ZSCI整理6种常见细胞实验原理与方法描述

2018科域培训课程实战技能6：6种常见细胞实验原理与方法描述主讲人：茜

细胞功能

05细胞迁移和侵袭

01细胞增殖04细胞衰老

02细胞凋亡03细胞自噬

06血管形成

目录

16种常见细胞实验原理

2方法描述案例分析

3归纳与总结

PART 01 知其然而知其所以然

6种常见细胞实验原理

1. 细胞增殖的定义

细胞以分裂的方式进行增殖。单细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的个体。多细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的细胞，用来补充体内衰老或死亡的细胞。

一、细胞增殖

2. 细胞增殖的检测方法

1）对活细胞的代谢活性的检测（基于MTT 、CCK-8等）

2）DNA 合成的检测（基于BrdU 的免疫法或EdU 的点击化学法），可通过体内成像、微孔板或流式细胞术检测等多种技术进行细胞示踪。

1. 细胞代谢活性检测

MTT（噻唑蓝）：通过添加四咪唑盐到细胞中可进行线粒体内酶代谢活性的测定。活细胞能将四咪唑盐（如MTT、XTT、WST-1）还原成蓝紫色的甲瓒或甲瓒盐（Formazan），可通过分光光度计或酶标仪进行检测。

Cell Counting Kit–8 （CCK-8）中的WST-8被细胞内脱氢酶生物还原后生成的橙色甲臜染料能够溶解在组织培养基中，生成的甲臜量与活细胞数量成正比。基于CCK-8（WST-8）的试剂盒能高度准确地检测细胞增殖，比MTT法及XTT法的灵敏度高5倍，能检测更低的细胞数目。该试剂盒可适用于96孔板培养的贴壁或悬浮细胞。

细胞增殖的检测方法

2. DNA的合成的检测

DNA 的新组装合成是细胞生长的必要条件，故经常被用来进行细胞增殖、细胞活力及凋亡的检测。 BrdU 及EdU ，都是胸腺嘧啶的非放射性类似物，能掺入增殖细胞的DNA 中，可通过对BrdU 及EdU 的检测，从而对DNA 的合成量进行测定。

EdU （5-Ethynyl-2’- deoxyuridine ）是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶（T ）渗入正在复制的DNA 分子中，通过基于EdU 与Apollo®荧光染料的特异性反应快速检测细胞DNA 复制活性，适用于细胞增殖、细胞分化、生长与发育、DNA 修复、病毒复制、细胞标记示踪等方面的研究，尤其适合进行siRNA 、miRNA 、小分子化合物及其他药物的筛选实验。

细胞增殖检测方法

DNA染色

Apollo®荧光染色

二、细胞凋亡(apoptosis)

1. 细胞凋亡（apoptosis）的定义

细胞凋亡指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。

特点：细胞皱缩、体积缩小；部分细胞器、核糖体和核碎片被细胞膜包裹形成凋亡小体，从细胞表面出芽脱落，最后被具有吞噬功能的细胞吞噬；磷脂酰丝氨酸外翻；细胞核染色质浓缩、边缘化、染色质DNA断裂。

细胞凋亡的检测方法

2. 细胞凋亡的检测方法

包括：Caspase活性检测；DNA片段化分析和检测；流式细胞术检测；膜变化检测（AnnexinV染色、膜电位、线粒体功能完整性分析检测实验）及细胞形态学检测。

细胞凋亡检测方法

1. Annexin V-FITC/PI 双染法流式细胞术检测细胞凋亡

细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。

Annexin V 可与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V 被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。

碘化丙啶（Propidium Iodide, PI ）能够透过凋亡中晚期的细胞和死细胞的细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V 与PI 匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

流式细胞凋亡结果图解读

正常细胞早期

凋亡细胞

晚期凋亡细胞

和坏死细胞

损伤细胞

细胞凋亡的检测方法

2. 细胞形态学检测-荧光染色法（Hoechst/DAPI ）

细胞形态的变化如胞膜皱摺或出泡、核染色质致密、胞质浓缩等，都可作为细胞凋亡的证据。一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。DNA 特异性染料有：HO 33342（Hoechst 33342），HO 33258（Hoechst 33258），DAPI 。三种染料与 DNA 的结合都是非嵌入式的，主要结合在 DNA 的 A-T 碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。

Ⅰ 期：细胞核呈波纹状（rippled ）或呈折缝样（creased ），

部分染色质出现浓缩状态；

Ⅱa 期：细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；

Ⅱb 期：的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体

结果评判

细胞凋亡检测方法

3. TUNEL（原位缺口末端标记技术（in situ end labelling technique,ISEL)）

细胞凋亡中，染色体DNA双链/单链断裂二产生大量的粘性3‘-OH末端，在细胞（或组织）结构保持不变的情况下，用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphate，DUTP)和末端脱氧核苷酸转移酶（TdT)相反应与凋亡细胞裂解后3‘-OH端结合，经显色反应（细胞染成棕黄色）后检测DNA裂解点的技术。

正常细胞凋亡细胞

1.自噬的定义

自噬（Autophagy ）是普遍存在于真核细胞中的一种高度保守的代谢过程，是细胞内的一种“自食

（Self-eating ）”现象。它作为细胞内的主要降解途径，将胞内物质运输到溶酶体内降解。它主要有三种形式：大自噬，小自噬和分子伴侣介导的自噬。

三、自噬（Autophagy ）