磁性壳聚糖微球固定化脂肪酶的研究

合集下载

磁性微球固定化酶工艺研究进展

磁性微球固定化酶工艺研究进展卢燕燕;王宝维【摘要】磁性微球固定化酶就是利用磁性微体作为裁体进行酶的固定化,由于其具有环保、酶重复利用效果好和降低生产成本等优点,近几年已经成为研究的焦点.本文重点对磁性微球固定化酶制备工艺的研究现状、应用及发展前景进行阐述,为同行们今后开展研究提供参考.【期刊名称】《肉类研究》【年(卷),期】2010(000)005【总页数】5页(P78-82)【关键词】磁性微球载体;固定化酶;制备工艺【作者】卢燕燕;王宝维【作者单位】青岛农业大学,食品科学与工程学院,山东,青岛,266109;青岛农业大学,食品科学与工程学院,山东,青岛,266109【正文语种】中文【中图分类】TS201.2酶参与体内各种代谢反应，而且反应后其数量和性质不发生变换。

作为一种生物催化剂，酶可以在常温常压等温和条件下高效地催化反应，一些难以进行的化学反应在酶的催化作用下也可顺利地进行反应，而且反应底物专一性强、副反应少等优点大大促进了人们对酶的应用和酶技术的研究。

但在实际应用中，酶对环境敏感、反应后难以回收等缺点限制了酶制剂产品的开发和应用，在这种情况下，固定化酶应运而生[1]。

所谓酶的固定化是指利用化学或物理手段将游离的酶定位于限定的空间区域并使其保持活性和可反复使用的一种基本技术[2]。

在理论及实际应用上，酶固定化技术克服了游离酶的许多缺点，但是固定化酶技术目前还存在固定效率低、载体的有毒性、成本高、稳定性差、不能大规模生产等问题，这些都限制了固定化酶技术的发展与应用。

在固定化酶技术中，载体材料的结构和性能对酶的活性保持及应用至关重要，因此对固定化酶载体的研究成为该领域研究的热点。

本文主要从其中的一种新型载体——磁性高分子微球的特点出发，就磁性微球固定化酶工艺的研究现状、应用及前景进行综述，为新型载体的选择提供理论依据，以期随着生物技术及材料、化工等各相关学科的不断发展，固定化酶的工作会有新的突破。

固定化脂肪酶研究进展

菌 D?DG! 溶液中，静置固化 /0)9: ，经过滤、洗涤和干燥后得到球状固定化酶。固定化酶的活力回收约为 8/’7" 。酶学性质研究表明，此固定化酶的热稳定性较好。游离酶在 3&1 下保温 7, 已完全丧失活力，而固定化酶在 7&&1 下保温 7, 仅损失 83’!" 的活力，在 7&&1 下保温 3, 仍可保持 /3’+" 的酶活力。酶经固定化后，其橄榄油水解反应的最适温度由 /&1 上升至 (&1 ， 2 ) 值由 78’+)5 $ )* 降为 +’7)5 $ )*。常见有机溶剂对固定化酶的活力影响较小。将该固定化脂肪酶用于非水溶剂中正戊酸异戊酯的合成，重复使用 3 次后，固定化酶仍保持 (0" 的酶活力。
［B ］等从 =# 种不同来源的树脂中筛选出固李南薇
催化技术虽然成熟，但酶分离困难，不能重复使用，难以实现过程连续化，因此脂肪酶催化技术工业化很大程度上取决于酶的固定化
［! ］
。当底物和产物是
小分子的可溶性物质时，固定化酶更占优势。所谓固定化酶就是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶。固定化酶的两个最大的优点是酶易与产物分离，可重复使用。通过固定化操作，可以改变酶的一些性质，例如 K2:02+L2 K+)4/M.). 等
!"%$ 包埋法
包埋法是不需要化学修饰酶蛋白的氨基酸残基，反应条件温和，很少改变酶结构的固定化方法。其基本原理是单体和酶溶液混合，再借助引发剂进

磁性壳聚糖微球固定化脂肪酶的研究

磁性壳聚糖微球固定化脂肪酶的研究Study of immobilization of lipase in magnetic chitosan microspheres纵伟刘艳芳赵光远ZONG Wei LIU Yan-fang ZHAO Guang-yuan（郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州450002）（School of Food and Biological Engineering,Zhengzhou University of Light Industry,Zhengzhou，Henan450002,China）摘要：目的：为制备具有高活性的固定化脂肪酶。

方法：以磁性壳聚糖微为载体，用物理吸附法固定化脂肪酶，对影响固定化的各种因素进行考察，确定了最优条件，并比较游离酶和固定化酶的pH和热稳定性，研究固定化酶的使用稳定性；结果：固定化的适宜条件为采用加酶量600U/g,温度5℃,pH7.0，固定时间2h。

固定化酶的pH和热稳定性都优于游离酶，固定化酶连续使用5次，其相对酶活仍为使用前的57.8%，具有较好的操作稳定性。

结论：磁性壳聚糖微球是固定脂肪酶的良好载体。

关键词：磁性壳聚糖微球；固定；脂肪酶Abstract：Objective：To produced the immobilized lipase with higher activity; Methods:Lipase(EC3.1.1.3)was immobilized in magnetic chitosan microspheres by physical adsorption．In this article．different factors that influenced the immobilization were investigated，and the optimum conditions were ascertained．Comparative studies of pH and thermal stability between free lipase and immobilized lipase were also conducted;Results:The optimum factors of immobilization were as follows:600U/g lipase was added to the solution at pH7.0,5℃for2h.In comparison with free lipase,the pH and thermal stability of immobilized lipase was increased.To use in hydrolyzation of oil,the immobilized enzyme activity remained activity of 57.8%after5repeated hydrolyzation.Conclusion：Magnetic chitosan microspheres was a kind of good support for immobilized enzyme. Keywords：Magnetic chitosan microspheres；Immobilization；Lipase——————————基金项目：河南省教育厅杰出科研人才创新工程项目（项目编号：2007KYCX0020）作者简介：纵伟（1965-），男，郑州轻工业学院食品与生物工程学院教授、博士。

壳聚糖纳米磁性微球固定脂肪氧合酶的研究

壳聚糖纳米磁性微球固定脂肪氧合酶的研究夏云空;魏炜;杨帆【摘要】实验采用溶胶凝胶法制备了纳米磁性Fe3O4,并用壳聚糖对颗粒2四川大学,生命科学学院,四川成都表面进行了表面修饰得到壳聚糖纳米磁性微球复合载体,再以戊二醛为交联剂将脂肪氧合酶固定在复合载体上,并测定了不同因素对游离酶和固定化酶活性的影响;实验表明,微粒在电镜观察下呈亮黑色球状,直径约为150nm,并具有良好的磁性,固定在载体上酶的含量约为7.6%,游离酶的最适温度为30℃,最适pH8.0,而固定化酶的最适温度为30℃,最适pH9.0,当H2O2浓度为12.0 g/L时,游离酶和固定化酶的活性最强;实验结果表明通过交联的方法成功将脂肪氧合酶固定在了纳米磁性四氧化三铁颗粒上,并表现出了较好的活性.【期刊名称】《生物技术世界》【年(卷),期】2016(000)002【总页数】3页(P3-5)【关键词】纳米磁性Fe3O4 固定酶脂肪氧合酶酶活【作者】夏云空;魏炜;杨帆【作者单位】四川大学生命科学学院,四川成都610000【正文语种】中文【中图分类】Q5酶的固定化过程是指以化学或物理的手段，将酶束缚在一定区域内，限制酶分子在此区域内的催化作用，在应用过程中，固定化酶能够克服游离酶无法回收的缺点，可以提高酶的利用率，减低生产成本。

目前用于固定化酶的载体种类很多，磁性物质作为一种绿色材料是近年来研究较多的材料。

目前，用于固定化酶的主要载体之一是纳米Fe3O4，其制备方法也有多种，如水热法，溶胶凝胶法和共沉淀法等［6］，磁性微球固定化酶的研究成为许多研究者青睐的课题。

脂肪氧合酶是一类较为常见的酶，应用前景广阔，可用于染料、涂料和洗涤剂等工业化生产。

然而，脂肪氧合酶的稳定性差、回收困难等缺点限制了其在工业领域的应用，酶的固定化可以显著改善酶的热稳定性，因此，对寻找一种适宜与脂肪氧合酶的固定化载体和方法的研究是一项令人感兴趣的工作。

本研究通过溶胶凝胶法制备纳米磁性Fe3O4，并用壳聚糖对粒子进行了表面修饰得到纳米磁性载体，然后用交联法固定脂肪氧合酶，研究了影响酶活的因素，以期获得一种较好的酶固定化方法，并为固定化脂肪氧合酶的进一步应用奠定基础。

磁性壳聚糖的制备及在脂肪酶固定的应用

磁性壳聚糖的制备及在脂肪酶固定的应用王楠楠;张大准;董发才【摘要】采用共沉淀法制备磁性壳聚糖微球,戊二醛做交联剂把脂肪酶固定在磁性壳聚糖载体上,分别使用扫描电子显微镜、傅立叶红外光谱仪、X射线衍射仪、振动样品磁强计、热重分析仪等对磁性壳聚糖微球进行表征分析,并检测了固定化酶的特性.结果表明,制备的磁性壳聚糖性能良好,与游离酶相比,固定化酶的最适pH,最适温度均有提高,固定化酶的热稳定性,对变性剂的耐受力,重复使用性都有较大幅度提高.%The magnetic chitosan microspheres were prepared using the cross-linking co-precipitation technique.The lipase was immobilized on magnetic chitosan microspheres using glutaraldehyde as a crosslinking agent.The characteristics of the magnetic chitosan microspheres were evaluated by scanning electron microscope (SEM), fourier transform infrared spectrometer (FT-IR), phase X-ray diffraction (XRD), vibration sample magnetometer (VSM) and the thermogravimetric analysis.The results indicated that the microspheres had good properties.The thermal, degeneration agent of urea tolerance, reusablities and storage stabilities of the enzyme were greater increased after the immobilization the free enzyme.【期刊名称】《化学研究》【年(卷),期】2017(028)002【总页数】7页(P247-253)【关键词】磁性壳聚糖;脂肪酶;固定化酶【作者】王楠楠;张大准;董发才【作者单位】河南大学生命科学学院,植物逆境生物学重点实验室,河南开封475004;河南大学生命科学学院,植物逆境生物学重点实验室,河南开封 475004;河南大学生命科学学院,植物逆境生物学重点实验室,河南开封 475004【正文语种】中文【中图分类】O629.8脂肪酶(Lipase，E.C.3.1.1.3)又称三脂酰甘油水解酶，能够将甘油三酯水解为脂肪酸和甘油[1-2]. 随着研究的深入，人们发现脂肪酶还能够催化甘油三酯的醇解、脂肪酸的酯化、酰胺键的水解等反应. 基于脂肪酶的这些催化特性，目前已被广泛地用于食品[3-4]、生物柴油[5-6]和药物的拆分[7]等领域. 游离的脂肪酶在工业应用时存在分离纯化等困难，一般为一次性使用，很难回收利用，增加工业成本[8]. 固定化技术可以解决以上问题，固定化酶不仅保持了游离酶的高效性和专一性，同时增加了酶对温度、酸碱、变性剂的耐受性，易于分离和重复使用，有效的降低了成本，已引起国内外学者的关注[9]. 壳聚糖(CS)具有生物相容性、生物亲和性和无毒等特性，分子链上大量存在的羟基和氨基又使其易于进行化学改性，常被作为磁性高分子材料的“外壳”而应用于污水处理、医药和酶固定化等领域. 磁性壳聚糖微球作为一种新型功能高分子材料，已作为载体被广泛应用于酶的固定化领域. WANG等[10]采用乳化交联法成功制备磁性壳聚糖微球固定化碱性蛋白酶. LIU等[11]应用壳聚糖包覆的Fe3O4磁性纳米粒子固定化木聚糖酶，固定化酶量达162.2 mg/g，显示了较高结合酶的能力. CHEN等[12]使用磁性壳聚糖微球对β-半乳糖苷酶进行固定化研究，分解乳糖生产低聚半乳糖，产率可达到50.5%. 目前，磁性壳聚糖微球作为载体已经应用于淀粉酶，米糠内源酶，酵母乙醇脱氢酶、蛋白酶、脂肪酶[13-17]等的固定化的应用. 通常采用乳化交联法制备磁性壳聚糖微球，但该方法使用了大量有机试剂，成本高、对人体有害、污染环境、操作复杂. 本实验通过共沉淀法制备磁性壳聚糖微球得到性能良好的脂肪酶固定化载体，克服了以上缺点，并对固定化酶特性做了相关研究.1.1 实验仪器和试剂AVATAR360型傅立叶变换红外光谱仪，美国 Nicolet公司；X Pert Pro型X射线衍射仪，荷兰Philips；JSM5600LV型扫描电子显微镜，日本电子株式会社；HWS28型电热恒温水浴锅，上海恒科学仪器有限公司；LNG-T83型干燥箱；JJ-1型电动搅拌器，金坛市科析仪器有限公司.三羟甲基氨基甲烷(TRIS)购于索莱宝公司；四水氯化亚铁，戊二醛(体积分数50%)均购自阿拉丁公司；Candida rugosa lipase Type VII购自Sigma公司；十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、异丙醇购于天津基准化学试剂有限公司；壳聚糖、4-硝基酚、三氯乙酸、乙二胺购自国药集团化学试剂有限公司；4-硝基苯基棕榈酸酯购自萨恩化学技术有限公司；盐酸购自中平能化集团开封市东大化工有限公司；冰乙酸购自天津市德恩化学试剂有限公司；六水三氯化铁购自天津市科密欧化学试剂有限公司.1.2 方法1.2.1 磁性壳聚糖微球的制备称取0.3 g壳聚糖加入250 mL三口烧瓶中，取15 mL的2%的冰醋酸溶液加入三口烧瓶中，搅拌使壳聚糖完全溶于冰醋酸溶液，分别称取1.22 g六水三氯化铁和0.5 g四水氯化亚铁溶于30 mL 0.05 mol/L的稀盐酸中，充分搅拌至氯化铁和氯化亚铁完全溶解后倒入三口烧瓶中，500 r/min搅拌使铁盐与壳聚糖冰醋酸溶液充分混合，加入3 mL体积分数50%的戊二醛200 r/min交联1 h，加入1.3 mol/L氢氧化钠至完全沉淀，将沉淀转移至烧杯中用灭过菌的双蒸水洗涤3次，然后磁分离和真空干燥，即可得到磁性壳聚糖微球(Fe3O4/CS).1.2.2 磁性壳聚糖微球的活化和醛基含量测定磁性壳聚糖微球的活化：称取0.5 g磁性壳聚糖微球，分别加入10 mL浓度为0.55%的戊二醛溶液，对制备的磁性壳聚糖微球进行活化.醛基含量测定[18]：分别称取0.1 g恒重干燥的磁性壳聚糖微球和活化后的磁性壳聚糖微球，加入到25 mL 0.25 mol/L的盐酸羟胺-甲基橙溶液中，用玻璃棒搅拌使其充分接触，室温下反应2 h后，用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定，当溶液颜色由红色变成黄色后停止滴定，记录此时消耗的NaOH溶液体积. 将不加样品，其他条件不变作为空白对照，记录空白对照消耗的NaOH溶液体积. 使用空白对照校正样品的滴定结果. 醛基的含量计算公式如下：N: NaOH的浓度, mol/L; V0: 样品消耗的NaOH溶液体积, mL; V1: 空白对照消耗的NaOH溶液体积, mL; W: 样品的质量, g.1.2.3 脂肪酶的固定称取0.5 g磁性壳聚糖微球置于100 mL的三口烧瓶中，加入10 mL 0.35%的戊二醛溶液与磁性壳聚糖微球于30 ℃，120 r/min交联60 min，磁分离，弃上清保留沉淀，取灭过菌的双蒸水洗涤沉淀物3次后加入10 mL一定浓度的脂肪酶pH 7.5的PBS缓冲液100 r/min反应60 min，磁分离，分别检测上清和固定化酶的活力.1.2.4 脂肪酶活力测定[19]酶活力单位定义: 在pH 7.5时，35 ℃条件下，每小时内催化产生1 mmol对硝基酚需要的酶量为1个脂肪酶活力单位 (U).具体实验步骤参照文献[19]，其中终止反应的三氯乙酸和中和反应NaOH加入量均为5.2 mL.固定化率=(固定化酶活力/加入游离酶的活力) ×100%2.1 磁性壳聚糖微球的表征分析2.1.1 热重图磁性壳聚糖微球热重分析如图1所示. 100 ℃以下的失重可能是由于不同方法制备的磁性壳聚糖微球有少量的水份. 第二个失重阶段在200～650 ℃温度范围内，这部分的失重来源于壳聚糖的分解. 继续升高温度，曲线趋于平稳，表明壳聚糖已经完全分解. 此结果表明，制备的磁性壳聚糖微球中壳聚糖的含量在60%以上.2.1.2 扫描电子显微镜 (SEM) 观察图2 (A) 是Fe3O4的扫描电镜图，由图可知Fe3O4粒子的微观形貌呈不规则的类球形，有轻微团聚现象. 图2 (B) 和图2 (C) 中磁性壳聚糖微球表面凸凹不平，有孔状片层，与Fe3O4粒子的微观形貌有显著差异，结合热重分析的结果，说明Fe3O4粒子表面包裹了壳聚糖形成了磁性壳聚糖复合微球.2.1.3 傅立叶红外谱图图3为CS (a)，Fe3O4 (b) 与Fe3O4/CS微球 (c) 的FT-IR谱图. 从图3中可以看出，谱线 (b) 于588 cm-1有强吸收峰，此处对应于Fe3O4中Fe-O特征伸缩振动吸收峰. 谱线 (c) 在588 cm-1附近也有吸收峰，并且与谱线 (b) 中Fe3O4的特征吸收峰非常相似，说明Fe3O4/CS微球中有Fe3O4，壳聚糖确实包埋了Fe3O4. 谱线 (a) 在3 431 cm-1附近有红外吸收，这是-OH和-NH2的伸缩振动峰，2 892 cm-1附近为壳聚糖中C-H的伸缩振动吸收峰，1 084 cm-1附近为C-O峰. 谱线 (c) 中既出现了壳聚糖的特征吸收峰，又在1 649 cm-1处出现Shiff碱键C=N的特征吸收峰，说明磁性微球的外层成功包埋了壳聚糖，并且交联剂戊二醛和壳聚糖发生了交联反应.2.1.4 X射线衍射分析(XRD)图4所示 (a) 为磁性Fe3O4粒子的XRD谱图，(b) 为Fe3O4/CS微球的XRD谱图. 从图4中可以看出，(a)磁性Fe3O4粒子的XRD图谱没有出现杂质峰，是典型的单相四氧化三铁的尖晶石结构. (b)Fe3O4/CS微球的在2θ角为30.1°、35.5°、43.1°、53.4°、57°、62.6°这6个典型的峰位置出现主要衍射峰，与(a)基本相同，表明磁性Fe3O4粒子被壳聚糖包埋修饰过后，其晶格结构未变化.2.1.5 磁学特性图5中 (a) 是四氧化三铁的磁滞回线，(b) 是磁性壳聚糖微球的磁滞回线. 从图5中可以看出，磁性壳聚糖微球的比饱和磁化强度与四氧化三铁相比，下降幅度较大，可能是因为大量的壳聚糖包埋在四氧化三铁表面，降低了磁性壳聚糖载体的比饱和磁化强度，间接证明了壳聚糖成功包埋了四氧化三铁.2.1.6 磁性壳聚糖微球醛基含量的测定磁性壳聚糖微球醛基含量的测定结果如表1所示，每克磁性壳聚糖材料中有0.89 mmol醛基；经戊二醛活化后的磁性壳聚糖材料中，每克有1.46 mmol醛基，原因是戊二醛可以增加壳聚糖表面醛基，进而使磁性壳聚糖中的醛基数目增加.2.2 固定化酶性质测定2.2.1 磁性壳聚糖微球固定化脂肪酶最适温度测定在温度较低时，适当增加温度可以提高酶的活性，因为此时酶分子的催化速度随温度的增加而增大. 但是脂肪酶的本质是蛋白质，温度过高会导致酶因构像变化变性而失活. 因此必须在酶催化反应活化速度和蛋白质变性之间寻求一种平衡，探索酶活反应温度的最佳值. 由图6可以看出，游离酶活力在35 ℃ 时最高，固定化酶的最适温度为43 ℃，相比游离酶提高了8 ℃，原因可能是脂肪酶被固定到载体上后，载体束缚酶分子，对外界影响有一定屏蔽保护效果. 当反应温度高于35 ℃，游离酶的活力开始下降，固定酶的活力继续上升，43 ℃后无论是游离酶还是固定酶活力均下降，因为温度过高导致酶分子失活比例增大.2.2.2 固定化酶最适pH测定底物溶液pH为4.0，5.0，6.0，7.0，7.5，8.0，9.0，10.0时酶活，并在相同条件下测定对应的游离酶酶活，以同组最高酶活为100%，其余酶活为与其比值，得到结果如图7所示. 游离酶活力在pH为6.0时最高，固定化酶的活力在pH为7.5时最高，相比游离酶提高了1.5. 当底物溶液pH低于6.0，游离酶和固定酶的活力均随着pH的增大而增大，当底物溶液pH在6.0到7.5之间时，游离酶的活力开始下降，固定酶的活力继续上升，在底物溶液pH大于7.5后，无论是游离酶还是固定酶活力均下降，但固定化酶的活力明显高于游离酶，原因可能是磁性壳聚糖表面含有大量羟基，脂肪酶在被固定到载体的过程中，酶分子的构象和酶分子活性中心一些官能团的离子状态发生改变，载体上过量的负电荷影响了酶活性中心和水质子化的相互作用，增加了脂肪酶对碱性溶液的耐受性.2.2.3 固定化酶热稳定性分别制备磁性壳聚糖载体固定化酶将其和对应的游离酶置于60 ℃恒温水浴锅中保温不同时间，定时取样测量酶活，以同组最高酶活为100%，其余酶活为与其比值，绘制酶的热稳定曲线. 从图8可以看出游离酶和固定酶活力均呈现下降趋势，游离酶的相对活力比固定化酶下降速度更快，趋势更明显. 图8中游离酶在60 ℃保温120 min时游离酶活力剩余14.8%，而固定化酶活力是42%. 在相同温度保温相同时间后，固定化酶活力明显高于游离酶，表现出更强的温度耐受性. 原因可能是脂肪酶被固定到载体的过程中，酶分子之间，酶与载体之间通过共价键、分子间作用力等相互作用，增强固定化酶分子的结构刚性，提高其耐高温的能力，而游离酶缺乏这些相互作用力，容易在高温条件下酶分子结构改变而变性[20].2.2.4 固定化酶抗变性尿素是一种常用的蛋白质变性剂，蛋白质分子中的肽链以一定的方式盘绕曲折，形成特定的构象. 而这种构象的维持，主要依赖于蛋白质分子中的氢键. 高浓度尿素能破坏氢键，导致蛋白质分子结构松弛，从而使蛋白质发生不同程度的变性. 图9的实验说明：游离酶和固定酶活力均随着尿素浓度的增加而降低，游离酶的相对活力比固定化酶下降速度更快，在相同尿素浓度时，固定化酶的活力始终明显高于游离酶. 图中游离酶在尿素浓度为5 mol/L时，酶活力剩余24.8%，而固定化酶活力性是62%；固定化酶活力高于游离酶，表现出更强的对尿素这种变性剂的耐受性，原因可能是脂肪酶被固定到载体后，酶分子与载体相互作用，形成了保护酶分子的微环境，减弱了尿素溶液对酶蛋白的氢键和疏水残基的破坏，进而减轻了酶分子的构象变化.2.2.5 固定化酶重复使用性分别称取1 g磁性壳聚糖载体固定化酶在相同情况下连续反应10次，测定其活力，得到图10所示结果. 随着使用次数增加，固定化酶的活力缓慢下降，在连续使用10次后，磁性壳聚糖载体固定化酶的活力剩余66%，说明固定化酶有良好的重复使用性.2.2.6 固定化酶动力学分析图11显示了固定化酶和对应的游离酶的Lineweaver-Burk曲线. 通过计算可以得知(a)中磁性壳聚糖载体固定化酶的Km为2.41 μmol/L，对应游离酶的Km为0.31 μmol/L固定化酶对底物的亲和力降低. 出现这种结果的原因可能是载体材料对底物的扩散有一定得限制作用，同时脂肪酶被固定化后，载体材料与酶分子的活性位点间有空间位阻，降低了酶与底物的结合能力.摸索出一种新的制备磁性壳聚糖微球的方法，该方法工艺相对简单；采用的原料壳聚糖来源广、价格低廉、没有毒副作用，降低了工业成本，对环境无污染. 这些优点使该制备方法可用于磁性壳聚糖微球工业化大规模生产. 制备的磁性壳聚糖微球中壳聚糖包裹在磁性粒子表面，有良好的磁响应性. 经固定化后，脂肪酶的热稳定性、抗变性剂尿素的能力和重复使用性均得到显著提高，对底物的亲合力出现一定程度的降低. 使用磁性壳聚糖材料固定化脂肪酶，克服了游离酶分离回收难的缺点，提高了酶的使用效率，为固定化酶进一步工业应用打下良好的基础.【相关文献】[1] WEI T, FENG S X, MAO D B, et al. Characterization of a new thermophilic and acid tolerant esterase from Thermotoga maritima capable of hydrolytic resolution of racemic ketoprofen ethyl ester [J]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2013, 85: 23-30. [2] PAPILLON J P N, PAN M, BROUSSEAU M E, et al. Synthetic phospholipids as specific substrates for plasma endothelial lipase [J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2016, 26(15): 3514-3517.[3] ESTEBAN-TORRES M, MANCHENO J M, DE LAS RIVAS B, et al. Characterization of a halotolerant lipase from the lactic acid bacteria Lactobacillus plantarum useful in food fermentations [J]. LWT- Food Science and Technology, 2015, 60(1): 246-252.[4] PARWANI L, BOHRA Y, GUPTA S, et al. Effect of temperature on α-glucosidase, lipase inhibition activity and other nutritional properties of moringa oleifera leaves: Intended to be used as daily antidiabetic therapeutic food [J]. Journal of Food and Nutrition Research, 2016, 55(1): 69-77.[5] LOPEZ E N, MEDINA A R, MORENO P A G, et al. Extraction of microalgal lipids and the influence of polar lipids on biodiesel production by lipase-catalyzed transesterification [J]. Bioresource Technology, 2016, 216: 904-913.[6] KUO T C, SHAW J F, LEE G C. Conversion of crude Jatropha curcas seed oil into biodiesel using liquid recombinant Candida rugosa lipase isozymes [J]. Bioresource Technology, 2015, 192: 54-59.[7] VERRIA F, DIAZ U, MACARIOA A, et al. Optimized hybrid nanospheres immobilizing Rhizomucor miehei lipase for chiral biotransformation [J]. Process Biochemistry, 2016,51(2): 240-248.[8] GILANI S L, NAJAFPOUR G D, MOGHADAMNIA A, et al. Stability of immobilized porcine pancreas lipase on mesoporous chitosan beads: A comparative study [J]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2016, 133: 144-153.[9] 王新, 刘丽, 陆佳靓, 等. 固定化漆酶载体研究进展[J]. 生态学杂志, 2013, 32(10): 2823-2829. WANG X, LIU L, LU J L. Carriers for immobilized laccase: Research progress [J]. Chinese Journal of Ecology, 2013, 32 (10): 2823-2829.[10] WANG S N, ZHANG C R, QI B K, et al. Immobilized alcalase alkaline protease on the magnetic chitosan nanoparticles used for soy protein isolate hydrolysis [J]. European Food Research and Technology, 2014, 239(6): 1051-1059.[11] LIU M Q, DAI X J, GUAN R F, et al. Immobilization of aspergillus niger xylanase A onFe3O4-coated chitosan magnetic nanoparticles for xylooligosaccharide preparation [J]. Catalysis Communications, 2014, 55: 6-10.[12] CHEN S C, DUAN K J. Production of galactooligosaccharides using β-galactosidase immobilized on chitosan-coated magnetic nanoparticles withtris(hydroxymethyl)phosphine as an optional coupling agent [J]. International Journal of Molecular Sciences, 2015, 16(6): 12499-12512.[13] LONG J, LI X F, WU Z Z, et al. Immobilization of pullulanase onto activated magnetic chitosan/Fe3O4 nanoparticles prepared by in situ mineralization and effect of surface functional groups on the stability [J]. Colloids and Surfaces A-Physicochemical and Engineering Aspects, 2015, 472: 69-77.[14] 张媛媛, 张晖, 王立, 等. 磁性壳聚糖微球固定化米糠内源酶的研究[J]. 食品与机械, 2013, 29(3): 51-54.ZHANG Y Y, ZHANG H, WANG L, et al. Study on immobilization of bran rice endogenous enzyme on magnetic chitosan microspheres [J]. Food & Machinery, 2013, 29(3): 51-54. [15] LI G, LI Y, HUANG K, et al. Surface functionalization of chitosan-coated magnetic nanoparticles for covalent immobilization of yeast alcohol dehydrogenase from saccharomyces cerevisiae [J]. Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 2010, 322 (24)： 3862-3868.[16] 梁玉杰, 芦鑫, 黄纪念, 等. 纳米磁性壳聚糖微球固定化Alcalase 碱性蛋白酶的制备及酶学性质研究[J]. 食品与发酵工业, 2014, 40(8): 66-71.LIANG Y J, LU X, HUANG J N, et al. Study on preparation and enzymatic properties of immobilized alcalase alkaline protease magnetic chitosan microspheres [J]. Food and Fermentation Industries, 2014, 40(8): 66-71.[17] LIU Y, JIA S Y, WU Q, et al. Studies of Fe3O4-chitosan nanoparticles prepared by co-precipitation under the magnetic field for lipase immobilization [J]. Catalysis Communications, 2011, 12 (8): 717-720.[18] ZHAO H, HEINDEL N D. Determination of degree of substitution of formyl groups in polyaldehyde dextran by the hydroxylamine hydrochloride method [J]. Pharmaceutical Research, 1991(8): 400-402.[19] 江慧芳, 王雅琴, 刘春国. 三种脂肪酶活力测定方法的比较及改进[J]. 化学与生物工程, 2007, 24(8): 72-75.JIANG H F, WANG Y Q, LIU C G, et al. Comparison and improvement of three determination methods for lipase activity [J]. Chemistry and Bioengineering, 2007, 24(8): 72-75.[20] 邱广亮, 李咏兰. 磁性琼脂糖复合微球固定化纤维素酶的研究[J]. 精细化工, 2000, 17(2): 115-117.QIU G L, LI Y L. Immobilization of cellulase on magnetic agarose composite microsphere [J]. Fine Chemicals, 2000, 17(2): 115-117.。

磁性壳聚糖微球固定化脂肪酶研究

载率可达９．％，０６酶活４３５０４Ｕ／栽与游离酶相比，ｇ体；固定化酶ｐＨ和热稳定性都有较宽适用范围。关键词：性壳聚糖微球；固定化酶；磁脂肪酶
￣ｔ … ｕａｙＯｎｍｍｏｂｉｉａｔｏｎ ●’ ｉｉ ‘ ｌ… ・ｌｚｉ ‘ ０ｔ１Ｄａｓｉｌａｇｎｅ・＇－０ａｎｌｒｏｈｅｅ ’ｉ ● ｅＷ ●Ｉｍｔ・ＩｔＣｔＳｉｈｉｃ・ｍ ● ０ＳＣｒｓ
２ＣｉａＣｒｉｃｔｎ＆ＩｓｅｔｎＧｒｕｎｎＣ．Ｌｄ，ｈｎｚｏ５０８Ｃｉａ）．ｈｎｅｔａｉｉｆｏｎｐｃｉｏｐＨｅａｏ，ｔ．Ｚｅｇｈｕ４００。ｈｎｏ
ＡｂｔａｔＬｉａｅ（ＥＣ３１１３）ｓｉｓｒｃ：ｐｓ．．．ｗａｍｍｏｉｚｄｏｇｅｉｈｔｓｎｍｉｒｓｈｒｓｂｓｎｂｌｅｎｍａｎｔｃｃｉｏａｃｏｐｅｅｙｕｉｇｉ
ａｄｔｅｏｔｍｏｄｔｏｓｗｅｅａｃｒａｎｄＣｏａａｉｅｓｄｅｆＨｎｅｍａｔｂｌｙｂｔｅｎｐｉｈｍｕｃｎｉｎｒｓｅｔｉｅ．ｍｐｒｔｔｉｓｏａｄｔｒｌａｉｔｅｗｅｎｉｖｕｐｈｓｉｆｅｉａｅａｄｉｒｅｌｓｎｍｍｏｉｚｄｌａｅｗｅｅａｓｏｄｃｅｐｂｌｅｉｓｒｌｏｃｎｕｔｄ；Ｔｅｅｐｒｅｔｌｅｕｔｓｏｄｔａｈｉｐｈｘｅｉｎａｓｌｈｗｅｈｔｅｍｒｓｔｏｔｌｏｄｔｎｏｒｐｒｔｎｉｏｉｚｄｌａｅｗｅｅｌａｅ５０／ｍｇｃｒｉｒｉｐｉｎｉｏｓｒｅａａｉｍａｃｉｆｐｏｍｍｂｌｅｐｓｒｐｓ．ｍｇ１０ａｒｅ，ｍｍｏｉｚｔｎｉｉｉ０ｂｌａｉｉｏ

磁性壳聚糖微球的研究进展_宋艳艳

2012年第31卷第2期CHEMICAL INDUSTRY AND ENGINEERING PROGRESS ·345·化工进展磁性壳聚糖微球的研究进展宋艳艳1，2，孔维宝1，宋昊1，华绍烽1，夏春谷1（1中国科学院兰州化学物理研究所，羰基合成与选择氧化国家重点实验室，甘肃兰州 730000；2中国科学院研究生院，北京 100049）摘要：磁性氧化铁纳米粒子（Fe3O4，γ-Fe2O3等）因具有尺寸小、超顺磁性和低毒性等特点，已经引起了生物化工、医药工业研究领域的广泛关注。

磁性壳聚糖微球具有表面非常光滑的球形结构。

近年来，已经制备出了平均粒径在 10～2.5×105 nm 之间的磁性壳聚糖微球，并在生物医药、食品工程和污水处理等许多领域已经取得了初步的应用，特别是在污水处理和酶固定化领域。

本文综述了近年来磁性氧化铁纳米粒子和磁性壳聚糖微球的制备方法、磁性壳聚糖微球的改性方法及应用的最新研究成果。

关键词：磁性壳聚糖微球；固定化；四氧化三铁；纳米材料中图分类号：O 642.5；TB 332 文献标志码：A 文章编号：1000–6613（2012）02–0345–10Reseach progress in magnetic chitosan microspheresSONG Yanyan1，2，KONG Weibao1，SONG Hao1，HUA Shaofeng1，XIA Chungu1（1State Key Laboratory for Oxo Synthesis and Selective Oxidation，Lanzhou Institute of Chemical Physics，Chinese Academy of Sciences，Lanzhou 730000，Gansu，China；2Graduate University of Chinese Academy ofSciences，Beijing 100049，China）Abstract：Magnetic iron oxide（Fe3O4，γ-Fe2O3 etc.） nanoparticles have attracted researchers in various fields such as biochemical engineering and medicine industrical due to their small size，superparamagnetism and low toxicity. Magnetic chitosan microspheres are in sphere shape with a rather smooth surface. In recent years，magnetic chitosan microspheres were prepared with a mean size range of 10 nm to 2.5×105 nm. Magnetic chitosan microspheres have been preliminarily applied in various fields，including biomedicine，food engineering and wastewater treatment，etc，especially in the fields of wastewater treatment and enzyme immobilization. The preparation methods of magnetic iron oxide nanoparticles and magnetic chitosan microspheres，the recent achievements including modification methods and applications of magnetic chitosan microspheres，are reviewed in this paper.Key words：magnetic chitosan microspheres；immobilization；Fe3O4；nano-material近年来，磁性氧化铁纳米粒子由于具有粒径小、超顺磁性、低毒性等优良特性，已经被广泛地应用于生物学和医学研究，例如，对蛋白质和酶的固定化、生物分离、免疫分析、药物载体及磁共振成像[1]。

酶学论文：壳聚糖固定化酶的研究与应用

壳聚糖固定化酶的研究与应用摘要：介绍壳聚糖作为固定化酶载体的3种主要情况：壳聚糖直接作为固定化酶载体；壳聚糖衍生物作为固定化酶载体；壳聚糖与其他物质共同作为固定化酶载体。

壳聚糖及其衍生物等固定化酶具有酶活性高、回收率高和耐贮藏等特点。

指出壳聚糖及其衍生物在固定化酶技术领域有着广阔的应用前景。

关键词：壳聚糖；衍生物；固定化酶壳聚糖是甲壳素(chitin)脱乙酰基的产物，是由大部分2-氨基一2一脱氧一β—D-葡萄糖单元和少量N．乙酰-2一氨基-2一脱氧一β一D一葡萄糖单元以β一1，4糖苷键连接的二元线性共聚物，相对分子质量通常在几十万到上百万左右。

壳聚糖学名聚氨基葡萄糖，是一种生物相容性好、易生物降解、无毒、易得的天然功能高分子生物材料，易于制成粉、膜、多孔微珠、纤维、凝胶、纳米粒子等多种形态。

作为唯一一种碱性多糖，壳聚糖在固定化酶并保持其活性方面有独特的优点。

1 壳聚糖直接作为固定化酶载体。

壳聚糖本身是一种多孔网状天然高分子粉粒材料，耐热性好，其分子中的羟基和氨基可形成活泼界面，对蛋白质有显著的亲合力，可将酶吸附通过离子键、氢键及范德华力而与载体结合。

John等将壳聚糖研磨成粉状，与粉状胰蛋白酶混合研磨，通过吸附作用周定胰蛋白酶，结果表明：研磨时间越长，固定化效果越好。

李志国等以壳聚糖为载体，用物理吸附固定化脂肪酶，对影响固定化过程的各种因素进行考察，确定最优条件，结果表明：固定化酶的可操作性优于游离酶。

以壳聚糖为载体通过吸附制备固定化酶，酶不易失活，但酶与载体之间的结合力弱，在使用过程中酶分子易从载体上脱落，因此，多数情况下用吸附一交联法以提高其稳定性。

最常用的交联剂是甲醛和戊二醛，但更多采用戊二醛。

周纪宁采用甲醛活化交联壳聚糖固定L-天冬酰胺酶，其活力回收可达20％一25％。

岳振峰等将粉末状壳聚糖制备成微球形多孔载体，采用吸附——交联的方法进行固定化，在最佳固定化条件下，酶活力回收率为78．1％，具有较好的强度。

磁性复合微球固定化脂肪酶的研究

２４酶活的测定方法．
图１戊二醛浓度对酶固定化的影响
从图１可看出，当戊二醛浓度低于８时，％固定化酶的相对酶活随戊二醛浓度增加而增大；戊二当醛浓度继续升高，固定化酶的相对酶活则有所下降。
１５ｌ．ｍ正硅酸乙酯，同时３０／ｎ速度搅拌，０ｒｍｉ室温下
１实验材料与方法
１１实验材料及仪器．
反应６ｈ以上，反应结束后，永磁铁分离得到黑色固体，用倾注法加去离子水和无水乙醇反复洗涤，真空
干燥得到ＦＳＯ粒子。ｅＯ／ｉ
第２８卷第７期２１０２年４月
ＧａｓｃｅａｄＴ
．８，．２ｖ７０
却２１０２
磁性复合微球固定化脂肪酶的研究
杨云裳，邢兰坤，张应鹏
于５ｍ质量分数为２、％、％、％、０、２０ｌ％４６８１％１％的戊二醛溶液中，超声处理１ｍｉ，慢振荡２ｈ反５ｎ慢０，
２２壳聚糖包裹的Ｆ，９Ｏ磁性复合微球的．ｅＯ／ｉ
氨基化
取２５．ｇ磁性复合微球于２０圆底烧瓶中，５ｍｌ加
＝
３结果与讨论
３１固定化条件对酶活的影响．
３１１戊二醛浓度对固定化酶活的影响．．
无水乙醇洗，用去离子水洗，再真空干燥得到壳聚糖包裹的Ｆ３ＳＯ粒子。ｅ０／ｉ２

磁性高分子微球合成及其固定化脂肪酶的研究

很好的酶固定化材料．８参１．图，８关键词：ｅ高分子微球；Ｆ３；０固定化；脂肪酶
中图分类号：４．，Ｑ０８０６７３Ｔ２文献标识码：Ａ文章编号：６２９０（０８０ — ０４Ｏ１７－１２２０）４０９一５
度计（天津市普瑞斯仪器有限公司）ＪＭ一６８Ｌ；Ｓ３０Ｖ扫描电镜（本电子公司）日．
基金项目：国家重点基础研究发展计划（７）目（０３Ｂ１０４；９３项２０Ｃ７６０）湖南省自然科学基金资助项目（２Ｊ５０）０Ｊ０１Ｙ作者简介：朋（９８）男，黄１７一，重庆人，硕士，讲师，主要从事生物催化研究．
一
聚乙烯醇（Ｒ，Ａ）戊二醛（Ｒ；Ａ）过氧化苯甲酰（Ｒ；Ａ）石油
醚（Ｒ）二乙烯苯（Ｒ）脂肪酶ＬＫ（活力１，，Ａ；Ａ；Ｖ酶Ｏｕｇ
深圳市绿微康生物工程有限公司）等．实验仪器：Ｋ２０Ｓ２０Ｈ型超声波发生器，频率为
铁吸附，将沉淀磨碎即得到Ｆ３ｅ粒子，反应式为０
取阿拉伯胶溶液和橄榄油混合（：，ｖ，３ｖ）超声２ｉ，２／０ｎｍ
决这一问题的方法寻找更好的材料对脂肪酶进行固
定化凹．
药品：ｅ１・Ｈ０（Ｒ）ＦＳ４７２（Ｒ）；ＦＣ３６２Ａ；ｅＯ・Ｈ０Ａ
ＮＨ・２（Ｒ，Ｈ０Ａ油Ａ；Ａ；
目，前文献［一６报道了对脂肪酶的固定化的载１１］ｏ体有大孔树脂、琼脂、纤维素、聚乙烯亚胺和超顺磁性的Ｆｅ磁性粒子等材料，这些材料对脂肪酶的固定Ｏ化量比较小，稳定性不高，价格较为昂贵，回收工艺且复杂．磁性高分子微球是在Ｆｅ磁性的粒子外包裹Ｏ

固定化脂肪酶的研究进展

固定化脂肪酶的研究进展固定化脂肪酶的研究进展摘要：将脂肪酶固定化，可以提高酶的专一性及稳定性等，使酶的性质更加稳定，且反响条件温和，副产物少，易于别离。

本文综述了常用的固定化方法，包括物理吸附法、共价交联法和包埋法等，研究了不同的固定化方法对酶的性质的影响。

关键词：脂肪酶固定化方法脂肪酶是一类广泛用于催化甘油三酯水解的酶类。

除了具有水解的功能外，它还可以催化醇解、酯化、酯交换等反响，但在实际使用过程中，游离脂肪酶存在易失活、催化反响不稳定、与产物别离困难或别离本钱高等缺点【1】，因此限制了脂肪酶的进一步应用，然而通过选择适宜的载体及固定化方法，将脂肪酶固定化，可以有效解决上述问题。

本文介绍了近几年不同学者研究脂肪酶固定化的方法和研究成果，以期为固定化脂肪酶的生产及应用提供参考。

1.固定化脂肪酶的方法1.1吸附法吸附法通过氢键、疏水键、电子亲和力等分子间作用力完成酶的固定【2】。

吸附法具有工艺简单、酶剩余活力高、载体材料丰富的特点。

王冰【3】等以沙蒿多糖-壳聚糖复合磁性微球为载体，采用物理吸附法固定化脂肪酶，对固定化过程中对酶活力有影响的各种因素进行研究，同时对固定化酶的局部理化性质、最适IR、温度、酶的热稳定性和表观米氏常数等与游离酶做了比拟。

确定固定化脂肪酶的最正确条件为每0.1g 载体加2%的酶溶液0.9 ml，固定8h，pH 8.4，温度为50℃。

纵伟【4】等以磁性壳聚糖微球为载体，用物理吸附法固定化脂肪酶，对影响固定化的各种因素进行考察，确定固定化的最适宜条件为加酶量600 U/g，温度5℃ ，pH 7.0，固定时间2h，固定化酶连续使用5 次，其相对酶活仍为使用前的57.8% ，具有较好的操作稳定性。

Liu等【5】采用吸附法将脂肪酶固定在经四乙氧基硅烷修饰的磁性纳米颗粒上，并用此催化橄榄油和甲醇制备生物柴油，发现在室温条件下，当水质量分数为10%、转速为200rpm、醇油比4：1时，反响12h后生物柴油的产率可达70%。

固定化脂肪酶的研究进展

固定化脂肪酶的研究进展酶是活细胞内产生的具有高度专一性和催化效率的蛋白质，又称为生物催化剂。

酶作为生物催化剂，具有很高的催化功能、底物特异性和反应特异性。

近十年来，随着生物技术的发展，酶催化反应作为一种有效的手段越来越多地被有机化学家用于有机合成，并应用于医药、农药、日用化学品等部门。

目前，有2000种以上的酶已被人们认识，其中200多种已有市售。

用于有机合成中的酶大多数是脂肪酶和蛋白酶，尤以脂肪酶的应用更引人注目。

脂肪酶，三酯酰甘油酰基水解酶，催化油脂水解的一类酶的总称。

最初用于酯键的水解，广泛存在于动物、植物和微生物中。

由于水解底物是不溶于水的油脂，而脂肪酶本身是溶于水的蛋白，因此催化反应只能发生在油水相接触的界面（即油—水界面），这是脂肪酶特有的性质，最初由sarda和Desnuene发现并提出。

研究发现，来源不同的脂肪酶在一级结构上具有同源性，它们有着相似的结构序列，His-X-Y-Gly-Z-Ser-W-Gly 或Y-Gly-His-Ser-W-Gly（X、Y、Z和W表示非专一性的氨基酸残基），处于活性位点的丝氨酸残基被一个盖子（a-螺旋盖子）保护，当脂肪酶与界面接触时盖子打开，此时在丝氨酸附近产生电位区域而导致脂肪酶结构重排，疏水残基暴露，亲水残基被掩盖，从而增加了脂肪酶与脂溶性底物的亲和性，并且增加了反应过程中中间过渡态的稳定性。

脂肪酶的天然底物是甘油酯类。

然而研究表明，脂肪酶除了能够催化甘油酯类化合物的水解和合成之外，还可以用于催化酯交换反应、生物表面活性剂的合成、多肽合成、聚合物的合成和药物的合成等，尤其是利用某些脂肪酶的立体专一性，催化旋光异构体的拆分和手性药物的合成成为酶工程领域研究的新热点。

因而脂肪酶及其改性制剂在食品与营养、油脂化学品工业、农业化学工业、造纸工业、洗涤和生物表面活性剂的合成以及药物合成等许多领域得到广泛应用。

虽然脂肪酶能够催化多种化学反应，已应用于精细化工，生物柴油，传感器等领域，但用于大规模工业催化仍存在缺陷和不足。

脂肪酶固定化方法的研究进展

脂肪酶固定化方法的研究进展生物工程2班周明 20091525摘要：酶的固定化是生物技术中最为活跃的研究领域之一。

脂肪酶能发生催化水解、醇解、酯化、酯交换等反应，是一种重要的生物催化剂。

而由于脂肪酶的特性，其能否工业化利用很大程度取决于固定化技术的成功与否，酶的固定化方法是酶固定化技术的重要研究内容。

固定化脂肪酶由于其易与底物分离且可重复使用而备受关注。

为此，本文综述了常用的固定化方法，包括物理吸附法、共价结合法、交联法和包埋法，不同的固定化方法对酶的性质有不同的影响。

本文对近年来固定化脂肪酶方法的研究进行了综述，为固定化方法的进一步探讨提供了研究基础。

关键词：固定化；脂肪酶；载体材料The research progress of lipase immobilized Abstract：Of enzyme fixed is in the biotechnology research field of the most active.Fat enzymes would happen catalytic water and alcohol, ester, ester exchange for is a major catalyst of biological.And the fat, the enzymes can be very much depends on the use of technology on the success of the enzyme is a fixed set of the technical content of important research.Into a fatty because of the enzymes that are and separate and can reuse have a major concern.The common immobilization methods were generally introduced including physical adsorption, covalent cross-linking method and entrapment method. Different immobilization methods had different effects on the enzyme.Of the few years, the enzymes a study of the review, as a further explore the method provides research.Keywords：immobilization; lipase; carrier脂肪酶（Lipase EC3.1.1.3，甘油酯水解酶）是一类特殊的酰基水解酶它的底物是油脂其水解部位是油脂中脂肪酸和甘油相连接的酯键[1]；人们对脂肪酶的研究已有上百年的历史，是最早被研究的酶类之一[2]。

固定化脂肪酶载体的筛选

农业基础科学现代农业科技2012年第5期脂肪酶（lipase）是一类特殊的酰基水解酶和重要的工业酶制剂品种，可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，且在异相体系中具有催化活性，广泛应用于生物柴油的制备、手性化合物的拆分、油脂改性等方面的研究[1-3]。

但由于脂肪酶的造价昂贵，对环境耐受力低，稳定性较差，且游离酶不易于回收、难以重复回收利用，使脂肪酶在工业化生产中深受其限[4]。

为此，通过固定化技术和蛋白质工程来大幅提高脂肪酶的综合催化性能已成为当今研究热点。

高阳等[5]以不同大孔树脂吸附法固定化假死酵母99-125脂肪酶，在微水有机相中的应用表明，非极性树脂NKA 是最佳的固定载体。

王冰等[6]以沙蒿—壳聚糖复合磁性微球为载体，采用物理吸附法固定脂肪酶，对影响酶活力的各种因素进行了分析研究。

杨本宏等[7]研究了海藻酸钠法制备固定化德氏根霉脂肪酶的条件。

但许多固定方法在单独使用和催化生成不同产物时都存在缺点。

如：吸附法中酶与载体之间的作用力弱，对外界环境要求严格，且吸附存在非特意性易引入杂质；包埋固定化酶易流失，不利于保存，且对短链醇的有机耐受性差；共价交联过程较复杂，化学试剂的使用使酶在处理过程中容易失活等[8]。

本研究通过对不同固定化材料进行比对分析，选择针对生产生物柴油所需的固定化脂肪酶进行研究，为今后的研究提供参考。

1材料与方法1.1供试材料1.1.1供试药剂。

海藻酸钠：国药集团化学试剂有限公司；壳聚糖：脱乙酰远远大于90.0%，国药集团化学试剂有限公司；大孔树脂：P3520，天津南开大学化工厂；硅藻土：国药集团化学试剂有限公司；脂肪酶：阿拉丁试剂公司，10万U/g；三丁酸甘油脂：阿拉丁试剂公司。

1.1.2主要仪器。

电子天平：德国赛多利斯股份公司；恒温磁力搅拌器：金坛市富华仪器有限公司；PB-10数字酸度计；多用途台式恒温振荡器：DDHZ-300。

1.2试验方法1.2.1脂肪酶的海藻酸钠固定。

壳聚糖微球的制备及其对脂肪酶的固定化研究

脂肪酶（EC.3.1.1.3）是一类特殊的酰基水解酶，是目前用途最广泛的酶催化剂之一，在食品、制药、化工等领域中均有广泛的应用[1-2]。

然而，游离酶在应用时，存在着一些缺点（如酶难以分离、无法重复利用等）。

将脂肪酶进行固定化之后，不但保持了酶原有的高效、专一催化的特点，而且克服上述缺点，因此具有良好的应用前景。

壳聚糖是一种来源丰富、具有良好生物相容性和生物可降解等性质的天然高分子多糖，其溶液具有良好的成胶性，易于形成膜、微球、凝胶、纳米粒子等多种形态，是一类性能优良的固定化酶载体[3-5]。

目前已有文献报道将壳聚糖用于脂肪酶的固定化，本研究采用反相悬浮法制备壳聚糖微球，并对其特性进行了探讨，并作为载体应用于脂肪酶的固定化，为高效利用脂肪酶打下了基础。

1材料与方法1.1试验材料壳聚糖（脱乙酰度90%，黏度50mPa·s）：浙江金壳生物化学有限公司；脂肪酶（BR）：国药集团；其他试剂均为分析纯。

1.2主要仪器恒温振荡器，磁力搅拌器，离心机，电子天平等。

1.3壳聚糖微球的制备采用反相悬浮法进行制备[6]。

准确称取一定量的壳聚糖溶于4%的醋酸溶液中制得壳聚糖溶胶，并在烧杯依次加入液体石蜡、乙酸乙酯和span-80，充分搅拌后，在800r/min转速条件下缓慢加入壳聚糖溶胶，继续高速搅拌一定时间，使溶胶液滴均匀分散，然后缓慢加入一定量的25%戊二醛溶液，在一定温度条件下水浴加热反应一段时间。

静置冷却后，将所得乳液倒入2.5mol/L NaOH/无水乙醇（体积比为1∶2）的混合液中，充分混合振荡，随后抽滤除去溶剂，最后用去离子水反复洗涤至中性后，得到固形微粒，4℃冰箱存放。

1.4壳聚糖微球的性能测定1.4.1壳聚糖微球含水率的测定将微球置于离心管内，2000r/min离心5min，除去微球外的水分。

取出微球，将其放入到已恒重（m1，g）的具塞称量瓶中称重（m2，g），并在（105±2）℃烘干至恒重，最后待称量瓶在干燥器中冷却至室温后称量（m3，g），按下式计算微球的含水量（X%）[6]：X（%）=（m2-m3）/（m2-m1）×100%1.4.2壳聚糖微球密度的测定微球的堆积密度（亦称视密度），是指每单位体积中微球的重量，包括了微球的颗粒间隙。

磁性壳聚糖微球固定化脂肪酶的研究

磁性壳聚糖微球固定化脂肪酶的研究常凯;王红英;孙井辉;钱斯日古楞【摘要】The immobilized condition of lipase onto magnetic chitosan microspheres by cross-linking with glutaldehyde was optimized and the immobilized lipase was characterized. The optimum immobilizing time was 7 h, the optimum pH was 8, the optimum temperature was 50 ℃, and the optimum lipase amount were added 10 mg in 100 mg microspheres. Compared with free lipase, the thermal and acid-basic stabilities of immobilized lipase were increased appreciably. After 5 recycle of hydrolyzation, the activity of immobilized lipase remained 82.6％ of its initial activity. Magnetic chitosan microsphere was a kind of good support for immobilizing lipase.%以纳米级磁性壳聚糖微球为载体,戊二醛为交联剂固定化脂肪酶,对固定化脂肪酶条件进行优化,同时对固定化脂肪酶的理化性质、活性回收率、热稳定性和储存稳定性进行研究.结果表明,固定化脂肪酶的最佳时间为7 h,最佳pH为8,最佳温度为50 ℃,最佳酶加量为每100 mg磁性微球加酶10 mg.和自由酶相比,脂肪酶被磁性壳聚糖固定化后其热稳定性、pH稳定性均得到明显提高.固定化脂肪酶重复使用5次,仍然保持82.6%相对活力.磁性壳聚糖微球是固定化脂肪酶的良好载体.【期刊名称】《大连工业大学学报》【年(卷),期】2011(030)001【总页数】4页(P30-33)【关键词】磁性微球;固定化酶;脂肪酶【作者】常凯;王红英;孙井辉;钱斯日古楞【作者单位】大连工业大学生物工程学院,辽宁大连,116034;大连工业大学生物工程学院,辽宁大连,116034;大连工业大学生物工程学院,辽宁大连,116034;大连工业大学生物工程学院,辽宁大连,116034【正文语种】中文【中图分类】TS224;Q814.2脂肪酶是目前用途最广泛的酶催化剂之一[1]。

1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

固定化酶的pH和热稳定性都优于游离酶，固定化酶连续使用5次，其相对酶活仍为使用前的57.8%，具有较好的操作稳定性。

结论：磁性壳聚糖微球是固定脂肪酶的良好载体。

E-mail:zongwei1965@收稿日期：2007-10-26脂肪酶(EC.3.1.1.3)是一类特殊的酰基水解酶，脂肪酶能在油-水界面上催化酯水解、酯合成、酯交换、高聚物合成和立体异构拆分等有机合成反应[1～3]。

但游离酶催化，存在酶难以分离，无法重复利用等缺点。

固定化脂肪酶，不仅能保持酶催化高效和专一的特点,而且能大大提高酶的热稳定性和化学稳定性，同时,易于分离,有利于酶的多次重复使用及产品的纯化[4]。

然而，对于非磁性载体固定化酶的应用，存在着必须离心操作，样品不得不稀释及载体回收损失大等问题。

因此，寻求更好的固定化酶载体成了人们研究的热点，用磁性高分子作为酶的固定化载体可以有效地避免以上问题，它可借助外部磁场，简单、方便地回收和磁性导向，因此，近年来磁性高分子载体固定脲酶、糖化酶等的研究已有报道[5，6]，而采用磁性壳聚糖微球固定脂肪酶，还少有报道。

因此，本研究以磁性壳聚糖为载体，采用物理吸附法固定脂肪酶，探讨固定化的工艺条件，并对固定化酶的性质进行研究。

1试验材料与方法1.1材料与仪器壳聚糖：浙江玉环生物制品公司，脱乙酰度85%；脂肪酶：华东理工大学学生物反应器工程国家重点实验室；25%戊二醛：中国医药集团上海化学试剂公司；其他试剂：均为分析纯；数控恒温水浴锅：常州国华仪器有限公司；pH计：上海第二分析仪器厂；751-GD紫外可见光分光光度计：上海分析仪器总厂。

1.2试验方法1.2.1磁性壳聚糖微球的制备将400mL的FeCl 2(0.123mol/L)-Fecl 3(0.103mol/L)混和液与5mol/L的NaoH溶液160mL混合，剧烈搅拌10min，得到磁流体，将2mL磁流体、4%壳聚糖乙酸溶液（3%乙酸溶液配制）20mL、80mL液体石蜡、5mL span-80加入200mL锥形瓶中，于40℃下充分搅拌15min，然后加入4mL 18.5%戊二醛，调pH至9.0，反应2h，分别用异丙醇、乙醚、丙酮和水充分洗涤后，冻干，用磁铁将产物分离，得磁性壳聚糖微球[7]。

1.2.2磁性壳聚糖微球固定化酶的制备将磁性壳聚糖微球加入100mL锥形瓶中，用磷酸缓冲液充分溶涨，取出，同时将脂肪酶溶于pH7.0的磷酸缓冲液100mL，然后将溶涨的磁性壳聚糖微球加入脂肪酶磷酸缓冲溶液中，在恒温摇床上于振荡一定时间，用磁铁将磁性壳聚糖微球沉淀，倾出上清液，用磷酸缓冲液洗至洗出液无紫外吸收，得固定化酶[8]。

1.2.3酶活的测定采用橄榄油乳化法测定脂肪酶的活性[9]。

脂肪酶的活力定义：1min 内催化脂肪水解生成1μmol 脂肪酸所需的酶量定义为1单位酶活力。

1.2.4固定化酶的活力回收率%=100% 固定化酶活力活力回收率（）制备时加入酶的总活力2结果与讨论2.1固定化反应条件的确定分别研究不同酶量、固定温度、固定pH 和固定时间对固定化酶的活力回收率的影响，结果见图1～4。

（温度5℃，pH7.0,时间2h）(加酶量600U/g,pH7.0,时间2h)图1加酶量对活性回收率的影响图2温度对活性回收率的影响（加酶量600U/g,温度5℃,时间2h）（加酶量600U/g,温度5℃,pH7.0）图3pH对活性回收率的影响图4时间对活性回收率的影响从图1～图4可见，加酶量小于600U/g时，随着加酶量增加，固定化酶的活力回收率增加，但大于600U/g后，固定化酶的活力回收率增加缓慢；温度越低，固定化酶的活力回收率越低；pH7.0时，固定化酶的活力回收率最大，过酸过碱条件下，固定化酶的活力回收率都减少；在2h以内，时间增加，固定化酶的活力回收率增加，但大于2h后，固定化酶的活力回收率增加缓慢。

综合以上因素，固定化酶的条件采用加酶量600U/g、温度5℃、pH7.0、固定时间2h。

2.2固定化酶性质的研究2.2.1固定化酶的热稳定性将固定酶和游离酶在pH7.0条件下，置于不同的温度中，30min后分别取固定酶和游离酶测定其活力(图5)。

固定化酶的热稳定性明显高于游离酶。

在40℃处理30min后，固定化酶仍保持54.4%的酶活，而这时游离酶活只有32.9%，可见固定酶具有更好的热稳定性。

这可能是因为固定化后酶分子之间、以及酶与载体分子之间的相互作用使得酶分子结构刚性增强,因而抗拒热变性作用能力增加所致，游离酶由于缺乏这些作用力，较容易因为去折叠而变性。

2.2.2固定化酶的pH稳定性将固定酶和游离酶在20℃条件下，置于不同pH条件下,30min后分别取固定酶和游离酶测定其活力(图6)。

固定化酶的pH稳定性明显高于游离酶。

这是因为在固定化过程中,吸附或交联使酶分子产生多位点固定化,与游离酶相比,固定化酶分子的构象更加稳定,对酸碱的耐受性更强。

图5固定化酶的热稳定性图6固定化酶的热稳定性2.2.3固定化酶的操作稳定性将固定化酶重复用于橄榄油乳化液的水解反应,观察酶活变化，结果见图7,当固定化酶重复使用5次后，其相对酶活仍为未使用时的57.8%，表明固定化酶的操作稳定性较好。

图7固定化酶的操作稳定性3结论吴茜茜等[10]研究了壳聚糖吸附和戊二醛交联对脂肪酶固定化条件，经固定后，酶活力回收率约为54.2%，经过10批次连续水解植物油反应，固定化酶的活力保持在82.6%；陈秀琳[11]采用CM-纤维素固定化脂肪酶，经固定后，酶活力回收率最高为41.8%，经水解橄榄油重复试验发现:其半衰期为225h。

本试验以磁性壳聚糖微球为载体，采用吸附法固定化的脂肪酶，酶活力回收率最高为43.6%,重复用于橄榄油乳化液的水解反应5次后，其相对酶活仍为未使用时的57.8%,表明其活力回收率和使用稳定性于以上方法相当，但该法固定的脂肪酶，使用磁场回收，回收更方便。

以磁性壳聚糖微球为载体，采用吸附法固定化脂肪酶，固定化酶的条件为：加酶量600U/g、温度5℃、pH7.0、固定时间2h。

同游离酶相比，固定化脂肪酶pH 稳定性、热稳定性均高于游离酶,表明磁性壳聚糖微球是固定脂肪酶的良好载体。

参考文献1周健,倪婉星,张晓鸣.非水相脂肪酶催化体系分子筛脱水机制的研究[J].食品与机械,2005，21(2):77～79.Zhou Jian,Li Wanxin Zhang Xiaoming.Study on the dehydration mechanism of molecular sieve for lipase-catalyzed reaction systems in organicsolvent[J].Food and machinery,2005,21(2):77～79.2Sirirung W,Aran H K,Uwe T et al.lipase-catalyzed synthesis of structured triacylglycerides from1,3-Diacylglycerides[J].Jaocs,2004,81(2):151～155.3Wongsakul S,Prasertsan P,Bornscheuer U T,et al.Synthesis of2-Monoglycerides by alcoholysis of palm oil and tuna oil using immobilized lipases[J].Eur J Lipid Sci.Technol,2003(105):68～73.4杨本宏,蔡敬民,吴克,等.海藻酸钠固定化根霉脂肪酶的制备及其性质[J].催化学报,2005，26(11):977～981.Yang Benhong,Cai Jingmin,Wu ke,et al.Preparation and properties of sodium alginate-immobilized rhizopus delemar lipase[J].Chinese journal of catalysis,2005，26(11):977～981.5任广智,李振华.磁性壳聚糖微球用于酶的固定化研究[J].离子交换与吸附,2001,17(2):152～158.Ren Guangzhi,Li Zhenhua.The immobilization of urease onto magnetic chitosan microsphere[J].Ion exchange and adsorption,2001,17(2):152～158.6Bahar T,Celebi S S.Characterization of glucoamylase immobilized on magnetic poly(styrene)particles[J].Enzyme and Microbial Technology,1998(23):301～304.7Denkbas E B,Kilicay E,Birlikeseven C,et al.Magnetic chitosan microsphere: prepapation and characterization[J].Reactive&Functional Polymers,2002(50):225～232.8王斌,谢苗,曾竞华,等.磁性壳聚糖微球固定化褐藻酸酶的研究[J].中国水产科学，2004,11(3):253～257.Wang Bin,Xie Miao,Zhen Jinhua,et al.Study of immobilization of alginate lyaseon cross-linked magnetic chitosan microspheres[J].Journal of fishery sciences of china,2004,11(3):253～257.9Pawinee K,Suree P.Simple assay method for lipase activity and analysis of its catalytic hydrolysis product in water-poor media[J].IndianJ.Chem.,1993(32):88～89.10吴茜茜,吴克,刘斌,等.壳聚糖固定化德氏根霉脂肪酶的研究[J].工业微生物，2003，33（4）：9～12.Wu Qianqian,Wu Ke,Liu Bin,et al.Immobilization conditions of lipase from Rhizopus delemar[J].industrial microbiology,2003，33（4）：9～12.11陈秀琳.CM-纤维素固定化脂肪酶的研究[J].海峡药学杂志,2005,17(1):35～37.Chen xiulin.The Studies of the Lipase Immobilized on Carboxymethylcellulose[J].Strait pharmaceutical Journal,2005,17(1):35～37.。