等温滴定量热仪(ITC)在分子相互作用中的应用

典型 ITC 数据
Time (min)
0
10
20
30
40
0
kcal/mole of injectant µcal/sec
-20
-40
0 -2 -4 -6 -8 -10 -12 -14
Data: RNAHHH_NDH
Model: 1Sites
Chi^2 = 2795.38932
N1.02 K5.57E4
Favorable
Velazquez-Campoy et al (2003) Current Drug Targets Infectious Disorders, 3 311 Ohtaka et al (2004) Int. J. Biochem. Cell Biol. 36 1787
ITC在小分子药物结构方面的优化
等温滴定量热仪（ITC）在分子相互作用中的应用
陈雍硕
Yongshuo.Chen@ge.com
Isothermal Titration Calorimetry 等温滴定量热
ITC: 测定分子相互作用的方法
在一次实验中, ITC 可以测定
• 结合的亲和力常数 (K), • 结合反应中的焓变和熵变 (∆ H,
∆ S) • 结合位点数 (n)
实验也可以测定有多个结合 位点的样品
kcal mol-1 of injectant
0
-2 ∆H
Kd
-4
N
0
0.5
Leabharlann Baidu
1.0 1.5 2.0
Molar ratio
等温滴定量热仪(ITC)
噪音 0.5 nanocal/second 温度范围: 2-80oC 样品池体积: 1.3 ml or 0.2 ml
ITC的优点
1. 方法开发简单； 2. 只要反应过程中有热量变化，ITC
即可作为普适的方法； 3. 是一项灵敏的技术-噪音水平
<0.01μcal/sec，利用现在的先进仪 器可以获得很高的信噪比； 4. 无需带荧光或光谱特征的底物参与 反应； 5. 单次实验即可获得数据； 6. 适用于研究多种类型的酶; 7. 可以用于不透明的样品; 8. 所得数据可以与其它方法进行比较； 9. 除了获得热力学数据外还可以获得 动力学数据
Kamiya et al., JACS 118,4532-4538
药物结合的热动力学特征
10
5
kcal/mole
0
∆G
-5
∆H
-T∆S
-10
-15
-20
一样的亲合力，不一样的微观世界
MicroCal Application Note: ITC and Drug Design
Unfavorable
-T∆∆S = 5.7 kcal/mol
HO
O
O
O
O
N H
N
NH
OH
S
Kd = 0.5 nM ∆H = -5.5 kcal/mol
∆∆H = -4.3 kcal/mol -T∆∆S = 2.2 kcal/mol
Freire, Drug Disc. Today, 13 869 (2008)
酶反应动力学的研究
研究所
中科院生化细胞所 中科院生物物理所 北京生命科学研究所 诺华制药研发中心……
Thanks!
陈雍硕
E-mail: Yongshuo.chen@ge.com Mobile: 13918729620
Without MgAMPCPP
With MgAMPCPP
KD = 0.64 µM ∆H = -18.2 kcal/mole ∆S = -34 cal/mole/oK
KD = 0.21 µM ∆H = -12.6 kcal/mole ∆S = -12.3 cal/mole/oK
Wright and Serpersu, Biochemistry 44, 11581-11591 (2005)
抗疟疾新药就这样放弃吗？
Optimize Enthalpy, Minimize Entropy Compensation
O
O
O
O
N H
N
N
H
OH
S
Kd = 16 nM ∆H = -1.2 kcal/mol
HO
O
O
O
O
N H
N
NH
OH
S
Kd = 76 nM ∆H = -6.0 kcal/mol
PlmII Inhibitor Optimization ∆∆H = -4.8 kcal/mol
Conformational freedom 构象自由度
非特异性结合
ITC 技术的应用领域
分子相互作用：
溶液中的几乎所有天然状态分子： 包括蛋白质、核酸、多肽、药物分子、 脂类、金属离子、小分子等等；
工艺过程的开发和控制
酶动力学 药物研发 非生物系统
抗生素抗性的菌种为什么能更好的 消灭抗生素
Tobromycin binding to aminoglycoside nucleotidyltransferase(2”)
ITC 产品
VP-ITC 样品池体积 1.4 ml ~4-5 实验/8 小时
iTC200 样品池体积 0.2 ml 10-15 实验 /8 小时 样品消耗是VP-ITC的1/7
Auto-iTC200 ~50 实验/天 384 个样品, 无人化操控 可由ITC200升级 Available Mid 2008
DNA形成了三螺旋？
DNA triplex formation
A 120 µM solution of 15-mer single stranded DNA was titrated into a 5µM solution of 23-mer double stranded DNA at 25oC in 10 mM Sodium Acetate, pH 4.8 KD = 1.1x10-8 ∆G = -10.8 kcal/mole ∆H = -83.8 kcal/mole ∆S = -24.5 e.u
眪0.00159 眪1.01E3
H-1.359E4
眪29.18
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Molar Ratio
上半部分表示每次注射采集的数据。下半部分表示每次注射的释放的热量 （上图中每个峰的面积积分）对滴定抗原与样品池中抗体的摩尔比作图
ITC 理论基础
∆G = -RT ln KB ∆G = ∆H –T∆S
量热池
样品池
对照池
∆T1：样品池温度反馈
神奇的微量热控制—功率补偿
SR
The DP is a measured power differential between the reference and sample cells to maintain a zero temperature between the cells
Typical concentrations •Enzyme 25-100 pM •Substrate 10-100 μM
(2-20 μl per injection; 15-30 injections)
Todd and Gomez, Anal. Biochem. 296, 179-187 (2001)
HIV蛋白酶抑制剂开发的“成长烦恼”
5000 0
-5000 -10000 -15000 -20000
∆G
∆H
-T∆S
12 YEARS
cal/mol
Indinavir Nelfinavir Saquinavir Ritonavir Amprenavir Lopinavir Atazanavir KNI-577 KNI-272 KNI-764 TMC-126 TMC-114
酶反应动力学的研究 (不一般的ITC曲线）
Kcat：催化速率常数 KM：米氏常数
酶反应动力学应用
测量PP1-γ磷酸酶水解PNPP
ITC测量PP1-γ磷酸酶水解 PNPP速度的原始数据
PP1-γ磷酸酶水解PNPP的MichaelisMenten曲线
ITC Applications Enzyme Kinetics
无与伦比的数据分析软件--Origin 7
多种独特的分析模式 •酶动力学分析模式 •替代模式 •二聚体解离模式 …….
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大学
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令人郁闷的公式说明了什么？
1. 相同的KD有着相同的∆G； 2. 相同的∆G却有着不同的∆H与∆S组合。
引发焓变和熵变的主要因素
Enthalpy (-∆H) 焓变
Hydrogen bonds 氢键
Ionic interactions 离子作用
特异性结合
Entropy (+∆S) 熵变
Hydrophobic interactions 疏水作用
传统酶分析法的局限性
（连续分析法，不连续分析法，偶合 分析法）
1. 溶剂不透明或有混浊并对光谱检 测有干扰；
2. 天然的、重组的或突变的酶活性 低于分析方法的检测限；
3. 产物或底物没有光谱基团或荧光 基团，或者标记的成本太高或太 耗时；
4. 不连续分析要求多步进行； 5. 不存在直接的偶合反应； 6. 偶合分析不精确； 7. 底物或酶活性不清楚； 8. 蛋白质功能不清楚。
∆T DP
∆T~0
Reference Calibration Heater Sample Calibration Heater Cell Main Heater
Isothermal Titration Calorimetry 实验流程
1) 样品池中加入待测大分子 2) 参照池中加入缓冲液 3) 将待测配体吸入注射器中 4) 注射器置于样品池中 5) 调整温度、搅拌速度和每次注射体积