实验四动物免疫与佐剂制备
兽用疫苗保护剂和佐剂
兽医生物制品常用的保护剂
1．5%蔗糖（乳糖）脱脂乳保护剂
蔗糖（或乳糖） 5g，加脱脂乳至 100ml，充分溶解后，110~116℃高压灭菌 30~40 min。
2．明胶蔗糖保护剂
明胶 2%~3%（g/m1）、蔗糖5%（g/m1）、硫脲 1%~2%（g/m1）。先 将 12%~18%明胶液、 30%蔗糖液和 6%~12%硫脲液加热溶解， 116℃高压 灭菌30~40min；
1. 营养液： • 可修复因冻干而受损的细胞，使冻干制品含有一定量水分；
• 可促进高分子物质形成骨架，使冻干制品呈多孔的海绵状，
增加溶解度 2. 赋形剂： • 防止低分子物质的碳化和氧化，保护活性物质不受加热影响 • 使冻干制品形成多孔性、疏松的海绵状物，增加溶解度 3. 抗氧化剂： • 抑制冻干制品中的酶作用，增加生物活性物质在冻干后贮存
7．脂质分子类佐剂：脂多糖、Vit A和Vit E等脂溶性维生素
8．其他：霍乱毒素（CT）、百日咳毒素（PT）和破伤风类 毒素（TT）等；脂磷壁酸（LTA）；维生素B12等。
氢氧化铝胶 (铝胶）
合成方法:
（1）用铝粉加烧碱合成法
2Al(OH)3+12H2O+3H2SO4→Al2(SO4)3· 18H2O
兽用疫苗冻干保护剂 和佐剂
冻干保护剂（稳定剂）
保护剂：又称稳定剂（stabilizer） ，是指一类能防止生 物活性物质在冷冻真空干燥时受到破坏的物质。（指对疫 苗生产、血清制备等） 保护剂用途（不同用途加不同保护剂, 主要针对活的微生 物或细胞） ① 菌种或毒种保存：常用甘油作保护剂 ② 细胞株保存：常用二甲基亚砜(DMSO) DMSO:二甲基亚砜，一种细胞的保护剂 ③ 疫苗冷冻真空干燥制备时：加脱脂乳（或二甲基亚 砜）和蔗糖等（不同国家有不同配方） ④ 干扰素类生物活性物质的保存：加葡聚糖
兽用疫苗保护剂与佐剂(57页)
• 50＜：运动粘度71112 / 3左右 *紫外吸收八25()-35()＜(). 1 %，紫外消光系数＜12X108； •单环芳烃 与双环芳烃含量低干0.5%，无多环芳烃； •小鼠腹腔注射0+51111或家免皮下注射2.01111^油，观察60山 表现正
常。
乳剂配方与乳化方法
(1) 剂在水屮法： 将乳化剂直接溶于水中，在激烈搅拌下将油加入，可直接生 成0州乳剂。若欲
得从/0型，可继续加入油，直到发生变型。该 法通常用匀浆器或胶体磨，高速搅
拌而得到较好的乳ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ。
(2) 剂在油屮法：
将乳化剂溶于油相，将油相直接加入水相屮得如水相 直接加入油相，得到〜
/0型，如欲得0/〜，继续加入至变型。该 法制成的乳剂，一般均匀颗粒直径在 0.5^0!左右，比较稳定。
蔗糖76.626、磷酸二氢钾0.528,磷酸氢二钾1.648、谷氨酸钠0.»相、牛血 淸白蛋 白10心 加去离子水至1000111],混合溶解，过滤除菌、
免度佐剎
一、佐剂概念与作用机理
1.佐剂（新概念）：凡是可以增强抗原特异性免疫应答的物 质称为佐剂。
佐剂（旧概念）：当一种物质先于抗原或与抗原混合或同 时注射于动物 体内，能非特异性地改变或增强机体对该抗 原的特异性免疫应答，发挥 其辅佐作用的物质.
施汽吹沸熟化10111«»调节卩14 6.9土
6万皁升沸水屮，搅拌均 匀;倒入
0.1，继续熟化3111111»稳定卩?1
硫酸100kg,爆沸至棕 褐色，经30
6.9 十 0+1
〜后，加温 水，边加边搅拌约垔
总踅为 357；升：用前加水稀杼
至 100万品扑，温度约为80°0, 盛
抗体的制备方法与原理
抗体的制备方法与原理抗体是一种能够识别和结合特定抗原的蛋白质，广泛应用于医学诊断、治疗和研究领域。
抗体的制备方法包括动物免疫和体外选择性放大两种主要途径。
以下将详细介绍这两种方法及其原理。
一、动物免疫法制备抗体动物免疫法是制备多种特异性抗体的主要方法，常用的动物包括小鼠、兔子、大鼠等。
制备抗体的主要步骤如下：1.抗原选择：首先需要选择目标抗原，可以是蛋白质、多肽、糖蛋白、核酸等。
抗原应具有免疫原性，能在动物体内引起免疫反应。
2.免疫原免疫：将抗原与适当的佐剂混合后注射到动物体内，佐剂可以增强抗原的免疫原性，如完全弗氏佐剂、佐科克佐剂等。
注射的剂量和时间间隔需根据具体实验目的和动物种类进行优化。
3.收集血清和分离抗体：免疫一定时间后，收集动物的全血或血清，离心分离血清，其中包含了目标抗体。
4.抗体纯化：通常使用亲和层析、凝胶过滤层析等方法将血清或血浆中的抗体纯化出来。
亲和层析是最常用的抗体纯化方法，利用特定配体或抗原结合柱将目标抗体捕获，再洗脱得到纯抗体。
二、体外选择性放大法制备抗体体外选择性放大法是指通过技术手段进行人工放大和筛选特定抗体，主要包括以下步骤：1.生成抗体文库：将来自多个个体免疫系统的B细胞或血浆细胞收集起来，提取RNA或DNA，然后利用逆转录酶合成cDNA或文库，得到抗体基因的cDNA文库。
2.构建抗体显示系统：将抗体基因文库插入适当的表达载体中，如噬菌体、酵母、哺乳动物细胞表达系统等。
3.筛选特异性抗体：利用高通量筛选技术，如细胞表面展示、比对深度测序等，可通过抗原结合的特异性来筛选出具有高亲和力的抗原结合片段或全长抗体。
4.抗体表达和纯化：通过选择后的抗体基因进行表达，再经过蛋白纯化和检验等步骤，最终得到目标抗体。
抗体制备的原理主要是基于免疫系统的免疫应答机制。
当机体受到抗原的刺激后，机体会产生一系列免疫应答，其中包括B细胞的活化和分化。
经过抗原的结合和识别，B细胞会分泌具有高亲和力的抗体。
单克隆抗体制备
单克隆抗体制备1. 免疫动物：三只Balb/c小鼠2. 佐剂：首先用完全弗氏佐剂（CFA），后用不完全弗氏佐剂（IFA）。
3. 免疫原：蛋白或KLH偶联多肽。
每次免疫使用50-100µg免疫原。
4. 免疫：用PBS稀释免疫原，然后与相应的佐剂1：1混合。
抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在小鼠双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后腿进行肌肉注射。
每个区域大约用1/8的免疫原。
接着将1/2的免疫原进行腹腔注射，这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。
以后每个星期进行腹腔注射直到达到要求的效价。
5. 第0星期预采血完全弗氏佐剂（CFA）混合的100µg抗原免疫小鼠。
第2星期完全弗氏佐剂（CFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。
第3星期不完全弗氏佐剂（IFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。
第4星期溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
第5星期取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
第X星期取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
6. 杂交瘤融合和筛选：用PEG方法将效价最好的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞F0进行融合。
用抗原对融合的杂交瘤克隆进行筛选，检测它们的特异性和敏感性。
ELI SA阳性的克隆可用WB检测，筛选出来的克隆至少还需要亚克隆两次。
7. 大规模抗体生产：筛选得到两个克隆最后进行大规模培养（每个克隆1L）或者取腹水（每个克隆5只小鼠）。
用蛋白A/G对培养液或腹水进行纯化，平均每个克隆可以得到3-5mg 抗体。
8. 注意：每个融合平均可以得到900多个克隆，对于多肽抗原可以得到100个左右的ELISA阳性克隆，重组蛋白抗原可以得到100-150个ELISA阳性克隆。
亚克隆实验做的越早，越容易保存克隆。
因此，为了保存和复苏阳性克隆，尽早进行筛选检测是必需的。
免疫血清的制备实验报告
免疫血清的制备实验报告
《免疫血清的制备实验报告》
实验目的：
本实验旨在通过免疫反应制备免疫血清，以便用于后续的免疫学研究和临床诊断。
实验材料和方法：
1. 实验动物：选择适合的实验动物，如小鼠或兔子，进行免疫原注射。
2. 免疫原制备：根据研究需要选择合适的抗原，并进行纯化和浓缩处理。
3. 免疫程序：将免疫原与适宜的佐剂混合，然后注射到实验动物体内，以激发免疫反应。
4. 血清采集：在免疫原注射后，定期采集实验动物的血清样本，以监测抗体水平。
5. 血清制备：通过离心和沉淀的方法，从血清中分离出免疫球蛋白，得到免疫血清。
实验结果：
经过一系列的免疫程序和血清采集，成功制备得到了免疫血清。
通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫印迹（Western blot）等方法，验证了免疫血清中存在特定的抗体，具有对应的特异性和亲和力。
实验结论：
本实验成功制备了具有特定抗体的免疫血清，为后续的免疫学研究和临床诊断提供了重要的实验材料。
免疫血清的制备过程复杂而精细，需要严格控制各个环节，以确保免疫血清的质量和稳定性。
实验意义：
免疫血清作为一种重要的实验试剂，在免疫学研究和临床诊断中具有广泛的应
用前景。
通过本实验的制备过程，可以更好地理解免疫反应的机制，为疾病的
诊断和治疗提供重要的实验依据。
同时，免疫血清的制备也为相关领域的科研
人员提供了一种重要的实验技术和方法，有助于推动免疫学研究的进展和应用。
动物免疫技术实验报告
动物免疫技术实验报告实验目的：本实验旨在通过动物免疫技术，研究动物体内对特定抗原的免疫应答机制，以及免疫后产生的抗体特性，为进一步的免疫学研究和疫苗开发提供理论基础和实验数据。
实验材料：1. 实验动物：健康成年小鼠，体重20-25g。
2. 抗原：纯化的蛋白质抗原。
3. 佐剂：弗氏佐剂。
4. 免疫试剂：PBS缓冲液、EPPENDORF移液枪、离心管等。
5. 检测试剂：ELISA试剂盒。
实验方法：1. 抗原制备：将蛋白质抗原与弗氏佐剂混合，制备成免疫原。
2. 免疫程序：将小鼠随机分为实验组和对照组。
实验组小鼠在第0天和第14天分别进行皮下注射免疫原，对照组小鼠注射等量的PBS缓冲液。
3. 采血：免疫后第28天，对小鼠进行心脏采血，分离血清。
4. 抗体检测：采用ELISA方法检测血清中特异性抗体的浓度和活性。
实验结果：1. 免疫后小鼠血清中特异性抗体水平显著升高，与对照组相比有显著性差异（P<0.05）。
2. 抗体的亲和力和特异性通过ELISA实验得到了验证，显示出良好的免疫效果。
3. 实验组小鼠在免疫过程中未出现明显的不良反应，说明免疫原的安全性良好。
实验讨论：本实验通过动物免疫技术成功诱导了小鼠产生特异性抗体，为研究免疫应答机制提供了实验依据。
实验中使用的弗氏佐剂作为一种有效的免疫增强剂，显著提高了免疫效果。
此外，通过ELISA方法对抗体的检测，进一步证实了免疫原的有效性和特异性。
结论：动物免疫技术是一种有效的研究免疫应答的方法，本实验成功地诱导了小鼠产生特异性抗体，为免疫学研究和疫苗开发提供了有价值的数据。
未来的研究可以进一步探索不同抗原和佐剂的组合，以及免疫程序的优化，以提高免疫效果和疫苗的保护力。
参考文献：[1] 张三, 李四. 免疫学基础与技术[M]. 北京：科学出版社，2015.[2] 王五, 赵六. 动物免疫技术在疫苗研究中的应用[J]. 中国免疫学杂志，2018, 34(2): 123-128.实验日期：2024年4月21日实验人员：XXX指导老师：XXX[注：以上内容为示例文本，实验数据和参考文献需根据实际实验情况进行调整。
兽医生物制品处理技术—佐剂配制技术
一、实验目的： 掌握白油佐剂的制备方法 二、实验器材： 1.共用：10号白油、Span-80、硬脂酸铝、天平、称量纸等。 2.每组所需：1个电炉（最好有石棉网）、2个玻璃烧杯、1个 玻璃捧、1个100ml量筒、1个10ml量筒等。
白油佐剂制备
三、实验方法： 1.按10号白油94ml，硬脂酸铝2g，Span-80 6ml的比例混合。 2.将白油和Span-80在电炉上微加热混合至透明。 3.然后取少量混合液加入硬脂酸铝，加热使其完全熔化。 4.再放入全量混合液中，充分混合。 5.高压蒸汽灭菌，110℃加热30min，冷却至50℃左右，再用力 振摇至透明均质状，即为白油佐剂（油相）。
➢ 例：破伤风明矾沉降类毒素 气肿疽明矾菌苗
钾明矾
常用的兽医免疫佐剂
➢ 明矾佐剂苗制备方法 取精制钾明矾配成10%溶液，高压灭菌后冷却至25℃以下， 按1%-2%加入pH8.0±0.2的灭活菌液中，充分振摇即为明矾 佐剂苗。
常用的兽医免疫佐剂
3.弗氏佐剂 ➢ 由匈牙利细菌学家Freund(1935年)
白油佐剂制备
四、注意事项： 油相制备时，温度和时间要掌握好，要使Span-80和硬脂酸 铝充分溶解。
常用的兽医免疫佐剂
1.氢氧化铝胶佐剂 2.明矾佐剂 3.弗氏佐剂 4.油乳佐剂 5.蜂胶佐.氢氧化铝胶佐剂
氢氧化铝胶又称铝胶，其佐剂活 性与质量密切相关。质优的铝胶 分子细腻，胶体状态良好、稳定 ，吸附力强，含Al（OH）3约2% （AlO3为1.3%），保存2年以上 吸附力不变。
树脂，并混入蜜蜂上颚分泌物，以及蜂蜡、花粉及其他一 些有机与无机物的一种天然物质。 蜂胶是一种蜂产品,含有多种氨基酸、酶、多糖、脂肪酸 、维生素及化学元素，是一种优良的天然药物。
佐剂及灭活疫苗的制作
氢氧化钠合成法。其中，用铝粉加烧碱合成法最为常用，其基本原理为：
2Al(OH)3 十 12H2O 十 3H2SO4→Al2(SO4)3·18H2O。 Al2(SO4)3·18H2O 十 6NaOH→2Al(OH)3 十 2Na2SO4 十 18H2O。 用三氯化铝与氢氧化钠合成，此法合成的铝胶含量低，透明无沉淀，目前广泛用于制备人用生物
二、实验内容
1、配制白油佐剂； 2、配制氢氧化铝胶佐剂； 3、配制蜂胶佐剂。
三、实验原理
油佐剂、氢氧化铝胶和蜂胶常用于兽用灭活疫苗。佐剂活性与质量密切相关，优质佐剂应具备分子
细腻、胶体性良好、稳定和吸附力强等特点。 （一）油佐剂由矿物油和乳化剂组成。矿物油应不含多环芳烃化合物、粘度低、无色、无味和无毒性。
六、注意事项
1、灭活要彻底，以免影响疫苗的安全性。 2、水相制备时，使抗原与 Tween-80 充分混匀。 3、乳化时，注意将油相冷却后再乳化，以防油温过高使抗原性降低。 4、注意先加入油相后再加入水相，充分搅拌。
七、实验结果记录
八、实验总结
——本资料由王印整理，难免错误——
6
《动物生物制品学》实验课程
实验三、兔病毒性出血症组织灭活疫苗的制备
专业：
姓名：
学号：
成绩：
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一、实验目的
1、了解并掌握兔病毒性出血症组织灭活疫苗的制备程序。
二、实验内容
1、兔病毒性出血症病毒增殖和组织灭活疫苗的制备。
三、实验原理
兔病毒性出血症病毒可引起兔严重疾病，病毒培养困难，现仍然没有发现适应病毒体外培养的细胞
六、注意事项
1、硫酸有很强的腐蚀性，应放在耐酸搪瓷缸配置，操作要十分小心，防止爆沸时溅出，造成伤害。 2、氢氧化铝具有较强的吸附力，所以制胶过程中一般用软化水或去离子水洗涤。 3、氢氧化铝胶为两性化合物，过酸或过碱都会失去胶态，故要掌握好化合时的 pH。 4、油相制备时，温度和时间要掌握好，要使 Span-80 和硬脂酸铝充分溶解。
抗体制备流程
抗体制备流程一、背景介绍抗体是免疫系统产生的一种蛋白质，具有高度的特异性和亲和力，广泛应用于生命科学领域。
抗体制备是指从动物血清或单克隆细胞中提取纯化抗体的过程。
本文将介绍抗体制备的详细流程。
二、材料准备1. 动物：常用小鼠、大鼠、兔子等；2. 抗原：根据实验需要选择适当的抗原；3. 组织破碎液：可以使用高渗盐溶液、甘油等；4. 纯化柱：可以使用蛋白A/G，蛋白L等；5. 色谱柱：可以使用离子交换柱、大小分离柱等。
三、抗原制备1. 合成或提取目标分子作为抗原；2. 重组表达目标分子作为抗原；3. 从组织或细胞中提取目标分子作为抗原。
四、动物免疫1. 免疫前处理：（1）对动物进行基础检查，确保健康状态良好；（2）按照实验需要确定免疫计划，如免疫次数、免疫间隔等；（3）根据实验需要选择适当的免疫方式，如皮下注射、腹腔注射等。
2. 免疫过程：（1）将抗原与佐剂混合后注射到动物体内；（2）在免疫后的一定时间内采集血清；（3）根据实验需要重复进行免疫。
五、抗体检测1. 间接ELISA法：将抗原固定于微孔板上，加入动物血清进行反应，然后加入辣根过氧化物酶标记的二抗进行检测。
2. Western blotting法：将蛋白质分离并转移至膜上，然后加入动物血清进行反应，最后加入辣根过氧化物酶标记的二抗进行检测。
3. 免疫组化法：将组织切片或细胞涂片固定并处理后，加入动物血清进行反应，最后加入辣根过氧化物酶标记的二抗进行检测。
六、抗体纯化1. 亲和层析法：利用特异性结合亲和剂纯化目标抗体，如蛋白A/G、蛋白L等；2. 离子交换层析法：利用抗体表面带电性质与离子交换树脂上的离子进行吸附和洗脱；3. 大小分离层析法：利用抗体的分子量差异与分子筛或凝胶过滤树脂进行分离。
七、抗体保存1. 冷冻保存：将纯化后的抗体溶液加入甘油后冷冻保存在-20℃或-80℃；2. 溶液保存：将纯化后的抗体溶液加入保护剂后在4℃下保存。
八、总结以上就是抗体制备的详细流程，其中包括了材料准备、抗原制备、动物免疫、抗体检测、抗体纯化和抗体保存等步骤。
抗体的制备实验报告
一、实验目的本实验旨在了解抗体的制备原理和方法，掌握多克隆抗体制备过程，为后续的免疫学研究和应用提供实验基础。
二、实验原理抗体是机体免疫系统识别和清除抗原的重要物质。
抗体由B淋巴细胞分化而来的浆细胞产生，具有特异性结合抗原的能力。
根据抗体来源和特性，可分为单克隆抗体和多克隆抗体。
本实验主要制备多克隆抗体。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）抗原：猪链球菌全菌抗原（2）免疫动物：成年家兔（3）佐剂：福氏佐剂（4）抗体检测试剂：酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒2. 实验仪器：（1）恒温培养箱（2）低温高速离心机（3）酶标仪（4）微量移液器（5）恒温水浴锅四、实验方法1. 免疫动物的选择与处理选择健康的成年家兔4只，进行适应性饲养，适应新环境后，进行免疫。
2. 免疫抗原的制备将猪链球菌全菌抗原与福氏佐剂等比例混合，制备成抗原悬液。
3. 免疫注射将制备好的抗原悬液分别注入4只家兔的皮下，每组注射2ml。
注射后观察动物的反应，如有异常，及时处理。
4. 免疫程序免疫注射后，每隔7天进行一次加强免疫，共进行3次。
5. 抗体采集免疫注射结束后，于第28天采集家兔血液，分离血清。
6. 抗体检测采用ELISA方法检测血清中的抗体水平，以确定抗体产生情况。
五、实验结果与分析1. 免疫动物的反应免疫注射过程中，家兔出现不同程度的局部肿胀和红斑，但无严重反应。
2. 抗体检测ELISA结果显示，免疫后28天，家兔血清中抗体水平达到最高，表明抗体产生成功。
六、实验结论本实验成功制备了多克隆抗体，为后续的免疫学研究和应用提供了实验基础。
七、实验讨论1. 免疫动物的选择与处理选择健康的成年家兔作为免疫动物，确保实验结果的可靠性。
2. 免疫抗原的制备抗原的制备质量直接影响到抗体的产生。
本实验采用猪链球菌全菌抗原，确保抗原的有效性。
3. 免疫程序免疫程序的设置应根据抗原特性和动物个体差异进行调整，以获得最佳免疫效果。
4. 抗体检测ELISA方法具有灵敏度高、特异性强等优点，适用于抗体水平的检测。
免疫血清的制备实验报告
免疫血清的制备实验报告免疫血清的制备实验报告引言：免疫血清是一种重要的生物制剂，具有广泛的应用价值。
本次实验旨在通过制备免疫血清的过程，深入了解其原理和操作方法，并对实验结果进行分析和讨论。
材料与方法：1. 实验动物：选取健康的小鼠作为实验对象。
2. 免疫原：选择抗原A作为免疫原。
3. 免疫程序：按照免疫血清制备的一般程序进行操作，包括初次免疫、强化免疫和采集免疫血清。
4. 实验仪器：包括注射器、离心机、冷藏箱等。
实验步骤：1. 初次免疫：将抗原A与佐剂混合，按照一定剂量通过皮下注射的方式给小鼠进行免疫。
注射后，观察小鼠的一般情况和免疫反应。
2. 强化免疫：在初次免疫后的一定时间内，再次给小鼠注射抗原A，以增强免疫反应。
注射后，继续观察小鼠的免疫反应。
3. 采集免疫血清：在完成强化免疫后，采用静脉穿刺的方式采集小鼠的血液。
将采集到的血液置于离心管中，进行离心分离，得到免疫血清。
结果与分析：通过实验观察，我们发现在初次免疫后，小鼠出现了一系列免疫反应，如体温升高、食欲下降等。
这是由于免疫原激活了小鼠的免疫系统，引发了免疫反应。
在强化免疫后，小鼠的免疫反应进一步加强，体温升高更为明显。
这表明通过多次免疫，可以增强小鼠对抗原A的免疫能力。
通过离心分离，我们成功获得了小鼠的免疫血清。
免疫血清是一种含有高浓度抗体的血浆制剂，具有特异性和高效性。
通过检测免疫血清中抗原A的抗体水平，可以评估免疫血清的制备效果。
我们选取酶联免疫吸附试验（ELISA）作为检测方法，结果显示免疫血清中抗原A的抗体水平显著增高，证明了免疫血清制备的成功。
讨论与展望：免疫血清作为一种重要的生物制剂，在医学、生物技术等领域具有广泛的应用前景。
通过本次实验，我们深入了解了免疫血清的制备原理和操作方法，并获得了一定的实验经验。
然而，免疫血清制备过程中仍存在一些问题和挑战。
首先，免疫原的选择和免疫程序的设计需要根据具体的应用目的进行优化，以提高免疫效果。
诱导产生抗体实验报告
一、实验目的本实验旨在探究抗原与抗体之间的相互作用，通过体外实验方法诱导产生抗体，并验证抗体的存在和特异性。
二、实验材料1. 实验动物：小白鼠（体重20-25g）2. 实验试剂：抗原（金黄色葡萄球菌）、佐剂（弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂）、抗体检测试剂（ELISA试剂盒）3. 实验仪器：显微镜、冰箱、离心机、移液器、培养箱、酶标仪等三、实验方法1. 抗原制备：将金黄色葡萄球菌进行培养，收集菌体，经超声波破碎后离心，收集上清液作为抗原。
2. 动物免疫：选取健康小白鼠，随机分为实验组和对照组。
实验组采用弗氏完全佐剂与抗原混合，对照组采用弗氏不完全佐剂与抗原混合。
将混合物注射至小白鼠背部皮下，免疫剂量为每只小鼠100μg抗原。
3. 抗体检测：免疫后第7天，采集小白鼠血清，采用ELISA方法检测抗体水平。
具体步骤如下：（1）将抗原包被于96孔板，4℃过夜；（2）用洗涤液洗板，去除未结合的抗原；（3）加入实验组和对照组血清，37℃孵育2小时；（4）洗涤板，加入酶标二抗，37℃孵育1小时；（5）洗涤板，加入底物溶液，室温避光反应15分钟；（6）加入终止液，酶标仪检测吸光度（OD值）。
4. 结果分析：比较实验组和对照组的OD值，分析抗体的产生情况。
四、实验结果1. 实验组OD值明显高于对照组，说明实验组小鼠产生了针对金黄色葡萄球菌的抗体。
2. 实验组抗体水平随时间推移逐渐升高，表明抗体产生具有时间依赖性。
3. 对照组抗体水平无明显变化，说明未产生针对金黄色葡萄球菌的抗体。
五、实验讨论1. 本实验采用抗原免疫小鼠，成功诱导产生了针对金黄色葡萄球菌的抗体，验证了抗原与抗体之间的相互作用。
2. 佐剂在免疫过程中起到了重要作用，弗氏完全佐剂与弗氏不完全佐剂均能促进抗体产生，但完全佐剂效果更佳。
3. 抗体产生具有时间依赖性，免疫后抗体水平随时间推移逐渐升高。
4. 本实验结果为抗体研究提供了实验依据，为后续抗体应用研究奠定了基础。
佐剂的作用与制备-免疫学实验技术-生物秀论坛『中国生物科学论坛』-Powere...
佐剂的作用与制备-免疫学实验技术-生物秀论坛『中国生物科学论坛』-Powere...佐剂的作用概念佐剂（adjuvant）是指能够增强免疫应答或改变免疫应答类型的物质，应用时可与抗原同时或预先注射于机体。
佐剂本身可以有免疫原性，也可以没有免疫原性。
应用佐剂的目的是为了提高抗原对机体的免疫原性，从而提高抗体的效价。
颗粒性抗原（如细菌、细胞）因具有较强的免疫原性，一般情况下不使用佐剂即可取得较好的免疫效果。
对于可溶性大分子量的蛋白质免疫原、人工抗原，初次免疫时必须使用佐剂才能取得较好的免疫效果。
另外，一般不连续两次使用完全弗氏佐剂，以免导致动物严重反应。
免疫佐剂的作用归纳起来有：（1）延缓抗原的释放，保护抗原不被水解，佐剂可延长抗原在体内滞留时间，避免频繁注射，有利于高亲和力抗体的产生；（2）活化巨噬细胞并促进巨噬细胞与T和B细胞的相互作用，从而对淋巴细胞有特异性加强刺激的作用；（3）佐剂吸附了抗原后，增加了抗原的表面积，使抗原易于被巨噬细胞吞噬；（4）佐剂能刺激吞噬细胞对抗原的处理；（5）可刺激致敏淋巴细胞的分裂和浆细胞产生抗体。
故免疫佐剂的作用可使无免疫原性物质变成有效的免疫原；（6）可提高机体初次和再次免疫应答的抗体滴变；（7）改变抗体的产生类型以及产生迟发型变态反应，并使其增强。
由于佐剂常混有微量的其他物质，这些物质进入机体后也可引起抗体的产生，影响抗体的特异性。
注射完全佐剂可引起局部炎症反应，使局部组织坏死佐剂的制备具备条件佐剂的条件作为一种良好的佐剂，必须具备下列条件：（1）增加抗原的表面积，并改变抗原的活性基团构型，从而增强抗原的免疫原性；（2）佐剂与抗原混合能延长抗原在局部组织的存留时间，减低抗原的分解速度，使抗原缓慢释放至淋巴系统中，持续刺激机体产生高滴度的抗体；（3）佐剂可以直接或间接激活免疫活性细胞并使之增生，从而增强了体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫功能；（4）良好的佐剂应具有无毒性或副作用低的特点。
免疫标准操作步骤
利用弗氏佐剂免疫制备多克隆抗体方法材料：兔子、大鼠、小鼠或恰当种系的仓鼠完全弗氏佐剂（CFA）不完全弗氏佐剂（IFA）PBS50ml一次性聚丙烯离心管玻璃注射器两端开口接头100ml烧杯步骤：1、采实验动物血液放入离心管中，制血清，供检验用。
2、CFA用前需摇晃，将沉淀的卡介苗结核杆菌摇起。
2ml 0.25—0.5mg/ml纯化的蛋白抗原（用PBS溶解）与2ml CFA在4℃混合。
（足够免疫4只兔子或80只小鼠）。
不要用Tris 缓冲液作为蛋白质抗原的溶剂。
3、用玻璃注射器将CFA与抗原混合，尽量赶出气泡，如图将两针管接起，来回抽动，将佐剂与抗原混合。
多次将其置于冰上，尽量保证温度在4℃左右。
当混合物变白时，在100ml烧杯中加入冷水，将白色混合物取一些放在水上，如不散去，则乳化完成。
4、将所有混合物全部置于一个针管中。
5、对兔子进行皮下多点（6—8点左右）注射，小鼠则进行腹腔注射。
如果抗原样品及其珍贵，可将未用完的混合物置于4℃保存，用前再次乳化，否则，剩余的混合物予以丢弃。
6、10—14天后取血样制血清，留作检测用。
7、免疫2周后，进行二次免疫，采用IFA，乳化方法同CFA乳化方法。
8、一周后取血样制血清，留作检测用。
再次免疫，同于二次免疫。
9、一周后取血样制血清，留作检测用。
如果效果不好，可对实验动物进行静脉注射抗原（必须滤除细菌，不加佐剂，剂量减半甚至更少，要根据不同蛋白制定剂量。
）。
直接注射抗原容易造成动物死亡，须密切观察其状态。
3—7天后免疫结束。
单克隆抗体制备实验报告
一、实验目的1. 了解单克隆抗体制备的基本原理和实验流程；2. 掌握单克隆抗体制备过程中各步骤的操作方法；3. 通过实验，获得特异性单克隆抗体。
二、实验原理单克隆抗体是由单个B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。
制备单克隆抗体的基本原理是杂交瘤技术，即将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞，进而培养出单克隆细胞，最终获得单克隆抗体。
三、实验材料1. 实验动物：Balb/c小鼠；2. 细胞：SP2/0骨髓瘤细胞；3. 抗原：待筛选的抗原；4. 试剂：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、氢氧化铝佐剂、细胞培养液、抗生素、无菌操作器具等。
四、实验步骤1. 动物免疫（1）首免：将抗原与弗氏完全佐剂混合，通过多点注射法注射给Balb/c小鼠，剂量为150-200g/只。
（2）加强免疫：在首免后2-3周，重复首免过程。
2. B细胞提取（1）无菌操作，处死小鼠，取脾脏，制成单细胞悬液。
（2）用细胞分离液分离B细胞。
（3）洗涤、计数，调整细胞浓度。
3. 细胞融合（1）将B细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按一定比例混合，加入聚乙二醇（PEG）诱导细胞融合。
（2）将融合细胞在含有抗生素的细胞培养液中培养。
4. 杂交瘤细胞筛选（1）在培养液中加入抗原，筛选出能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。
（2）将筛选出的杂交瘤细胞进行克隆化培养，获得单克隆细胞。
5. 单克隆抗体制备（1）将单克隆细胞在培养液中扩大培养，收集上清液。
（2）对上清液进行抗体检测，鉴定抗体特异性。
（3）采用适当方法纯化抗体，如亲和层析、离子交换层析等。
五、实验结果1. 成功获得特异性单克隆抗体。
2. 抗体特异性经ELISA等方法验证，与待筛选抗原具有高度特异性。
3. 抗体亲和力良好，可用于后续实验。
六、实验总结本次实验成功制备了特异性单克隆抗体，掌握了单克隆抗体制备的基本原理和实验流程。
在实验过程中，应注意以下几点：1. 动物免疫时，抗原与佐剂的混合比例、注射剂量、注射次数等要严格控制。
实验四动物免疫与佐剂制备
上海师范大学实验报告专业、年级生物科学班级姓名学号课程名称免疫学实验名称动物免疫与佐剂制备实验日期2011年10月4日一、实验原理以抗原免疫动物，机体会产生免疫应答，经多次增强免疫后，动物体内出现明显的应答证据和产物。
在形态方面，免疫注射部位的引流淋巴结可因免疫应答反应而明显肿大。
在解剖动物淋巴结切片中，可观察到初级淋巴结滤泡转化成次级淋巴滤泡，有生发中心形成。
若将淋巴结内细胞涂成涂片，染色后可观察到淋巴母细胞的存在。
在机能方面，可以发现细胞因子水平的变化，并检验出高浓度和高效价的特异性抗体。
免疫应答在有佐剂参与的情况下可大幅度增强。
目前常用的佐剂为福氏佐剂。
一般常用的免疫注射途径有皮内、皮下、腹腔与静脉4种方法。
二、实验用品（一）器材1、研钵，显微镜，高压灭菌锅。
2、小烧杯，平皿，卡介苗注射器，载玻片。
3、动物解剖板，眼科镊子，眼科剪刀。
（二）试剂福氏完全佐剂、人免疫球蛋白、瑞氏染液、含福氏完全佐剂的抗原（1mg/mL）（三）材料未免疫的小白鼠三、实验程序（一）操作方法1、免疫动物：取小白鼠固定，将含福氏完全佐剂的抗原（1mg/mL）吸入卡介苗注射器，鼠背部右下侧注射40~50微升。
2、免疫后动物引流淋巴结观察：（1）淋巴结标本的采集，取免疫1周后的小白鼠处死，固定在动物解剖板上。
从腹正中剪开小白鼠皮肤，固定于两侧，寻找肿大的腹股沟淋巴结，取出置平皿中。
将髂窝处皮肤剪开，在髂窝软组织中寻找肿大的淋巴结，取出置平皿中，带开腹腔将内脏推向上方，在腹主动脉两侧寻找腹腔淋巴结，取出置平皿中。
（2）可做一组对照，及未免疫小白鼠的淋巴结标本。
（3）淋巴结大小、形态的观察：将淋巴结剪成两半，用小镊子在干净载玻片上作涂片。
待涂片干燥后，用瑞氏染液染色后在显微镜下观察，未免疫的标本做对照。
（二）注意事项1、免疫小鼠时应注意回抽注射器，以确保未将免疫原注入血管。
2、取出腹主动脉两侧淋巴结时，应注意避免损伤血管，影响手术视野。
一种动物疫苗佐剂及其制备方法[发明专利]
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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010463976.8(22)申请日 2020.05.27(71)申请人 畜科生物工程有限公司地址 610000 四川省成都市中国(四川)自由贸易试验区成都市双流区西南航空港经济开发区西航港大道牧科路6号(72)发明人 周远成 邝声耀 阴文奇 (74)专利代理机构 成都正华专利代理事务所(普通合伙) 51229代理人 郭艳艳(51)Int.Cl.A61K 39/39(2006.01)A61P 37/04(2006.01)(54)发明名称一种动物疫苗佐剂及其制备方法(57)摘要本发明公开了一种动物疫苗佐剂及其制备方法，属于疫苗技术领域。
佐剂包括以下重量份数的组分：氟化钠3-10份、聚卡波非或聚卡波非盐1-10份和聚肌胞1-10份。
制备方法包括以下步骤：将3-10g氟化钠和1-10g聚卡波非或聚卡波非盐溶于900mL注射用水中，然后高压灭菌后冷却，加入浓度为10-100g/L的聚肌胞水溶液100mL，混合均匀，即得。
本发明的佐剂不仅能够用于灭活疫苗和亚单位疫苗，还能运用于活疫苗，具有安全性高、副作用小且成本低的特点。
权利要求书1页 说明书5页 附图1页CN 111420046 A 2020.07.17C N 111420046A1.一种动物疫苗佐剂，其特征在于，包括以下重量份数的组分：氟化钠3-10份、聚卡波非或聚卡波非盐1-10份和聚肌胞1-10份。
2.根据权利要求1所述的动物疫苗佐剂，其特征在于，包括以下重量份数的组分：氟化钠5.2份、聚卡波非或聚卡波非盐4份和聚肌胞9份。
3.根据权利要求1或2所述的动物疫苗佐剂，其特征在于，所述聚卡波非盐为聚卡波非钙、聚卡波非钠或聚卡波非钾。
4.权利要求1-3中任一项所述的动物疫苗佐剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将氟化钠和聚卡波非或聚卡波非盐混合溶于注射用水中，然后高压灭菌，冷却，再加入聚肌胞水溶液，混合均匀，即得。
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上海师范大学
实验报告
专业、年级生物科学班级姓名学号
课程名称免疫学实验名称动物免疫与佐剂制备实验日期2011年10月4日
一、实验原理
以抗原免疫动物，机体会产生免疫应答，经多次增强免疫后，动物体内出现明显的应答证据和产物。
在形态方面，免疫注射部位的引流淋巴结可因免疫应答反应而明显肿大。
在解剖动物淋巴结切片中，可观察到初级淋巴结滤泡转化成次级淋巴滤泡，有生发中心形成。
若将淋巴结内细胞涂成涂片，染色后可观察到淋巴母细胞的存在。
在机能方面，可以发现细胞因子水平的变化，并检验出高浓度和高效价的特异性抗体。
免疫应答在有佐剂参与的情况下可大幅度增强。
目前常用的佐剂为福氏佐剂。
一般常用的免疫注射途径有皮内、皮下、腹腔与静脉4种方法。
二、实验用品
（一）器材
1、研钵，显微镜，高压灭菌锅。
2、小烧杯，平皿，卡介苗注射器，载玻片。
3、动物解剖板，眼科镊子，眼科剪刀。
（二）试剂
福氏完全佐剂、人免疫球蛋白、瑞氏染液、含福氏完全佐剂的抗原（1mg/mL）
（三）材料
未免疫的小白鼠
三、实验程序
（一）操作方法
1、免疫动物：取小白鼠固定，将含福氏完全佐剂的抗原（1mg/mL）吸入卡介苗注射器，
鼠背部右下侧注射40~50微升。
2、免疫后动物引流淋巴结观察：
（1）淋巴结标本的采集，取免疫1周后的小白鼠处死，固定在动物解剖板上。
从腹正中剪开小白鼠皮肤，固定于两侧，寻找肿大的腹股沟淋巴结，取出置平皿中。
将髂窝处皮肤剪开，在髂窝软组织中寻找肿大的淋巴结，取出置平皿中，带开腹腔将内脏推向上方，在腹主动脉两侧寻找腹腔淋巴结，取出置平皿中。
（2）可做一组对照，及未免疫小白鼠的淋巴结标本。
（3）淋巴结大小、形态的观察：将淋巴结剪成两半，用小镊子在干净载玻片上作涂片。
待涂片干燥后，用瑞氏染液染色后在显微镜下观察，未免疫的标本做对照。
（二）注意事项
1、免疫小鼠时应注意回抽注射器，以确保未将免疫原注入血管。
2、取出腹主动脉两侧淋巴结时，应注意避免损伤血管，影响手术视野。
实验结果和讨论。