毛细管电泳_电化学检测法测定硫酸铜_维生素C反应体系中的羟基自由基和菊花的抗氧化

2007年9月Sep tem be r 2007
色谱C h inese J ou rna l of C h rom a tog raphy
Vo l .25N o.5
681～685
收稿日期:2007204205
第一作者:程宏英,女,硕士研究生,E 2m a il:chyzdf @.通讯联系人:曹玉华,女,博士,Te l:(0510)89880693,E 2m a il:yuhuacao @.
毛细管电泳2电化学检测法测定硫酸铜2维生素C 反应体系中的
羟基自由基和菊花的抗氧化活性
程宏英
1,2
,　曹玉华
1
(1.江南大学化学与材料工程学院,江苏无锡214036;2.苏州科技学院化学化工学院,江苏苏州215009)
摘要:采用毛细管电泳2电化学检测方法,以对羟基苯甲酸为自由基捕捉剂,测定了硫酸铜2维生素C 反应体系(pH
714)中生成的羟基自由基。

研究了电极电位、运行液的pH 值、电泳电压及进样时间对体系中反应物和产物分离的影响,得到了最优化的测定条件;讨论了体系中各反应物浓度和反应时间对产物浓度的影响。

以直径为300μm 的
碳圆盘电极为检测电极,工作电极电位为0195V (vs.SC E ),目标产物3,42二羟基苯甲酸在115×10-4～610×10
-6
m o l/L 范围内线性关系良好,检测限(S /N =3)为115×10-6
m o l/L 。

应用该方法,研究测定了不同品种菊花的抗氧化活性。

关键词:毛细管电泳;电化学检测;羟基自由基;硫酸铜2维生素5C 反应体系;抗氧化活性;菊花中图分类号:O 658 文献标识码:A 文章编号:100028713(2007)0520681205 栏目类别:研究论文
D e te rm in a t io n o f H yd ro x y l R a d ica l in C uSO 42V itam in C R e a c t io n S ys tem a n d S ca ve n g in g A c t iv it ie s o f C h ry s a n th em um U s in g C ap illa ry
E le c t rop h o re s is w ith E le c t ro ch em ica l D e te c t io n
CH EN G H ongy ing
1,2
,CAO Yuhua
1
(1.School of Chem ica l a n d M a ter ia l En gin eer in g,Sou thern Ya n gtze U n ivers i ty,W u x i 214036,Ch in a;
2.D ep a r tm en t of Chem is try a n d Chem ica l En gin eer in g,U n ivers i ty of Scien ce
a n d Techn ology of Su zhou ,Su zhou 215009,Ch in a )
A b s t ra c t:H igh p e rfo r m ance cap illa ry e lec trop ho res is (C E )w ith e lec trochem ica l de tec tion (ECD )w as em p loyed to de te r m ine the am oun t of hyd roxyl rad ica l in C uSO 42vitam in C reac tion sys tem (pH 714).The effec ts of som e i m p o rtan t fac to rs,such as the ac id ity of the runn ing buffe r,sep a ra tion vo ltage,in jec tion ti m e and the p o ten tia l app lied to the w o rk ing e lec trode w e re inves tiga ted to choose the C E 2ECD op ti m um cond itions.The reac tion sys tem to p roduce hyd roxyl rad ica l w as a lso op ti m ized such as the effec ts of reac tan t concen tra tion and reac tion ti m e on the concen tra tion of 3,42d ihyd roxy 2benzo ic ac id.O p e ra ted in a w a ll 2je t configu ra tion,a 300μm d iam e te r ca rbon 2d isc e lec trode w as used as the w o rk ing e lec trode.Exce llen t linea rity w as ob ta ined in the concen tra tion rang ing from 115×10-4
m o l/L to 610×10-6
m o l/L fo r the re 2
ac tion p roduc t .The de tec tion li m it w as 115×10
-6
m o l/L (S /N =3).Th is m e thod w as success 2
fu lly app lied to de te r m ine scavenging ac tivities of C h rysa n them um fo r hyd roxy l rad ica l .Ke y w o rd s:cap illa ry e lec trop ho res is (C E );e lec trochem ica l de tec tion (ECD );hyd roxy l rad i 2
ca l ;in C uSO 42v itam in C reac tion sys tem ;scavenging ac tivity;C h rysa n them um
在生物机体的生命活动过程中,因新陈代谢不
断发生氧化还原反应而产生各种自由基[1]
,包括羟
基自由基(・O H )、超氧阴离子(O ・-2)、多种有机氧
自由基(RO ・,ROO ・)、单线态氧(1O 2)等。

它们
都有很强的生物活性[2]
,而羟基自由基的氧化活性
最强[3]
,可与生物体内的许多物质如脂肪酸、蛋白
质等作用,其氧化产物包括中间产物会损害生物膜、酶、蛋白质及活细胞的结构,使其失去生物活性或导致功能异常,如炎症、衰老、肿瘤、辐射损伤等[4]。

因此,对自由基尤其是羟基自由基的研究越来越受
到人们的普遍关注。

已有电子顺磁共振技术
[5]
、溴邻苯三酚红
色谱第25卷
(B PR)2硫脲催化光度法[6]、流动注射2化学发光法[7]、荧光光度法[8]、高效液相色谱法[9]用于自由基的间接测定。

但由于自由基存在的时间短、浓度低,以及光度法操作较繁琐而导致测定的灵敏度低,准确度和重现性均不高。

毛细管电泳2电化学检测法(C E2ECD)具有灵敏度高、选择性好等优点,已应用于Fe ton反应体系中羟基自由基的测定[3],但过量的H
2
O2极易导致副反应发生,且该方法是以水杨酸与羟基自由基反应的双目标产物叠加峰进行计算,从而降低了检测的准确度和灵敏度等。

目前,有关抗氧化剂清除自由基而减弱疾病引起的组织损伤的研究已得到科学家的重视[10,11]。

菊花(C h rysa n them um m o r ifolium R am a t)为常用中药,富含具有生理活性的黄酮类物质。

但菊花种类不同,其入药功效也大不一样。

本文建立了运用C E2ECD法研究硫酸铜2维生素C(pH714)反应体系,以对羟基苯甲酸为自由基捕捉剂,对单一目标产物3,42二羟基苯甲酸峰进行计算,测定了体系中生成的羟基自由基。

该测定体系温和,具有较高的灵敏度,已应用于不同品种菊花的抗氧化活性的测定,取得了满意的结果。

1　实验部分
1.1　仪器及其使用条件
毛细管电泳2电化学检测系统为自组装,±30 kV高压电源(上海原子核研究所),BASLC23D安培检测器(B ioana lytica l Sys tem,U SA),放大镜(S tra tfo rd,C T,U SA),HW22000色谱软件(上海千谱软件有限公司)。

45cm长熔融石英毛细管(内径25μm,外径360μm,Po lym ic ro Techno logies, U SA),电化学检测池为三电极体系,自制300μm 的碳圆盘电极为工作电极,饱和甘汞电极(SC E)为参比电极,铂丝为辅助电极。

通过三维定位调节器使工作电极与毛细管出口在同一直线上,并尽可能靠近毛细管末端。

采用电动进样,在20kV下从毛细管阳极端进样8s,检测池为阴极电泳槽。

1.2　试剂
3,42二羟基苯甲酸(D HBA)、木犀草素均购自美国S igm a2A ld rich公司,维生素C、对羟基苯甲酸和过氧化氢购自上海试剂二厂。

前4种试剂分别用乙醇2水(体积比1∶1)溶液配制成011m o l/L的标准储备液,于冰箱中储存备用。

实验用水为超纯水。

1.3　样品
标准野菊花购自上海生物科技研究所,其他菊花样品购自当地药材公司。

样品的具体信息见表1。

表1　不同品种菊花的来源及抗氧化能力分析
T a b le1　T h e sam p le in fo rm a t io n a n d d e te rm in a t io n
re s u lts o f s ca ve n g in g a c t iv it ie s
Sam p le nam e Cu ltiva tion o rigin
Scavenging
ra te/%
F los Ch rysa n them i In d ici
s tanda rd(标准野菊花)
Zhongke Ins titu te
of B io logy
(Shangha i,C h ina)
79.8
F los Ch rysa n them i In d ici
(野菊花)
Huangshan,A nhu i,
Ch ina
80.4
F los Ch rysa n them i In d ici
(野菊花)
X iun ing,A nhu i,
Ch ina
79.0
D en d ra n them a m or ifolium
cv(贡菊)
A nhu i,Ch ina81.5
F los Ch rysa n them i coron a r ium
(杭白菊)
Zhe jiang,C h ina80.1
D en d ra n them a in d icum(L.)
D es M ou1.va r(湖北神农菊)
Hube i,Ch ina81.0
Lu teo lin(木犀草素)
S igm a2A ld rich Co.,
L td,USA
85.8 1.4　羟基自由基的产生
于5m L洁净的容量瓶中加入215m L20 m m o l/L的磷酸二氢钾缓冲液(pH714)、015m L 0101m o l/L的C uSO4溶液、15μL011m o l/L的对羟基苯甲酸溶液,同时加入011m L011m o l/L维生
素C溶液和50μL0101m o l/L H
2
O2溶液,迅速用超纯水稀释至5m L,摇匀,放于37℃超级恒温器水浴中反应60m in。

1.5　羟基自由基的检测
上述反应液经0122μm尼龙滤膜过滤,取015 m L滤液并用磷酸二氢钾缓冲液(pH816)稀释至1m L,即为待测液。

当进样电压20kV,进样时间8s,检测电压0195V(vs.SC E)时,目标产物3,42 D HBA是对羟基苯甲酸与羟基自由基的一取代产
物,其峰高(H
)可与浓度建立线性方程,则C3,42D HBA
=C・
O H。

加入抗氧化剂后,目标产物3,42D HBA的峰高(H)发生变化,因此抗氧化剂的自由基捕捉能
力可表示为(H
-H)/H0×100%。

2　结果与讨论
2.1　分离检测条件的优化
工作电极上施加的电极电位大小直接影响检测的灵敏度。

本文在0155～111V范围内研究了电极电位对维生素C、对羟基苯甲酸及3,42二羟基苯甲酸3个标样峰高的影响,结果如图1所示。

随着氧化电位的升高,3个标样峰高随之增大,但是当氧化电位超过0195V时,产物3,42D HBA的峰高增加变缓;继续提高电极电位虽然可以增加3个分析物的峰高,但电泳本底电流大幅度增加,故选择检测电位为0195V,此时信噪比较高,电极的稳定性也较好。

・
2
8
6
・
　第5期程宏英,等:C E 2ECD 法测定硫酸铜2维生素C 反应体系中的羟基自由基和菊花的　
氧化活性
图1　电极电位对3个标准物峰高的影响
F ig.1　E ffe c t o f e le c t ro d e p o te n t ia l o n th e
p e a k h e igh t o f th e th re e s ta n d a rd s
Sep a ra tion vo ltage:20kV;pH 816;in jec tion ti m e:8s.
1.vitam in C;
2.p 2hyd robenzo ic ac id;
3.3,42DHBA.
根据反应体系中缓冲液的浓度,选择20m m o l/L 的磷酸二氢钾作为C E 2ECD 运行缓冲液,并研究了缓冲液的pH 值在711～816范围内对3个标样的分离影响,结果如图2所示。

当pH 值低于812时,反应物之间不能达到基线分离;pH 增大到816时,3个标样的分离效果较好;但过高的pH 值会延长分析时间。

由于体系中反应物的浓度很大,目标产物的浓度较小,为避免目标产物峰被覆盖,根据实验效果,pH 816为最佳的酸度选择。

图2　缓冲液酸度对分析物迁移时间的影响
F ig.2　E ffe c t o f th e a c id ity o f t h e ru n n in g b u ffe r
o n th e m ig ra t io n t i m e o f a n a ly te s
W o rk ing p o ten tia l:+0195V (vs.SCE );o the r cond itions a re the sam e as in F ig .1.
1.vitam in C;
2.p 2hyd robenzo ic ac id;
3.3,42DHBA.
在12～24kV 范围内考察了电泳分离电压对反应物和目标产物迁移时间的影响。

实验表明,提高分离电压可以缩短被分析物的迁移时间,但维生素C 和对羟基苯甲酸的分离度降低,同时对电化学检测器的干扰也随之增大,使基线噪声增加,仪器的信噪比降低。

综合考虑被分析物的分离度、峰展宽、灵敏度、噪声、焦耳热及分析时间等因素,选择分离电压为20kV 。

在此电压下,在进样时间分别为2,4,6,8,10,
12和14s 下,考察了3个标样的峰高与进样时间的关系。

实验发现进样时间超过8s 后,峰高增加不明显,且对羟基苯甲酸峰展宽严重,极大影响了分离度。

考虑到体系中目标物浓度不高的因素,选择进样时间为8s (20kV ),此时被分析物峰形良好,且分离完全。

在此优化条件下,维生素C 、对羟基苯甲酸、3,42D HBA 混合标准溶液的电泳谱图见图3。

图3　混合标准溶液的电泳图谱
F ig.3　E le c t rop h e ro g ram o f th e m ix tu re o f
s ta n d a rd s o lu t io n (110×10-4m o l /L )
The cond itions a re the sam e as in F ig .2.
1.vitam in C;
2.p 2hyd robenzo ic ac id;
3.3,42DHBA.
配制一系列不同浓度的3,42D HBA 标准溶液,
在选定的条件下,在浓度为115×10-4
m o l/L ～610
×10-6m o l/L 时,线性回归方程为y =-2135×10
3
+3144×105
x,其中y 是峰高,x 是3,42D HBA 浓度
(m o l/L )。

据此可推算反应体系中羟基自由基的生
成浓度。

以同一浓度(110×10-4
m o l/L )的3,42D HBA 溶液连续进样7次,峰高和迁移时间的相对标准偏差(RSD )分别为218%和311%。

以信噪比
S /N =3对应的浓度确定检测下限为115×10
-6
m o l/L 。

2.2　羟基自由基产生条件的优化
在硫酸铜2维生素C 反应体系中,为避免副反应发生,首先考虑体系中加入反应物的先后顺序,在pH 714的磷酸二氢钾缓冲液中,先加入硫酸铜,再加入自由基捕捉剂,最后同时加入维生素C 和H 2O 2。

体系中微量的H 2O 2是自由基引发剂,当其浓度为01001～0101m m o l/L 时,目标物的浓度随之增大;但当其浓度超过0101m m o l/L 时,反应物维生素C 与目标产物3,42D HBA 的浓度均迅速减小。

这可能是体系中过量的H 2O 2氧化了反应物维生素C 和目标产物3,42D HBA 所致。

因此本文反应体系中H 2O 2的浓度控制在0101m m o l/L 。

・
386・
色谱第25卷
反应物维生素C 的浓度对目标产物的影响也较大。

控制维生素C 与硫酸铜的浓度比在115～210之间,目标产物的浓度增加缓慢;其比例超过210时,目标产物的浓度随之减小。

过量的维生素
C 可能有副反应发生,故控制反应物维生素C 与硫
酸铜的浓度比为210。

自由基捕捉剂对羟基苯甲酸的浓度对目标产物的生成影响很大(见图4)。

在其浓度为0106～013
m m o l/L 时,产物的峰高响应值浓度随捕捉剂的浓
度增大而增大;自由基捕捉剂的浓度超过013m m o l/L 时,产物的峰高响应值下降,且电泳谱图中多了未知峰,表明体系中有副反应发生。

故选择加入15μL 013m m o l/L 的自由基捕捉剂。

图4　对羟基苯甲酸的浓度对产物3,42D HBA 峰高的影响F ig.4　E ffe c t o f p 2h yd ro b e n zo ic a c id co n ce n t ra t io n
o n th e p e a k h e igh t o f 3,42D HBA
Reac tion tem p e ra tu re:37℃;reac tion ti m e:1h;o the r
cond itions a re the sam e as in F ig .3.
反应时间对目标物的浓度影响也较大(如图5所示)。

在37℃水浴中,反应延长到1h,产物浓度迅速增大;再延长反应时间,目标物的浓度增加不明显,故控制反应时间为1h 。

综上所述,优化的体系中各反应物的浓度为:硫酸铜1m m o l/L,对羟基苯甲酸013m m o l/L,
维生素
图5　反应时间对产物3,42D HBA 峰高的影响
F ig.5　E ffe c t o f re a c t io n t i m e o n th e p e a k h e igh t
o f 3,42D HBA
p 2H yd robenzo ic ac id concen tra tion:013mm o l/L;o the r
cond itions a re the sam e as in F ig .4.
C 2m m o l/L,H 2O 20101m m o l/L 。

2.3　方法的重现性和回收率
图62a 为反应物与产物的电泳图谱,峰3为3,42D HBA 峰。

平行进样7次,峰高的RSD 为319%,迁移时间的相对标准偏差(RSD )为114%,产
物的平均浓度为611×10-5
m o l/L 。

根据产物为反应物的一取代产物,可推算羟基自由基的产生浓度为611×10-5
m o l/L 。

在图62a 反应体系中加入5μL 3,42D HBA 储备液进行测定。

目标产物的加样回收率为10511%,说明该方法是可靠的。

2.4　木犀草素与菊花捕捉自由基能力的测定 木犀草素为菊花中药中常见的黄酮类化合物之一[12],图62a,b,c 分别为加入0,5,10μL 0.1m o l/L 木犀草素溶液所得的反应物与产物的电泳谱图。

如图6所示,加入的木犀草素越多,目标产物3,42二羟基苯甲酸峰高越低。

图6　不同木犀草素加入量的反应体系电泳谱图
F ig.6　E le c t rop h e ro g ram s o f re a c t io n s ys tem s a d d e d w ith d iffe re n t vo lum e s o f lu te o lin (011m o l /L )
a.0μL lu teo lin;
b.5μL lu teo lin;
c.10μL lu teo lin.O the r cond itions a re the sam e as in F ig .4.
1.vitam in C;
2.p 2hyd robenzo ic ac id;
3.3,42DHBA.
将6种干燥的菊花样品于60℃烘箱中烘干,分别在研钵中研碎。

准确称取215g 菊花样品于25
・486・
　第5期程宏英,等:C E 2ECD 法测定硫酸铜2维生素C 反应体系中的羟基自由基和菊花的　氧化活性
m L 锥形瓶中,加入25m L 乙醇2水(体积比为1∶1)
溶液,封住瓶口,超声提取30m in 后,上层清液经漏斗过滤,滤液再经0122μm 聚丙烯滤膜过滤得样品准备液。

准确移取5μL 样品准备液于反应体系中,样品提取液总浓度为011g /L,测定目标产物的浓度,根据公式推算不同品种菊花的抗氧化能力,结果见表1。

菊花和野菊花同属于菊科草本植物,具有抗菌和抗病毒等相同作用,临床上常有将菊花和野菊花相互替代使用,但其药理药效却大不相同。

菊花是一种疏散风热、清散头目的常用药材,可作饮用;而野菊花常用作疗疮痈肿,可用于治疗多种炎症和皮
肤瘙痒等,但长期服用却损伤胃气[13]。

表1中的测定结果显示,木犀草素、菊花和野菊花都具有较强的捕捉自由基能力,证明了不同品种的菊花中均富含具有抗氧化能力的黄酮类物质。

但不同品种菊花的抗氧化能力差别不大,不能作为菊花和野菊花品种区分的依据,说明菊花和野菊花品种的区分、入药选材还与其所含其他主要成分及其药理关系甚大。

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(梁强,焉本魁,安丰田.中国临床医生),2005,33(7):58
2008年《环境化学》征订启事
《环境化学》
(双月刊)是中国科学院生态环境研究中心主办的学术性刊物,被列为化学类中文核心期刊。

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2007年9月
・
586・。