质粒转化大肠杆菌实习报告--附实验图片

细胞转基因技术研究进展

1实验内容：原核细胞转基因:大肠杆菌感受态细胞的制备, 转化和鉴定

2实验原理及技术介绍：

细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。但是在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。

所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA的结合和加工等。细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。而且，细菌的感受态是在短暂时间内发生。目前对感受态细胞能接受外来DNA分子的本质看法不一。主要有两种假说:一种是局部原生质体化假说——细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA分子能通过质膜进细胞。另一种是酶受体假说——感受态细胞的表面形成一种能接受DNA的酶位点，使DNA分子能进入细胞。

本实验通过CaCl2对特定的大肠杆菌处理，制备感受态的细菌。这些细菌可使每微克超螺旋质粒DNA，如一些插入目的DNA片段的重组质粒，产生5×106~2×107个转化的菌落。当质粒与这些大肠杆菌混合后，质粒粘附在大肠杆菌的表面，在42℃的温度时，大肠杆菌出现热休克，质粒可通过大肠杆菌细胞膜上形成的空隙进入菌体内。随后，加入LB培养液，于37℃振动培养可使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性基因，提高转化效率。转化成功的大肠杆菌可以在相应抗生素培养皿中传代，形成菌落。

本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与质粒共保温,实现转化。由于质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Amp)，可通过Amp抗性来

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筛选转化子。如受体细胞没有转入PBS，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp 培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了PBS。

质粒转化大肠杆菌的主要有两个用途:1、重组质粒的鉴定。2、为扩增质粒和其它载体作准备。

3材料,试剂与设备

3.1材料

E.coli DH5α菌株:Rˉ,Mˉ,Ampˉ；质粒DNA——实验室提供，eppendorf管。

3.2设备

恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱, 恒温水浴锅, 制冰机,微量移液枪。

3.3试剂

1.LB培养基：胰蛋白胨10g/L, 酵母膏提取物5g/L, NaCl 10g/L,琼脂1510g/L, PH=7.4, 121℃高压灭菌20min。

2.Amp母液：实验室配制

3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后涂板。

5.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2 (无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。

4操作步骤

4.1受体菌的培养

从LB平板上挑取新活化的 E.coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。

4.2感受态细胞的制备 (CaCl2法)

1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。

2、弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。

3、弃去上清,加入200ul预冷0.05mol/L的CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。

4、感受态细胞分装成200μl的小份。

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4.3 转化

1、从4℃冰箱中取200μl 感受态细胞悬液，立即置冰上。

2、 加入质粒DNA 溶液(含量不超过50ng ,体积不超过10μl ),轻轻摇匀,冰上放

置30分钟后。

3、42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。

4、向管中加入1ml LB 液体培养基(不含Amp ),混匀后37℃振荡培养10—30min ,

使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Amp )。

5、将上述菌液摇匀后取15μl 涂布于含Amp 的筛选平板上,再用塑料带密封，然

后正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。 同时做两个对照:

对照组1：以同体积的无菌双蒸水代替DNA 溶液,其它操作与上面相同。此组正

常情况下在含抗生素的LB 平板上应没有菌落出现。

对照组2：以同体积的无菌双蒸水代替DNA 溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于

不含抗生素的LB 平板上，此组在正常情况下应产生大量菌落。

5 结果

5.1结果照片如下：

实验组 ：Amp+质粒

对照组1 ：Amp+水