体测量对象，往往和统计学的个体等价。例如在ELISA实验里，HCG有测血样的也有测尿样的，对应的血样或尿样叫这个测量方法的标本。

临床标本：在检验技术中，直接从机体采集的，经过处理而适用于临床检验的标本。例如从人体采集的抗凝血清叫临床标本，而经过稀释或浓缩的标本只能称为稀释标本或浓缩标本而不能称之为临床标本。

医学决定水平

医学决定水平（Medicine decide level , MDL）：是指不同于参考值的另一些限值，通过观察测定值是否高于或低于

这些限值，可在疾病诊断中起排除或确认的作用，或对某些疾病进行分级或分类，或对预后作出估计，以提示医师在临床上应采取何种处理方式，如进一步进行某一方面的检查，或决定采取某种治疗措施等等。

随着检测技术的进步，某一检测指标检测灵敏度的提高，临床意义的改变，往往能改变某一疾病的医学决定水平。例如某些激素项目的超敏试剂盒能帮助医师判定疾病的进程及处理对策。

金标准

金标准：现有条件下最科学最准确的标准。在检验学中指的是某种疾病标志物的确证实验。如菌体培养，组织切片，组织活检，抗体条带免疫印迹（WB），核算诊断等等。

ELISA方法往往只检验某种疾病众多表征或标志物中最具代表性或最具操作性的一种或几种，即通常所说的初筛实验，追求的是灵敏、简便和快速，而这些表征或标志物的检出不能确证患病与否，所以需要更进一步的确证实验。

对照实验

对照实验（control experiment ）：一般进行某种试验以阐明一定因于对一个对象的影响和处理效应或其意义时，除了对试验所要求研究的因子或操作处理外，其他因素都保持一致，并把试验的结果进行比较，这种试验称为对照试验。目的是通过对比实验的结果找到想要研究的因素对实