等温滴定量热仪(ITC)在分子相互作用中的应用
等温滴定量热技术——小分子药物开发不可或缺的标准信息
Product Group 950 951 952 952
应 用 园 地
搭建结构与功能的桥梁
利用差示扫描量热仪更好地指导抗体疗法的工艺开发
作者：Stephen Demarest博士，Biogen Idec
确定pH和离子强度对蛋白稳定性的影响对于
摘要
可靠的蛋白质纯化步骤及配方策略的开发很关键。 目前毛细管差示扫描量热仪（Capillary DSC）能够 提供此类独特的信息，特别适合治疗性蛋白的开 发。本文所描述的是DSC对作为药物的IgG1和IgE这 两种抗体的pH/离子强度稳定性的研究。只有DSC 能够对多结构域蛋白（如抗体）的单独结构域的稳 定性进行研究。本文中DSC证明了IgE的恒定结构域 片段（Fc）比IgG1 Fc对低pH/高盐条件更为敏感。 这些结果表明IgG抗体常用的纯化和配方策略并不 适用于IgE。本研究展示了DSC如何用于指导抗体和 其他治疗性蛋白的工艺开发方法。
微量量热技术的最新突破-iTC200TM及 Auto-iTC200TM
等温滴定量热技术在全世界的药物开发实验室 已经获得了广泛的认可。大型的制药公司、生物技 术公司以及研究机构，都在利用ITC来充分鉴定生物 分子间相互作用。ITC所确定的结合参数常常被认为 是“金标准”值，并经常作为其它技术的参考。
等温滴定量热技术在确定具体靶点通路的作 用机理（MOA）上扮演着关键的角色。由于ITC直 接测量生物分子结合事件中所释放或吸收的热量， 那么无需提前了解生物过程，也无需标记。生物分 子的相互作用可在天然状态下用内源的酶、底物或 配体来监测。这有一个额外的好处，就是显著缩短 了分析开发的时间。
ITC已经证明是分析开发的有用工具，即检验 所设计分析系统的生物相关性，该系统利用替代
等温滴定量热仪(ITC)在分子相互作用中的应用
非特异性结合
ITC 技术的应用领域
分子相互作用：
溶液中的几乎所有天然状态分子： 包括蛋白质、核酸、多肽、药物分子、 脂类、金属离子、小分子等等；
工艺过程的开发和控制
酶动力学 药物研发 非生物系统
抗生素抗性的菌种为什么能更好的 消灭抗生素
Tobromycin binding to aminoglycoside nucleotidyltransferase(2”)
量热池
样品池
对照池
∆T1：样品池温度反馈
神奇的微量热控制—功率补偿
SR
The DP is a measured power differential between the reference and sample cells to maintain a zero temperature between the cells
酶反应动力学的研究 (不一般的ITC曲线）
Kcat：催化速率常数 KM：米氏常数
酶反应动力学应用
测量PP1-γ磷酸酶水解PNPP
ITC测量PP1-γ磷酸酶水解 PNPP速度的原始数据
PP1-γ磷酸酶水解PNPP的MichaelisMenten曲线
ITC Applications Enzyme Kinetics
研究所
中科院生化细胞所 中科院生物物理所 北京生命科学研究所 诺华制药研发中心……
Thanks!
陈雍硕
E-mail: Yongshuo.chen@ Mobile: 13918729620
令人郁闷的公式说明了什么？
1. 相同的KD有着相同的∆G； 2. 相同的∆G却有着不同的∆H与∆S组合。
2024年等温滴定量热仪市场分析现状
2024年等温滴定量热仪市场分析现状概述等温滴定量热仪（Isothermal Titration Calorimeter，ITC）是一种重要的分析仪器，用于研究化学反应和生物分子间的相互作用。
本文将对等温滴定量热仪市场的现状进行分析，并探讨该市场的趋势和发展前景。
市场规模等温滴定量热仪市场在过去几年呈现稳定增长的趋势。
目前，全球等温滴定量热仪市场规模约为5000万美元，预计未来几年将保持每年3%的增长率。
市场驱动因素1. 物质研究的增加随着化学和生物科学的发展，对于物质的研究需求越来越大。
等温滴定量热仪可以用于测量化学反应的热效应，帮助科学家了解化学反应的热力学性质。
同时，ITC还可以用于研究生物分子的相互作用，例如蛋白质与配体的结合过程。
这些应用领域的增加促进了等温滴定量热仪市场的发展。
2. 新技术的应用近年来，等温滴定量热仪市场受益于新技术的应用。
例如，一些新型的微量热效应探测器的出现，使得等温滴定量热仪在灵敏度和分辨率方面有了显著的提升。
此外，自动化技术的发展也使得操作更加简便，提高了实验效率。
市场趋势1. 生物医药领域的快速增长生物医药领域的快速发展将成为等温滴定量热仪市场的主要推动力。
例如，药物设计过程中需要了解药物与蛋白质之间的相互作用，这就需要使用ITC进行研究。
随着生物医药领域的研究和发展逐渐成熟，对于等温滴定量热仪的需求将大幅增加。
2. 自动化技术的应用随着自动化技术的不断发展，等温滴定量热仪市场将迎来新的机遇。
自动化技术可以使实验操作更加简便和高效，节约时间和人力成本。
预计未来几年，自动化等温滴定量热仪将成为市场的主流产品。
3. 多学科交叉应用等温滴定量热仪的应用领域不仅局限于化学和生物学，还可以在其他学科中发挥作用。
例如，材料科学领域中对于材料的热稳定性研究可以采用等温滴定量热仪。
多学科交叉应用将进一步推动等温滴定量热仪市场的发展。
市场竞争格局目前，全球等温滴定量热仪市场主要由几家大型企业垄断，例如MicroCal、Malvern、TA Instruments等。
微量热等温滴定量热仪（ITC）
微量热等温滴定量热仪（ITC）一、仪器用途：微量热等温滴定量热仪（ITC）广泛应用于小分子、蛋白、抗体、核酸、脂类及其他生物分子之间的相互作用特征鉴定；酶动力学；分析因分子结构改变导致的结合变化等。
二、技术指标和参数（带*者为必须具备指标）：1、应用范围包括：小分子、蛋白、抗体、核酸、脂类及其他生物分子之间的相互作用特征鉴定；酶动力学；分析因分子结构改变导致的结合变化等。
2、应用Peltier电子温控系统保持样品室温度*3、短期噪音水平：0.2 ncal/s4、参照重复性：Mean≤1.5 μcal5、操作温度范围：2℃~80℃*6、平衡时间＜6min（从25℃至5℃）*7、温度稳定性为0.00015℃/秒（25℃时）8、最小响应时间：10 S9、测量池材质：哈司特镍碳合金(Hastelloy TM)10、测量池体积：200μl*11、实际样品需求量不超过280ul；*12、测量池类型：硬币状，固定式13、注射器：40μl，自动滴定14、最小注射体积：0.1μl*15、在线自动清洗平台，确保清洗效果的一致性及客观性，方便、快捷、易操作，减少实验操作者的劳动强度16、热补偿方式：功率反馈*17、附带控制系统，内装Origin 7数据分析软件*18、软件要求内置7种以上分析模型：单一位点，两位点，顺序位点，竞争性位点，酶动力学，解离等；*19、系统可设定三种反馈模式（高、中、低），可根据不同需要灵活选择；20、结合常数检测范围：直接检测法-从毫摩尔到纳摩尔浓度范围（102~109 M-1）间接检测法-从纳摩尔到皮摩尔范围（109~1012M-1）*21、搅拌速率：1000转以上；22、质保期1年。
23、进样针5根。
三、技术服务要求：1、供应商必须提供仪器的现场安装调试并达到投标书指标要求的技术性能，并同时在现场对用户进行操作培训。
2、仪器在调试验收合格后，提供一年免费保修服务，在保修期内，所有服务及配件全部免费，保修期外，仪器终身维修。
结构化学实验-itc等温量热滴定
一、实验目的：1.了解MicroCal iTC200等温滴定量热仪在测量蛋白质相互作用中的应用2.了解仪器基本工作原理，学习蛋白质相互作用的测定步骤和仪器操作3.简要分析实验结果。
二、实验原理：在研究两种或两种以上的蛋白质的功能时，相关蛋白质之间常常存在相互作用（常常是氢键或范德华力），如果两蛋白可以彼此结合，则结合的过程中会放出一定的热量。
所以，通过测定蛋白质相互作用时放出热量的大小，可以得到蛋白相互作用时的结合常数KD、化学计量比N和焓变ΔH，从而由热力学公式ΔG = RT lnKD和ΔG = ΔH -TΔS可以进一步得到反应的自由能变化。
在恒温下，注射器中的“配体”溶液滴定到包含“高分子”溶液的池中。
当配体注射到池中，两种物质相互作用，释放或吸收的热量与结合量成正比。
当池中的高分子被配体饱和时，热量信号减弱，直到只观察到稀释的背景热量。
MicroCal iTC200等温滴定量热仪可以用来定量测定生物分子间的相互作用，例如蛋白质-蛋白质相互作用（包括抗原-抗体相互作用和分子伴侣-底物相互作用）；蛋白质折叠/去折叠；蛋白质-小分子相互作用以及酶-抑制剂相互作用；酶促反应动力学；药物-DNA/RNA相互作用；RNA折叠；蛋白质-核酸相互作用；核酸-小分子相互作用；核酸-核酸相互作用；生物分子-细胞相互作用等。
从而获得亲和力以及相关热力学数据。
通过滴定操作和热量的测量，量热仪可以给出热量-摩尔比曲线：图像中曲线的突跃中点对应的化学计量比就是两种蛋白质相互作用的化学计量数N，突跃中点处曲线的斜率就是两种蛋白相互作用的结合常数KD。
决定曲线形状的主要参数是C值：C = 滴定池中的蛋白浓度/ KD = [M]t/ KD × NC值越大，曲线越陡；C值越小，曲线越平缓，没有明显的突跃。
一般C值在10-100之间实验效果最好。
配体溶液多次次注射到ITC池的蛋白溶液中。
每个注射峰下方的区域的面积与注射所释放的总热量相等。
等温滴定微量热仪(ITC)简介
等温滴定微量热仪(ITC)简介等温滴定量热法在生命科学研究中应用申明：本资料来源于网络，版权归原作者所有！等温滴定量热法(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)是近年来发展起来的一种研究生物热力学与生物动力学的重要方法，它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息。
微量热法具有许多独特之处。
它对被研究体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件，即具有非特异性的独最小可检测热效应0.125uJ，生物样品最小用量0.4ug，温度范围2 0C - 80 0C，滴定池体积1.43 ml)。
实验时间较短(典型的ITC实验只需30-60分钟，并加上几分钟的响应时间)，操作简单(整个实验由计算机控制，使用者只需输入实验的参数，如温度、注射次数、注射量等，计算机就可以完成整个实验，再由Origin 软件分析ITC得到的数据)。
测量时不需要制成透明清澈的溶液, 而且量热实验完毕的样品未遭破坏，还可以进行后续生化分析。
尽管微量热法缺乏特异性但由于生物体系本身具有特异性，因此这种非特异性方法有时可以得到用特异方法得不到的结果，这有助于发现新现象和新规律，特别适应于研究生物体系中的各种特异过程。
ITC的用途获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括结合常数、结合位点数、摩尔结合焓、摩尔结合熵、摩尔恒压热容，和动力学参数(如酶活力、酶促反应米氏常数和酶转换数)。
ITC的应用范围蛋白质-蛋白质相互作用(包括抗原-抗体相互作用和分子伴侣-底物相互作用)；蛋白质折叠/去折叠；蛋白质-小分子相互作用以及酶-抑制剂相互作用；酶促反应动力学；药物-DNA/RNA相互作用；RNA折叠；蛋白质-核酸相互作用；核酸-小分子相互作用；核酸-核酸相互作用；生物分子-细胞相互作用；……加样体积：（实际体积）cell：1.43 ml，syringe：300 μl准备样品体积（最少量）cell：2 ml，syringe：500 μl样品浓度cell：几十μM到几mMsyringe：几百μM到几十mM测量Kb范围102-1012 M-1滴定实验前恒温30-60 min等温滴定量热实验所需时间，一般1.5-4 hrSample Preparation Guidelines (ITC).Proper sample preparation is essential for successful ITC testing. In particular, the minimal guidelines below must be strictly followed to insure an accurate estimate of stoichiometry (n), heat of binding (H), and binding constant (Kb) (or dissociation constant Kd = 1/Kb).1.) The macromolecule solution (the sample to be placed in the reaction cell) must have a volume of at least2.1 ml. The lowest concentration which can be studied is 3 M and this is adequate only for tight binding where Kd is smaller than 1 M. For weaker interactions, the macromolecule concentration should be 5 times Kd, or higher if possible. Preferably, the macromolecule solution should be dialyzed exhaustively against buffer for final equilibration.2.) The ligand solution (the sample to be placed in the injection syringe) must have a volume of at least 0.7 ml. Its concentration should be at least 10 times higher than the concentration of macromolecule (if the macromolecule has multiple binding sites for ligand, then the ligand concentration must be increased accordingly). The buffer solution in which the ligand is dissolved should be exactly the same buffer against which the macromolecule has been equilibrated.3.) After both solutions have been prepared, the pH of each should be checked carefully. If they are different by more that 0.05 pH units, then one of the solutions must be back-titrated so they are within the limit of 0.05 pH units. If any particles are visible in either solution, they should be filtered out.4.) If possible, the concentrations of both solutions should be accurately determined after final preparation. Accurate determination of binding parameters is only possible if concentrations of binding components are known precisely.5.) At least 20 ml of buffer must be sent along with the two samples, since this is used for rinsing the cell and for dilution if necessary.6.) If possible, DTT should be avoided as a disulfide reagent and replaced by -mercaptoethanol or TCEP.等温滴定微量热仪（ITC）基本介绍等温滴定微量热仪（ITC）基本介绍（美国MicroCal ，美国微量热公司）仪器设备名称：等温滴定微量热仪制造国别：美国制造厂商：美国微量热公司规格型号：VP-ITC品牌：MicroCal总代理商：华嘉（香港）有限公司技术指标：短期噪音水平：0.5纳卡/秒(2 纳瓦)。
等温滴定微量热仪(ITC)简介
等温滴定微量热仪(ITC)简介等温滴定量热法在生命科学研究中应用申明：本资料来源于网络，版权归原作者所有！等温滴定量热法(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)是近年来发展起来的一种研究生物热力学与生物动力学的重要方法，它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息。
微量热法具有许多独特之处。
它对被研究体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件，即具有非特异性的独最小可检测热效应0.125uJ，生物样品最小用量0.4ug，温度范围2 0C - 80 0C，滴定池体积1.43 ml)。
实验时间较短(典型的ITC实验只需30-60分钟，并加上几分钟的响应时间)，操作简单(整个实验由计算机控制，使用者只需输入实验的参数，如温度、注射次数、注射量等，计算机就可以完成整个实验，再由Origin 软件分析ITC得到的数据)。
测量时不需要制成透明清澈的溶液, 而且量热实验完毕的样品未遭破坏，还可以进行后续生化分析。
尽管微量热法缺乏特异性但由于生物体系本身具有特异性，因此这种非特异性方法有时可以得到用特异方法得不到的结果，这有助于发现新现象和新规律，特别适应于研究生物体系中的各种特异过程。
ITC的用途获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括结合常数、结合位点数、摩尔结合焓、摩尔结合熵、摩尔恒压热容，和动力学参数(如酶活力、酶促反应米氏常数和酶转换数)。
ITC的应用范围蛋白质-蛋白质相互作用(包括抗原-抗体相互作用和分子伴侣-底物相互作用)；蛋白质折叠/去折叠；蛋白质-小分子相互作用以及酶-抑制剂相互作用；酶促反应动力学；药物-DNA/RNA相互作用；RNA折叠；蛋白质-核酸相互作用；核酸-小分子相互作用；核酸-核酸相互作用；生物分子-细胞相互作用；……加样体积：（实际体积）cell：1.43 ml，syringe：300 μl准备样品体积（最少量）cell：2 ml，syringe：500 μl样品浓度cell：几十μM到几mMsyringe：几百μM到几十mM测量Kb范围102-1012 M-1滴定实验前恒温30-60 min等温滴定量热实验所需时间，一般1.5-4 hrSample Preparation Guidelines (ITC).Proper sample preparation is essential for successful ITC testing. In particular, the minimal guidelines below must be strictly followed to insure an accurate estimate of stoichiometry (n), heat of binding (H), and binding constant (Kb) (or dissociation constant Kd = 1/Kb).1.) The macromolecule solution (the sample to be placed in the reaction cell) must have a volume of at least2.1 ml. The lowest concentration which can be studied is 3 M and this is adequate only for tight binding where Kd is smaller than 1 M. For weaker interactions, the macromolecule concentration should be 5 times Kd, or higher if possible. Preferably, the macromolecule solution should be dialyzed exhaustively against buffer for final equilibration.2.) The ligand solution (the sample to be placed in the injection syringe) must have a volume of at least 0.7 ml. Its concentration should be at least 10 times higher than the concentration of macromolecule (if the macromolecule has multiple binding sites for ligand, then the ligand concentration must be increased accordingly). The buffer solution in which the ligand is dissolved should be exactly the same buffer against which the macromolecule has been equilibrated.3.) After both solutions have been prepared, the pH of each should be checked carefully. If they are different by more that 0.05 pH units, then one of the solutions must be back-titrated so they are within the limit of 0.05 pH units. If any particles are visible in either solution, they should be filtered out.4.) If possible, the concentrations of both solutions should be accurately determined after final preparation. Accurate determination of binding parameters is only possible if concentrations of binding components are known precisely.5.) At least 20 ml of buffer must be sent along with the two samples, since this is used for rinsing the cell and for dilution if necessary.6.) If possible, DTT should be avoided as a disulfide reagent and replaced by -mercaptoethanol or TCEP.等温滴定微量热仪（ITC）基本介绍等温滴定微量热仪（ITC）基本介绍（美国MicroCal ，美国微量热公司）仪器设备名称：等温滴定微量热仪制造国别：美国制造厂商：美国微量热公司规格型号：VP-ITC品牌：MicroCal总代理商：华嘉（香港）有限公司技术指标：短期噪音水平：0.5纳卡/秒(2 纳瓦)。
等温滴定量热仪(ITC)
无需标记、无需检测方法开发，快速获得结果
ITC 是基于复合物形成时所放出或吸收的热量的精确测定，它是在一个实验中能够同时测量所有结 合参数的先进技术。它测量在天然状态下结合伴侣的亲和力，无需使用荧光标签修饰组分或使样品 固定化。 总而言之，ITC 是与众不同的。
Isothermal Titration Calorimetry (ITC) 应用研究领域目录
B
A
0 -2
ऐ ( ∆H)
10 5 փ૧ ∆G ∆H -T ∆S ᆶ૧
kcal/mole ጀ
-6 -8 -10 -12 -14 0 1 ఊܻԲ ࣅბऺଉბ (n) 2 ൕࢅ૰ (K D)
kcal/mole
-4
0 -5 -10 -Байду номын сангаас5 -20
A. ITC 测量热力学性质包括：相互作用的化学计量学（n）、亲和力常数（KD）、焓变化（∆H）、熵变化（∆S）。 B. 利用三个具有相同结合能 （∆G） 的相互作用解释热力学特征。 结合亲和力是结合焓 ( ∆H) 和结合熵 ( ∆S) 的共同作用的结果。 结合焓反映了由于氢键形成和范德华力产生的相互作用强度。结合熵是复合物形成时来自去溶剂化和构象变化的熵变化 的组合。
* 具体应用参考文献查阅可登陆
4
技术优势及应用实例 ：
将药物的先导化合物的优化 带到一个新的水平
更深刻的见解
药物应该以高亲和力和选择性结合目标。传统上，先导化合物的优化一直被剖析亲和力组成的研究 所推动。然而，热力学变量 ( ∆H, ∆S) 也是结合的基础，它们能够提供有关相互作用的更深刻的见解。 MicroCal ™量热仪具有足够的灵敏度和通量用于有效测定先导化合物优化所需的所有结合参数，以 指导先导化合物的优化。
itc 蛋白互作
itc 蛋白互作摘要：1.蛋白质互作的背景和意义2.ITC 技术的原理和应用3.ITC 在蛋白质互作研究中的优势和局限性4.ITC 在蛋白质互作研究中的案例分析5.总结和展望正文：1.蛋白质互作的背景和意义蛋白质是生物体中最重要的分子之一，它们在细胞中承担着各种生物学功能。
蛋白质的功能通常是通过与其他蛋白质相互作用来实现的。
蛋白质互作在生物体的信号传导、基因调控、细胞周期调控等过程中起着关键作用。
因此，研究蛋白质互作对于理解生命过程的本质具有重要意义。
2.ITC 技术的原理和应用等温滴定量热法（Isothermal Titration Calorimetry，ITC）是一种用于测量生物分子间相互作用的热力学参数的技术。
ITC 的基本原理是在等温条件下，通过向一个含有待测生物分子的溶液中滴加另一种生物分子，测量溶液的热效应，从而获得两者之间相互作用的热力学参数，如结合常数、解离常数等。
ITC 技术广泛应用于生物分子间的相互作用研究，包括蛋白质互作、核酸互作、抗体- 抗原互作等。
3.ITC 在蛋白质互作研究中的优势和局限性ITC 技术在蛋白质互作研究中具有许多优势。
首先，ITC 可以在较短时间内获得蛋白质互作的热力学参数，具有较高的实验效率。
其次，ITC 可以检测到蛋白质互作的结合位点，有助于揭示蛋白质互作的结构基础。
此外，ITC 还可以研究蛋白质互作的动力学过程，为揭示蛋白质互作的动态特性提供信息。
然而，ITC 技术也存在一定的局限性。
例如，ITC 实验需要严格控制实验条件，对实验操作技巧要求较高；此外，ITC 实验结果可能受到其他因素的干扰，如蛋白质的稳定性、浓度等。
4.ITC 在蛋白质互作研究中的案例分析以蛋白质A 和蛋白质B 之间的相互作用为例，首先将蛋白质A 固定在ITC 实验装置中，然后将蛋白质B 溶液滴加到蛋白质A 溶液中，测量溶液的热效应。
通过分析实验数据，可以获得蛋白质A 和蛋白质B 之间的结合常数、解离常数等热力学参数。
等温滴定量热仪(iTC) 原理及操作
谢 谢！
滴定量热法早在1965年由 Christensen和Izatt提出。 该方法最初是用于弱酸-碱和 金属鳌合反应。
1978年，Beaudette和 Langerman首先将微量热法 技术用于生物体系。
等温滴定量热法原理
滴定针
参比池
样品池
等温滴定量热法原理
等温滴定量热法原理
等温滴定量热法原理
微量热法特点
生物技术导论配套实验第六讲之
等温滴定量热仪(iTC) 原理及操作
Łukasz Jaremko et al. Science 2014;343:1363-1366
▪ 等温滴定量热法 (iTC) 测量任何两个生物大分子间的结合亲和力和 热力学参数。
▪ 结合常数 (KD) ▪ 相互作用化学计量 (n) ▪ 焓 (ΔH) ▪ 熵 (ΔS)
1. 直接测量毫摩到纳摩级亲和力 (KDS)（10~2 至 10-9 M） 2. 适用范围广，轻松处理浑浊溶液 3. 非特异性强 4. 真正的溶液内技术 5. 无需标签或固定化，易于操作 6. 样品用量小,方法灵敏度高
研究方向
化学
生物化学与分子生物学
工程学
计算机科学
700
600
500
400
300
200
等温滴定量热法(ITC)
等温滴定量热技术摘要：生物大分子可以和很多配体特异性结合，当物质结合时，热量要么产生，要么吸收。
生物大分子与配体相互作用的定量描述需要确定反应过程中热力学参数的变化。
相互作用过程中产生的热量变化可以用量热计定量监测。
等温滴定量热技术（Isothermal Titration Calorimetry, ITC）是一种监测由结合成分的添加而起始的任何化学反应的热力学技术，它已经成为鉴定生物分子间相互作用的首选方法。
它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息，如结合常数（Ka）、结合位点数（n），结合焓（△H）、熵（△S）、恒压热容（△Cp）和动力学数据（如酶促反应的Km和kcat ）。
这些信息提供了生物分子相互作用的真实写照。
由于几乎所有的生化反应过程都有热量变化，所以ITC具有很广泛的应用，它可以应用于蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质折叠/去折叠、蛋白质-小分子相互作用、酶-抑制剂相互作用、酶促反应动力学、药物-DNA/RNA相互作用、RNA折叠、蛋白质-核酸相互作用、核酸-小分子相互作用、核酸-核酸相互作用、生物分子-细胞相互作用等方面。
关键字：等温滴定量热技术、相互作用、热力学商业化的测量生物分子相互作用热量的灵敏的量热计出现在上世纪80年代后期[1]。
从此这种技术被广泛应用。
在过去的20年中，等温滴定量热技术（ITC）成为研究相互作用的常用方法。
随着现代ITC仪器的发展，ITC更加灵敏、快速、易用。
分子识别是一个复杂的过程，是生命活动的基础。
生物分子识别过程需要结合反应的热力学参数来阐明。
等温滴定微量量热法可以直接定量检测滴定反应过程中的热量变化，确定反应的结合常数K B 、结合计量比（n）、反应焓变（∆H）、熵变（∆S）、恒压热容（△Cp）和动力学数据（如酶促反应的Km和kcat ）等热力学参数，用来表征生物分子间的相互作用。
itc测定结合能力的原理
itc测定结合能力的原理ITC（Isothermal Titration Calorimetry）是一种分析技术，可以测定分子之间的互动能力，进而了解它们之间的相互作用，包括结合能力、配位能力等。
其中测定结合能力的原理是，通过观测热效应来观察溶液中两种分子（一般为蛋白质和小分子）之间的结合。
本文将详细解析ITC测定结合能力的原理，并从仪器原理、实验设计、实验分析和数据处理四个方面进行阐述。
I. 仪器原理ITC仪器主要由微量注射器、等温容量计和热源组成。
注射器用于向等温容量计内部装载样品，将溶液注入反应池中。
反应池的温度通过一个恒温控制器进行控制。
ITC容量计是一个热流动计，通过测量容器壁和样品温度差异来测量样品热量变化。
当两个溶液混合时，如果存在化学反应或物理相互作用，则引起热量变化，通过测量这个热量变化，可以解析出反应热、反应离子大小等信息。
II. 实验设计ITC测定需要先准备好样品和试剂，分别装入微量注射器和等容器中。
实验时，首先将等容器与稳定溶剂相对比，记录稳定溶剂对等容器的热量变化曲线。
接下来，则向等容器中加入样品，每次以微量添加另一种溶液。
每次注射一定数量的样品，等待反应平衡，再次追加反应试剂，直到最后获得反应峰。
III. 实验分析在实验分析时，需要搜集等温容量计实验的热量曲线以及注射的样品数量。
样品注入后，热量变化最初是很大的，在反应继续的过程中，热量的变化率会逐渐减慢。
如果实验结果呈现强烈峰值或峰形，则证明试剂之间可能存在结合反应。
反应的重点在于热量变化，这个变化与添加的样品数量有关，因此，可以通过对热量曲线的分析来了解反应是否发生。
IV. 数据处理ITC数据处理主要是根据两个试剂的滴定和浓度值计算结合常数以及热焓变化值。
结合常数与热焓变化值可以为分析分子间相互作用的力学性质提供重要的信息。
总之，ITC测定结合能力是现代研究蛋白质与化合物相互作用的重要技术，可以为理解分子之间相互作用、药物设计以及生物结构研究提供基础数据。
生物物理化学实验报告——ITC
结构化学实验报告等温滴定量热法测定两种蛋白质间相互作用2012/5/5实验目的：了解MicroCal iTC200等温滴定量热仪在测量蛋白质相互作用中的应用，了解仪器基本工作原理，学习蛋白质相互作用的测定步骤和仪器操作，简要分析实验结果。
实验原理：在研究两种或两种以上的蛋白质的功能时，相关蛋白质之间常常存在相互作用（常常是氢键或范德华力），如果两蛋白可以彼此结合，则结合的过程中会放出一定的热量。
所以，通过测定蛋白质相互作用时放出热量的大小，可以得到蛋白相互作用时的结合常数K D、化学计量比N和焓变ΔH，从而由热力学公式ΔG = RT lnK D和ΔG = ΔH -TΔS可以进一步得到反应的自由能变化。
MicroCal iTC200等温滴定量热仪的基本原理就是实现了蛋白质之间的微量滴定操作和微小热量的精密测量。
通过滴定操作和热量的测量，量热仪可以给出热量-摩尔比曲线：图像中曲线的突跃中点对应的化学计量比就是两种蛋白质相互作用的化学计量数N ，突跃中点处曲线的斜率就是两种蛋白相互作用的结合常数K D 。
决定曲线形状的主要参数是C 值：C = 滴定池中的蛋白浓度/ KD = [M]tot/ KD × NC 值越大，曲线越陡；C 值越小，曲线越平缓，没有明显的突跃。
一般C 值在10-100之间实验效果最好。
实验材料：蛋白质tse1（17KD）蛋白质tsi1（16KD）实验步骤：1.使用紫外分光光度计在280nm检测波长下测定蛋白质溶液中蛋白质的浓度，根据所需要的蛋白质浓度比稀释蛋白质溶液。
2.在量热仪的注射器和样品池中分别加入两种不同的蛋白质样品。
⑴注射器加样①将装有约100微升样品的PCR管放入样品试管槽。
②注射器移到“Rest Position”；然后左手转动注射器上端，使注射器的连接孔对准支架上的孔。
右手将白色细管顶部的连接头水平对准注射器连接孔，先轻轻将乳白色连接头旋入连接孔，随后将乳白色连接头后的金属连接头轻轻拧紧即可。
等温滴定量热仪的那些优势 量热仪如何操作
等温滴定量热仪的那些优势量热仪如何操作等温滴定量热法（Isothermal Titration Calorimetry, ITC）是近年来进展起来的一种讨论生物热力学与生物动力学的紧要方法等温滴定量热法（Isothermal Titration Calorimetry, ITC）是近年来进展起来的一种讨论生物热力学与生物动力学的紧要方法；它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、精准地监测和记录一个变化过程的量热曲线；原位、在线和无损伤地同时供应热力学和动力学信息。
微量热法具有很多独特之处。
它对被讨论体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件；即具有非特异性的独特优势，样品用量小，方法灵敏度和精准明确度高（本仪器最小可检测热功率 2 nW，最小可检测热效应0.125uJ；生物样品最小用量0.4ug，温度范围2 ℃ —80 ℃，滴定池体积（1.43 ml）。
试验时间较短（典型的ITC试验只需30—60分钟，并加上几分钟的响应时间），操作简单（整个试验由计算机掌控；使用者只需输入试验的参数，如温度、注射次数、注射量等，计算机就可以完成整个试验，再由Origin软件分析ITC得到的数据）。
测量时不需要制成透亮清亮的溶液, 而且量热试验完毕的样品未遭破坏，还可以进行后续生化分析。
尽管微量热法缺乏特异性但由于生物体系本身具有特异性，因此这种非特异性方法有时可以得到用特异方法得不到的结果；这有助于发觉新现象和新规律，特别适应于讨论生物体系中的各种特异过程。
等温滴定量热仪具备了新奇的ITC技术及好的应用弹性，极适合于分子间交互作用之热力学驱动力的表征。
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相关热词：等离子清洗机,反应釜,旋转蒸发仪,高精度温湿度计,露点仪,高效液相色谱仪价格,霉菌试验箱,跌落试验台,离子色谱仪价格,噪声计,高压灭菌器,集菌仪,接地电阻测试仪型号,柱温箱,旋涡混合仪,电热套,场强仪万能材料试验机价格,洗瓶机,匀浆机,耐候试验箱,熔融指数仪,透射电子显微镜。
等温滴定量热法对镇痛药与止吐药术后联合应用的相互作用研究
等温滴定量热法对镇痛药与止吐药术后联合应用的相互作用研究龚丽娜;李天佐【摘要】目的:采用等温滴定量热法探讨镇痛药与止吐药术后联合应用的相互作用,并明确可否同一装置给药.方法:根据临床用药习惯把试验样品分成四组,采用等温滴定量热法观察临床常用的术后镇痛药舒芬太尼、曲马多、羟考酮、氟比洛芬酯、右美托咪定及止吐药昂丹司琼的相容性.模拟手术室温度为25℃,测定各药物的热力学参数吉布斯自由能ΔG和结合常数焓变ΔH和熵变ΔS,得到相应的反应活性图谱,通过比较|ΔH|与T|ΔS|,结合数据绘图定性分析来判断溶合反应类型.结果:四组试验样品两两溶合过程中均为|ΔH|<T|ΔS|,反应活性谱热量变化(<0.05μJ)为熵驱动反应,未发生质变.结论:舒芬太尼、曲马多、羟考酮、氟比洛芬酯、右美托咪定及昂丹司琼结合未发生化学反应,临床上的联合应用是安全可靠的,可在同一给药装置配泵给药.【期刊名称】《中国医院用药评价与分析》【年(卷),期】2019(019)004【总页数】7页(P393-398,402)【关键词】术后镇痛药;同一装置给药;相容性;等温滴定量热法【作者】龚丽娜;李天佐【作者单位】首都医科大学附属世纪坛医院麻醉科,北京 100089;首都医科大学附属世纪坛医院麻醉科,北京 100089【正文语种】中文【中图分类】R969.2随着外科手术量的逐年增长、快速康复外科理念的影响及人们对术后舒适度的要求不断提高，术后镇痛泵的应用越来越多，应用的药物种类也在增加，多模式镇痛和联合用药已成为趋势[1-2]。
目前主要使用阿片类药物[3]、非甾体药及止吐药等。
理论上，根据不同药物的作用靶点不同的机制可使镇痛更加完善，减少各药物的不良反应[4]。
但临床实际应用中，各药物之间是否发生成分的改变尚不清楚，特别是术后镇痛泵中经常加入4种甚至更多药物在同一装置给药。
联合用药在具有优势的同时[5-7],也存在着风险和危害[8-9]。
MicroCal等温滴定量热仪
MicroCal 等温滴定量热仪MicroCal iTC200 / Auto-iTC200Imagination at Work等温滴定量热Isothermal Titration Calorimetry等温滴定量热（ITC）是一种直接测量生物分子结合过程中的放热或者吸热的技术。
通过对热量的测定可以精确的得到结合常数（K B），反应的化学计量数（n），熵（ΔS）和焓（ΔH），在单次实验中即可提供一整套有关分子相互作用的完整信息。
ITC是表征生物分子相互作用的经典方法之一。
ITC的应用范围包括：小分子、蛋白、抗体、核酸、脂类及其他生物分子之间的相互作用特征鉴定；酶动力学；分析因分子结构改变导致的结合变化等。
在全球，MicroCal 仪器被普遍应用于制药厂商、生物技术公司以及众多大学、科研院所和政府机构。
工作原理ITC可主要分为两个部分，上部是控制滴定的注射系统，下部是样品池和量热系统。
注射器装载实验检测用的“配体”溶液，样品池中含有待检测的另一种“大分子”样品。
实验时，在恒定的温度下，配体溶液以设定的体积和次数逐滴进入样品池中。
两者发生相互作用时释放或吸收的热量和两者结合的数量之间存在间接比例关系。
通过灵敏的热量检测系统和功率反馈补偿机制，便可准确的检测到反应过程中极其微小的的热量变化，并以实时的数据曲线形式输出。
当样品池中的大分子逐渐被滴入的配体所饱和时，相互作用产生的热量信号会逐渐减小，直到最后仅能检测到配体滴入时产生的背景稀释热量。
输出的曲线经过软件分析，便可得到全面完整的热动力学数据。
图1.典型ITC数据图：上半部分表示每次注射采集的数据。
下半部分表示每次注射的释放的热量（上图中每个峰的面积积分）对滴定样品与样品池中样品的摩尔比作图图2.ITC功率反馈补偿机制iTC200TM等温滴定量热仪仅需200l样品即可获得完美数据对于测量生物分子间的相互作用，等温滴定量热（ITC）技术可谓是一项经典方法。
等温滴定量热仪 分子间相互作用
等温滴定量热仪分子间相互作用等温滴定量热仪啊，这可真是个神奇的东西，专门用来研究分子间那点“剪不断理还乱”的相互作用。
我第一次接触这玩意儿的时候，感觉就像打开了新世界的大门，以前只知道分子们在微观世界里忙忙碌碌，却从没想过它们之间那些微妙的“交流”还能被如此精确地测量和分析。
说起这等温滴定量热仪，它其实就像是微观世界的“温度计”和“秤”的结合体。
想象一下，把两种分子溶液放在一起，就像两个陌生人初次见面，它们会相互试探、接触，有时候还会“握手言和”，也就是发生相互作用。
而这个过程中释放或吸收的热量，就是它们“交流”的“语言”。
等温滴定量热仪就是负责捕捉和解读这些“语言”的高手。
它工作的时候，特别像一个细心的科学家，一丝不苟地记录着每一次“握手”带来的热量变化。
这可不是件容易的事儿，因为分子间的相互作用往往非常微弱，就像微风拂过水面，只留下一圈圈几乎看不见的涟漪。
但等温滴定量热仪却能通过精密的传感器和复杂的算法，把这些微小的变化放大、量化，变成我们可以理解和分析的数据。
记得有一次，我在实验室里用这台仪器研究两种蛋白质的相互作用。
这两种蛋白质就像是两个性格迥异的伙伴，一个热情奔放，一个沉稳内敛。
把它们放在一起，就像是在看一场无声的戏剧，不知道它们会如何“对话”。
随着滴定的进行，仪器上的数据开始跳动，就像是在诉说着它们之间的故事。
我看到热量曲线在缓缓上升，然后又突然下降，就像是它们之间经历了一场激烈的争论，然后又握手言和。
那一刻，我仿佛能感受到分子间的“情绪”和“情感”，这种感觉真是太奇妙了。
当然，等温滴定量热仪不仅仅是个“情感分析师”，它还是个“实验设计师”。
通过调整实验条件，比如温度、pH值、离子强度等等，我们可以像导演一样，设计出一场场精彩的“分子戏剧”。
每一次实验都是一次新的尝试，每一次数据的变化都像是给我们带来了新的启示。
它让我们更加深入地理解了分子间的相互作用，也让我们对生命现象有了更加本质的认识。
等温滴定量热技术检测蛋白质间相互作用方法的优化
等温滴定量热技术检测蛋白质间相互作用方法的优化贾继阳;徐奭;申兰兰;张耀川;张海娇;白素兰【摘要】利用等温滴定量热技术(ITC)检测拟南芥中控制根毛发生的关键蛋白CAPRICE(CPC)和GLABRA3(GL3)的相互作用.通过原核表达、纯化两种蛋白质并进行不同方式的透析及浓缩,利用ITC检测两种蛋白质的相互作用.实验显示对分子量相对较小的CPC蛋白宜采用缓和的透析方式,而对分子量相对较大的GL3蛋白可通过磁力搅拌等方法加快透析的速度以防止短时间透析不彻底.ITC热动力学结果表明这两个蛋白质存在两个结合位点并很可能是以顺序结合的方式相互作用.第1个结合位点两个蛋白质相互作用的亲和力高于第2个结合位点.【期刊名称】《首都师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2019(040)003【总页数】6页(P38-43)【关键词】等温滴定量热技术;原核表达蛋白;分离纯化;相互作用【作者】贾继阳;徐奭;申兰兰;张耀川;张海娇;白素兰【作者单位】首都师范大学生命科学学院,北京 100048;首都师范大学生命科学学院,北京 100048;首都师范大学生命科学学院,北京 100048;北京农业职业学院园艺系,北京 102442;北京农业职业学院园艺系,北京 102442;首都师范大学生命科学学院,北京 100048【正文语种】中文【中图分类】Q942.60 引言等温滴定量热技术(ITC)是通过检测分子相互作用所释放或吸收的能量，通过单次滴定实验即可提供完整的热动力学信息，直接提供结合常数，化学计量比及反应焓变，揭示蛋白质分子间特异性相互作用[1]．ITC技术的特点是需要的样品量非常小且无需任何化学修饰或标记，其能够检测的亲和力范围从100 μmol/L到1 nmol/L[2]．高质量的ITC数据需要经过样品制备，滴定实验，数据分析及实验优化几个步骤才可能获得．几乎所有蛋白质类型的样品和几乎所有的缓冲液体系均可用于ITC实验，但是滴定物的稀释热量或对照热量及滴定物与被滴定物的缓冲液体系是否匹配对ITC实验的成功与否起到至关重要的作用．当滴定物被滴定到样品池中的缓冲液中混匀后，就会产生结合热之外的其他热量，称为稀释热量或对照热量．一个ITC实验成功的关键就是要尽量减小对照热量，使得结合热量能够被测定得更加准确．如果对照热量非常小且恒定，先用滴定样品的数据扣除平均对照热量，之后就可以进行曲线拟合以获得结合参数．造成对照热过大有两个主要原因，一个是滴定物与样品池中的大分子样品缓冲液不匹配；另一个是过高的滴定物浓度．最常见的缓冲液不匹配是由滴定物和大分子溶液pH值的差异造成的．对于不匹配的滴定物与被滴定物，样品制备的关键就是通过透析或凝胶过滤进行缓冲液置换，以确保滴定物和被滴定物的溶液完全匹配才能保证稀释热完全合格[3]．拟南芥中控制根毛发生的关键蛋白包括CAPRICE(CPC)和GLABRA3(GL3)，当CPC与GL3互作形成蛋白质复合体时，抑制下游基因GLABRA2(GL2)表达，促进表皮细胞发育为根毛细胞[4]．虽然已经有酵母双杂交结果证明CPC蛋白和GL3蛋白会发生相互作用[5]，但是与其它检测体外蛋白相互作用的实验方法一样也存在着假阳性结果的可能．等温滴定量热技术灵敏度高，适用范围广，测定结果更加精确可靠，目前已被作为测量分子之间相互作用的“黄金标准”[6]．本研究通过大肠杆菌原核表达、分离纯化，得到了溶解在咪唑缓冲液中的蛋白质样品CPC和溶解在还原型谷胱甘肽缓冲液中的蛋白质样品GL3，在进行ITC滴定之前进行磷酸缓冲液置换使得滴定物与被滴定物缓冲液匹配，获得了准确的蛋白质相互作用实验结果．为今后利用等温滴定量热仪研究蛋白相互作用提供了理论依据．1 实验材料和方法1.1 实验材料及仪器透析膜(型号 66012，美国赛默飞世尔科技公司)，台式全温振荡器(THZ-C-1，苏州培英实验设备有限公司)，多用途高速冷冻离心机(1580R，中国香港基因有限公司)，高速冷冻离心机(CR22G Ⅲ，日本日立集团)，超声波细胞粉碎机(JY92-2D，宁波新芝生物科技股份有限公司)，紫外/可见光分光光度计(Ultrospec 3100pro，美国GE公司)，马尔文微量热等温滴定量热仪(MicroCal iTC200，英国马尔文仪器有限公司)．1.2 原核蛋白表达和纯化CPC蛋白的表达和纯化：将含有CPC-His融合蛋白的大肠杆菌(pET-28a载体BL21感受态，北京全式金生物技术有限公司)培养在含有50 g/mL 卡那霉素的Luria-Bertani(LB)培养基中，置于37℃，200 转/min，摇床中孵育，培养至光密度(OD)值为一定值时，即OD600 nm=0.6～0.8时，加入1 mmol/L 的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，37℃诱导 5 h．将菌液离心，破碎后与Ni-NTA混合于4℃结合4 h，将混合液倒入重力柱中，先用低浓度50 mmol/L咪唑溶液洗去非特异性结合的蛋白，后用高浓度300 mmol/L 咪唑溶液洗脱并收集目标蛋白．GL3蛋白的获取方法：将含有GL3-GST融合蛋白的大肠杆菌培养在含有50 g/mL 氨苄抗生素的LB培养基中，置于37℃，200 转/min的摇床中培养至OD600 nm=0.6～0.8时，加入1 mmol/L的IPTG，换至16℃诱导10 h．将菌液离心，破碎后与谷胱甘肽琼脂糖珠子混合于4℃结合4 h，将混合液倒入重力柱中，先用2 mmol/L还原性谷胱甘肽溶液洗去非特异性结合的蛋白，然后用10 mmol/L 还原性谷胱甘肽溶液洗脱并收集目标蛋白．1.3 蛋白质透析利用透析袋对两种不同的蛋白质进行透析来置换成相同浓度的磷酸缓冲液(PBS)体系．将纯化得到的CPC-His和GL3-GST分别放于截留分子量为 5 000和20 000的透析袋中，将透析袋分别放于相同浓度的PBS缓冲液(pH 7.4)中，在4℃进行静置透析10 h．1.4 蛋白质浓缩将装有透析样品的透析袋放于4℃，把PEG 20 000均匀铺洒在透析袋上进行蛋白质浓缩．1.5 等温滴定实验将未透析或透析后的样品放在等温滴定量热仪iTC200的滴定针中，将缓冲液放于样品池中，温度设定为25℃．除第1滴溶液的滴定体积为0.4 μL，其余19滴分别为每150 sec滴定2 μL体积．1.6 数据处理数据以表示．采用Origin 7软件进行数据分析．2 实验结果2.1 仪器稳定性测量使用超纯水滴定超纯水进行仪器性能稳定性测试，参考功率设定为5 μW，仪器稳定性结果如图1所示．基线漂移从5.06～5.11 μW，符合(5.0±0.5)μW的要求．最大幅度为第12滴，约0.05 μW，小于0.05～0.06μW的要求．实验结果显示，每一滴水滴清晰，滴定质量好，样品池清洁，仪器性能好，可以进行后续实验．图1 水滴水实验结果2.2 CPC蛋白质样品透析优化为了确定样品溶液对蛋白质相互作用是否有影响，分别对未透析样品和透析样品进行滴定过程释放热量进行测量．透析样品前处理过程是将CPC蛋白样品在PBS缓冲液中进行透析．磁力搅拌虽会增加透析速度减少透析时间，但是也会造成CPC 蛋白发生沉淀．由于ITC技术只适用于检测液体样本，沉淀样本无法利用ITC进行检测，因此，本研究透析过程采用静置透析．用未透析 CPC蛋白溶液滴定PBS缓冲液，滴定过程释放的热量值如图2所示．实验结果显示，滴定过程首先发生的是一个明显的放热反应，最大幅度为第2滴，为22.5 μW，远远大于0.2 μW稀释热的合格标准(对应的积分面积为-335.4μW.sec)．之后在第8、9滴反应趋于饱和，继而转化为一个幅度基本相同的吸热反应，幅度约为1.25 μW，>0.2 μW稀释热的合格标准，直到第20滴(对应的积分面积为14.48 μW.sec)．图2 未透析CPC蛋白质样品滴定反应热量释放未透析CPC蛋白质样品滴定摩尔ΔH如图3所示，结果显示滴定针中的蛋白质样品和样品池中的缓冲液发生了明显的相互作用，造成过高的对照热量(稀释热)，这是由于滴定针中的蛋白质样品溶解在咪唑溶液中，与样品池中的PBS缓冲液不匹配造成的．图3 未透析CPC蛋白质样品滴定摩尔焓变透析后CPC蛋白质样品滴定PBS缓冲液，透析后CPC蛋白质样品滴定反应热量释放如图4所示．最大幅度为第3滴，约0.11 μW；第19滴幅度最小，约为0.05 μW，<0.2 μW稀释热的标准，且全部20滴的双向正负峰一致．图4 透析后CPC蛋白质样品滴定反应热量释放透析后CPC蛋白质样品滴定摩尔ΔH如图5所示，结果显示绝对热量变化很低．因此，透析样品能够提高ITC测定结果的可靠性．图5 透析后CPC蛋白质样品滴定摩尔焓变2.3 GL3蛋白质透析前后滴定PBS缓冲液用未透析GL3蛋白质溶液滴定PBS缓冲液，滴定过程释放的热量值如图6所示．实验结果显示，滴定过程发生的是一个明显的放热反应，最大幅度为第2滴，为35 μW，远远大于0.2 μW稀释热的合格标准(对应的积分面积为-539.5μW.sec)，反应在最后几滴(18～20)趋于饱和(第20滴对应的峰面积为-10.2μW.sec)．和放热反应同时存在的是一个较小的吸热反应，反应最大幅度在第2滴，为1.25 μW，>0.2 μW稀释热的合格标准，在第9滴反应趋于饱和．图6 未透析GL3蛋白质样品滴定反应热量释放未透析GL3蛋白质样品滴定摩尔ΔH如图7所示，结果均表明滴定针中的蛋白质样品和样品池中的缓冲液发生了明显的相互作用，造成过高的对照热量(稀释热)，这是由于滴定针中的蛋白质样品与样品池中的PBS缓冲液不匹配造成的．图7 未透析GL3蛋白质样品滴定摩尔焓变然后采用CPC蛋白质透析成功的方法对GL3蛋白质进行透析．不使用磁力搅拌器，使透析缓和，防止过度透析产生沉淀；使静置时间延长从而延缓整个透析时间．这样透析后的GL3蛋白质样品很均一，未发生沉淀，其滴定PBS缓冲液相关热量释放结果如图8所示．实验结果显示，滴定过程发生的是一个放热反应，最大幅度第3滴为2.05 μW，>0.2 μW 稀释热的合格标准，第20滴幅度最小，为1.0μW．虽然较未透析的GL3蛋白质稀释热有非常明显的改善，反应最终也未达到饱和，说明透析产生一定的效果，但原始滴定曲线仍体现出滴定针中的蛋白质样品和样品池中的缓冲液有一定的相互作用的趋势，整个反应高于稀释热的标准，说明此种适用于类CPC蛋白质透析的方法并不适用于GL3蛋白质．这是由于透析不彻底导致的．图8 透析中GL3蛋白质样品滴定反应热量释放为了获得可靠的滴定结果，本研究改变了对GL3蛋白质透析方法．在GL3蛋白质透析过程中使用磁力搅拌器进行透析，透析过程中未发生沉淀现象，获得了均一稳定的GL3蛋白质．透析后GL3蛋白质样品滴定PBS缓冲液，相关热量释放结果如图9 所示．最大幅度为第二滴，<0.05 μW，接近水滴水，<0.2 μW 稀释热的标准．此结果说明透析完全合格，此种透析方式适用于GL3蛋白质．图9 透析后GL3蛋白质样品滴定反应热量释放图2.4 透析后CPC与GL3蛋白质相互作用测量使用透析后浓度为68 μmol/L的GL3蛋白质溶液滴定浓度为22 μmol/L的CPC蛋白质溶液．该滴定反应以放热成分为主，由于释放热量仅为微瓦(μW)级别，不会造成蛋白质样品变性．点对点扣减背景数据后，采用顺序结合模型进行拟合．当结合位点数为2时，拟合曲线及结果合理．由热动力学结果可知，在PBS缓冲液中，透析后的GL3和CPC这两个蛋白质至少存在两个结合位点并很可能是以顺序结合的方式相互作用．第1个和第2个结合位点的解离平衡常数Kd分别为(3.2±0.2)和(16.7±0.9)μmol/L，由此可以初步判断：在第1个结合位点两个蛋白质相互作用的亲和力高于第2个结合位点．由等温滴定量热技术所测定出的ΔH及ΔS的绝对数值不一定准确，但其正负符号是准确的．从ΔH和ΔS的结果来看，二者都是由焓驱动的过程(ΔH<0)，都发生了不利的熵的补偿效应(ΔS<0)．具体来看，第1个和第2个结合位点的ΔH分别为(-160.3±1.1)和(-566.3±18.2)kcal/mol，ΔH<0表明在两个蛋白质之间可能形成了氢键、离子键、范德华力等非共价键，这些因素都是有利于GL3和CPC这两个蛋白质结合的．第1个和第2个结合位点的-TΔS分别为152.7和560.5 kcal/mol，其中T为开尔文温度(T=273.15+反应温度，此处ITC实验反应温度为25℃)．-TΔS>0,由此可知ΔS<0，这表明在两个蛋白结合过程中，某个蛋白质很有可能还发生了构像变化，这会使得分子的自由度下降，是不利于GL3和CPC两个蛋白质结合的因素．由以上测定结果初步判断GL3和CPC蛋白有两个结合位点．该结果与已发表的研究结果相比更加精确，已有研究只是报道CPC蛋白和GL3蛋白间有相互作用，而没有报道有几个相互作用位点．3 讨论ITC是研究分子间相互作用的一种可靠方法[7]．ITC研究一个经典的应用就是在结构信息已经明确的情况下，研究体现广阔生物学功能的蛋白质和配体相互作用的结构和热动力学之间潜在的关系．这对于理解生物分子相互作用及优化配体结合的亲和力都非常重要．此外，ITC能够提供精确的结合热动力学，因此特别适用于药物设计，能够优化药物及靶点的相互作用，促进发展潜在性新型有效药物用于未来临床应用．对于一个完整的等温滴定量热实验，从样品制备到滴定实验受很多因素的影响，其中缓冲液体系的匹配就是影响因素之一．ITC实验要求滴定物与被滴定物的缓冲液体系必须匹配，包括缓冲液的成分，pH值及盐浓度等．极其微小的pH值，NaCl 盐浓度的差异，会导致极大的背景噪音热信号，即稀释热，从而干扰分子间相互作用的特异性信号．对缓冲液不匹配的两种蛋白质可以通过透析的方式进行缓冲液置换[8]．本研究采用拟南芥中两种不同类型的蛋白质，CPC蛋白和GL3蛋白，进行不同方式的透析，利用ITC分别检测不同处理的样品分子的稀释热，结果表明对不同类型的蛋白质需要采用不同的透析方法才能达到最佳的效果，最大程度地减少噪音．对于小分子量蛋白宜采用缓慢透析的方法透析防止透析过度，而对于分子量比较大的蛋白宜采用快速透析的方法透析防止透析不彻底．通过ITC初步判断GL3和CPC蛋白质有两个相互作用结合位点．已有研究只是报道CPC蛋白和GL3蛋白间有相互作用，而没有报道有几个相互作用位点，该结果与已有的研究结果相比更加精确．ITC是一种可靠的、快速检测蛋白之间相互作用的技术手段．对应用该技术方法的优化为今后检测蛋白质间相互作用提供了坚实的理论依据．参考文献【相关文献】[1] LIANG Y. Applications of isothermal titration calorimetry in protein science[J]. J Biochem Biophys, 2008, 40(7): 565-576.[2] GHAI R, FALCONER R J, COLLINS B M. Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research-survey of the literature from 2010[J]. J Molecular Recognition, 2012, 25(1): 32-52.[3] 周洁, 付强, 玉延华. 等温滴定微量热检测中样品预处理的优化研究[J]. 化学与生物工程, 2013, 30(9): 72-74.[4] WADA T, KURATA T, TOMINAGA R, et al. Role of a positive regulator of root hair development, CAPRICE, in Arabidopsis root epidermal cell differentiation[J]. Development, 2002, 129(23): 5409-5419.[5] TOMINAGA R, IWATA M, OKADA K, et al. Functional analysis of the epidermal-specific MYB genes CAPRICE and WEREWOLF in Arabidopsis[J]. Plant Cell, 2007, 19(7): 2264-2277.[6] REHMAN A A, AHSAN H, KHAN F H. Identification of a new α-2-macroglobulin: multi-spectroscopic and isothermal titration calorimetry study[J]. Int J Biol Macromol, 2016, 83: 366-375.[7] HANSEN L D, FELLINGHAM G W, RUSSELL D J. 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生物物理技术等温微量量热法
ITC系统的性能
第二十九页
MicroCal ITC 产品
第三十页
第三十一页
第三十二页
三. ITC方法的应用
蛋白质-蛋白质相互作用： 抗原-抗体相互作用，分子伴侣-底物相互作用，等等。
蛋白质-小分子相互作用，酶-抑制剂相互作用 蛋白质-核酸相互作用
核酸-核酸相互作用
核酸-小分子相互作用 生物分子-细胞相互作用
第三页
第四页
复杂反应过程：
分子结合反应是吸热或放热过程
整个反应过程能够自发进行的条件是 △G < 0. 当△H < 0时，说明反应由焓驱动； 当–T△S < 0时，说明反应由熵驱动；即 △S>0,整个反应是个熵增的过程。
第五页
第六页
第七页
量热法（Calorimetry）
在程序控温过程中，测量热量随时间的变化关系
(f) bBBP-A – D-biotin sulfone
第四十二页
3. 其它一些应用例子
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蛋白质-蛋白质相互作用
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妥布霉素
蛋白质-配体相互作用 氨基糖苷核苷转移酶
Wright and Serpersu, Biochemistry,44: 11581-11591 (2005).
妥布霉素是一种对革兰氏阴性菌、多种革兰氏阳性菌有作用的氨基糖苷类抗生素
第四十五页
蛋白质-配体相互作用
Cooper A, et al., FEBS Lett. 348:41-45(1994).
SAM---腺苷甲硫氨酸
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蛋白质-受体相互作用
Li J. and Weis R. M. (1996)
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HO
O
O
O
O
N H
N
NH
OH
S
Kd = 0.5 nM ∆H = -5.5 kcal/mol
∆∆H = -4.3 kcal/mol -T∆∆S = 2.2 kcal/mol
Freire, Drug Disc. Today, 13 869 (2008)
酶反应动力学的研究
令人郁闷的公式说明了什么？
1. 相同的KD有着相同的∆G； 2. 相同的∆G却有着不同的∆H与∆S组合。
引发焓变和熵变的主要因素
Enthalpy (-∆H) 焓变
Hydrogen bonds 氢键
Ionic interactions 离子作用
特异性结合
Entropy (+∆S) 熵变
Hydrophobic interactions 疏水作用
抗疟疾新药就这样放弃吗？
Optimize Enthalpy, Minimize Entropy Compensation
O
O
O
O
N H
N
N
H
OH
S
Kd = 16 nM ∆H = -1.2 kcal/mol
HO
O
O
O
O
N H
N
NH
OH
S
Kd = 76 nM ∆H = -6.0 kcal/mol
PlmII Inhibitor Optimization ∆∆H = -4.8 kcal/mol
Conformational freedom 构象自由度
非特异性结合
ITC 技术的应用领域
分子相互作用：
溶液中的几乎所有天然状态分子： 包括蛋白质、核酸、多肽、药物分子、 脂类、金属离子、小分子等等；
工艺过程的开发和控制
酶动力学 药物研发 非生物系统
抗生素抗性的菌种为什么能更好的 消灭抗生素
Tobromycin binding to aminoglycoside nucleotidyltransferase(2”)
典型 ITC 数据
Time (min)
0
10
20
30
40
0
kcal/mole of injectant µcal/sec
-20
-40
0 -2 -4 -6 -8 -10 -12 -14
Data: RNAHHH_NDH
Model: 1Sites
Chi^2 = 2795.38932
N1.02 K5.57E4
研究所
中科院生化细胞所 中科院生物物理所 北京生命科学研究所 诺华制药研发中心……
Thanks!
陈雍硕
E-mail: Yongshuo.chen@ Mobile: 13918729620
Without MgAMPCPP
With MgAMPCPP
KD = 0.64 µM ∆H = -18.2 kcal/mole ∆S = -34 cal/mole/oK
KD = 0.21 µM ∆H = -12.6 kcal/mole ∆S = -12.3 cal/mole/oK
Wright and Serpersu, Biochemistry 44, 11581-11591 (2005)
Kamiya et al., JACS 118,4532-4538
药物结合的热动力学特征
10
5
kcal/mole
0
∆G
-5
∆H
-T∆S
-10
-15
-20
一样的亲合力，不一样的微观世界
MicroCal Application Note: ITC and Drug Design
Unfavorable
酶反应动力学的研究 (不一般的ITC曲线）
Kcat：催化速率常数 KM：米氏常数
酶反应动力学应用
测量PP1-γ磷酸酶水解PNPP
ITC测量PP1-γ磷酸酶水解 PNPP速度的原始数据
PP1-γ磷酸酶水解PNPP的MichaelisMenten曲线
ITC Applications Enzyme Kinetics
HIV蛋白酶抑制剂开发的“成长烦恼”
5000 0
-5000 -10000 -15000 -20000
∆G
∆H
-T∆S
12 YEARS
cal/mol
Indinavir Nelfinavir Saquinavir Ritonavir Amprenavir Lopinavir Atazanavir KNI-577 KNI-272 KNI-764 TMC-126 TMC-114
无与伦比的数据分析软件--Origin 7
多种独特的分析模式 •酶动力学分析模式 •替代模式 •二聚体解离模式 …….
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大学
中国科学技术大学 2台 复旦大学 2台 清华大学 2台 武汉大学 南开大学 中山大学 华中师范大学 浙江工商大学 香港科技大学 香港理工大学……
眪0.00159 眪1.01E3
H-1.359E4
眪29.18
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Molar Ratio
上半部分表示每次注射采集的数据。下半部分表示每次注射的释放的热量 （上图中每个峰的面积积分）对滴定抗原与样品池中抗体的摩尔比作图
ITC 理论基础
∆G = -RT ln KB ∆G = ∆H –T∆S
Favorable
Velazquez-Campoy et al (2003) Current Drug Targets Infectious Disorders, 3 311 Ohtaka et al (2004) Int. J. Biochem. Cell Biol. 36 1787
ITC在小分子药物结构方面的优化
∆T DP
∆T~0
Reference Calibration Heater Sample Calibration Heater Cell Main Heater
Isothermal Titration Calorimetry 实验流程
1) 样品池中加入待测大分子 2) 参照池中加入缓冲液 3) 将待测配体吸入注射器中 4) 注射器置于样品池中 5) 调整温度、搅拌速度和每次注射体积
ITC 产品
VP-ITC 样品池体积 1.4 ml ~4-5 实验/8 小时
iTC200 样品池体积 0.2 ml 10-15 实验 /8 小时 样品消耗是VP-ITC的1/7
Auto-iTC200 ~50 实验/天 384 个样品, 无人化操控 可由ITC200升级 Available Mid 2008
ITC的优点
1. 方法开发简单； 2. 只要反应过程中有热量变化，ITC
即可作为普适的方法； 3. 是一项灵敏的技术-噪音水平
<0.01μcal/sБайду номын сангаасc，利用现在的先进仪 器可以获得很高的信噪比； 4. 无需带荧光或光谱特征的底物参与 反应； 5. 单次实验即可获得数据； 6. 适用于研究多种类型的酶; 7. 可以用于不透明的样品; 8. 所得数据可以与其它方法进行比较； 9. 除了获得热力学数据外还可以获得 动力学数据
∆ S) • 结合位点数 (n)
实验也可以测定有多个结合 位点的样品
kcal mol-1 of injectant
0
-2 ∆H
Kd
-4
N
0
0.5
1.0 1.5 2.0
Molar ratio
等温滴定量热仪(ITC)
噪音 0.5 nanocal/second 温度范围: 2-80oC 样品池体积: 1.3 ml or 0.2 ml
量热池
样品池
对照池
∆T1：样品池温度反馈
神奇的微量热控制—功率补偿
SR
The DP is a measured power differential between the reference and sample cells to maintain a zero temperature between the cells
Typical concentrations •Enzyme 25-100 pM •Substrate 10-100 μM
(2-20 μl per injection; 15-30 injections)
Todd and Gomez, Anal. Biochem. 296, 179-187 (2001)
传统酶分析法的局限性
（连续分析法，不连续分析法，偶合 分析法）
1. 溶剂不透明或有混浊并对光谱检 测有干扰；
2. 天然的、重组的或突变的酶活性 低于分析方法的检测限；
3. 产物或底物没有光谱基团或荧光 基团，或者标记的成本太高或太 耗时；
4. 不连续分析要求多步进行； 5. 不存在直接的偶合反应； 6. 偶合分析不精确； 7. 底物或酶活性不清楚； 8. 蛋白质功能不清楚。
等温滴定量热仪（ITC）在分子相互作用中的应用
陈雍硕
Yongshuo.Chen@
Isothermal Titration Calorimetry 等温滴定量热
ITC: 测定分子相互作用的方法
在一次实验中, ITC 可以测定
• 结合的亲和力常数 (K), • 结合反应中的焓变和熵变 (∆ H,
DNA形成了三螺旋？
DNA triplex formation
A 120 µM solution of 15-mer single stranded DNA was titrated into a 5µM solution of 23-mer double stranded DNA at 25oC in 10 mM Sodium Acetate, pH 4.8 KD = 1.1x10-8 ∆G = -10.8 kcal/mole ∆H = -83.8 kcal/mole ∆S = -24.5 e.u