波长变换高效液相色谱法测定逍遥丸中6种活性成分

波长变换高效液相色谱法测定逍遥丸中6种活性成分
赵巍;汪正宇;武志昂
【摘要】目的建立同时测定逍遥丸中6种成分(绿原酸、芍药苷、甘草苷、阿魏酸、甘草酸和Z-藁本内酯)的高效液相色谱分析方法.方法色谱柱为Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm);乙腈(A)-0.1％磷酸水溶液(B)为流动相,梯度洗脱:0～10 min,5％A;10～25 min,5％A→15％A;20～70 min,15％A→60％A;波长:0～27.0 min为326 nm(绿原酸),27.0～30.5 min为230 nm(芍药苷),30.5～36.0 min为280 nm(甘草苷、阿魏酸),36.0～52.0 min为276 nm(甘草酸),52.0～70.0 min为350 nm(Z-藁本内酯);体积流量1.0 mL?min-1;柱温35℃;进样量10μL.结果绿原酸、芍药苷、甘草苷、阿魏酸、甘草酸和Z-藁本内酯分离度良好,质量浓度分别在27.09～270.90,30.22～302.23,12.45～124.48,9.79～97.92,6.89～
68.92,7.46～74.56μg?mL-1线性关系良好,均r>0.9990,平均加样回收率为
97.9％～100.8％(RSD在0.55％～1.83％).6批样品中绿原酸、芍药苷、甘草苷、阿魏酸、甘草酸和Z-藁本内酯分别在12.25～12.30,10.38～10.45,5.58～
5.64,5.07～5.14,2.01～2.08,2.67～2.74 mg?g-1.结论本方法专属性好、灵敏度高、准确度高,为逍遥丸的质量控制提供依据.
【期刊名称】《医药导报》
【年(卷),期】2018(037)008
【总页数】4页(P1000-1003)
【关键词】逍遥丸;绿原酸;芍药苷;甘草苷;阿魏酸;甘草酸;Z-藁本内酯;色谱法,高效液相;含量测定
【作者】赵巍;汪正宇;武志昂
【作者单位】沈阳药科大学工商管理学院,沈阳 110016;北京市药品检验所北京市保健食品化妆品检验中心,北京100035;安徽省宿州市食品药品检验所,宿州234000;沈阳药科大学工商管理学院,沈阳 110016
【正文语种】中文
【中图分类】R286;R927.2
逍遥丸(浓缩丸)来源于宋代汉医方剂学著作—《太平惠民和剂局方》，现收载在《中华人民共和国药典》2015年版一部[1]，临床用于治疗肝郁脾虚所致的脘闷不舒、胸胁胀痛、头晕目眩、食欲减退和月经不调等疾病，研究表明，该药还对抑郁征[2]、围绝经期综合征[3]、乳腺增生症[4]、免疫性不孕[5]、Ⅲ型慢性前列腺炎[6] 和慢性疲劳综合征[7]等疾病。

逍遥丸是由柴胡、当归、白芍、炒白术、茯苓、炙甘草和薄荷等七味药材制成的成方制剂，涉及药材种类多，所含成分复杂，比如药材当归中含有阿魏酸及Z-藁本内酯成分，白芍含有芍药苷及阿魏酸，白术含阿魏酸以及甘草含有甘草酸和甘草苷成分，当归、白术和茯苓均含有绿原酸；《中华人民共和国药典》2010年版仅对芍药苷做了定量质控要求，而成英等[8]采用高效液相色谱(HPLC)法测定逍遥丸中甘草苷、异甘草素和甘草酸的含量。

易润青等[9]采用毛细管电泳法测定逍遥丸中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量，苏兰宜等[10]对
逍遥丸中芍药苷、阿魏酸和槲皮素的含量做了研究，白雁等[11]采用近红外光谱法快速测定逍遥丸中芍药苷的含量。

张庆等[12] 采用HPLC法测定加味逍遥丸中芍药苷的含量。

李珂等[13]利用高效液相色谱法测定加味逍遥丸中丹皮酚的含量。

上述研究虽对逍遥丸中一部分成分做了深入研究，然而同时测定6种成分方面的研
究笔者还未见报道。

笔者在本研究中建立HPLC波长转换法同时测定逍遥丸中绿
原酸、芍药苷、甘草苷、阿魏酸、甘草酸、Z-藁本内酯等6种活性成分的方法，
方法简单、快捷，重复性好，能为系统地评价和控制逍遥丸的质量提供参考依据。

1 仪器与试药
1.1 仪器 Waters 2695-2996型高效液相色谱仪(美国沃特世公司)；BS124S型电
子天平(德国赛多利斯公司，感量：0.01 mg)；DL-360A型超声波清洗器(上海之
信仪器有限公司，功率：240 W)，BGZ-700型鼓风干燥箱(上海博迅医疗生物仪
器股份有限公司)，Arium611UV型实验室超纯水系统(德国赛多利斯公司)。

1.2 试药芍药苷对照品(批号：110736-201640，纯度：95.2%)、阿魏酸对照品(批号：110773-201313，纯度：99.6%)、甘草苷对照品(批号：111610-201607，纯度：93.1%)、绿原酸对照品(批号：110753- 201415，纯度：96.2%)、甘草酸对照品(批号：110731-201619，纯度：93.0%)均购于中国食品药品检定研究院，Z-藁本内酯对照品(批号：110825，纯度：>98%)购自上海融禾医药科技有限公司。

逍遥丸，芜湖张恒春药业有限公司，批号分别为1510261，1603251，1603261，1604221，1605221，1606121。

甲醇、乙腈为色谱纯(美国默克公司)，水为超纯水，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 混合对照品溶液的制备精密称取绿原酸、芍药苷、甘草苷、阿魏酸、甘草酸、Z-藁本内酯对照品各适量，置50 mL量瓶中，加甲醇20 mL，超声处理30 min
使溶解完全，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。

精密量取对照品贮备液5 mL置100 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制成浓度分别为绿原酸270.90 μg·mL-1、芍药苷302.23 μg·mL-1、甘草苷124.48 μg·mL-1、阿魏酸97.92
μg·mL-1、甘草酸68.92 μg·mL-1和Z-藁本内酯74.56 μg·mL-1的混合对照品溶
液，摇匀，滤过，即得。

2.1.2 供试品溶液的制备取本品若干，研细，精密称取细粉1.0 g，置200 mL干
燥具塞锥形瓶中，精密量入甲醇100 mL，密塞，精密称定，超声处理(功率240 W)30 min，放冷，再精密称定，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 阴性样品溶液的制备按“2.1.2”项工艺方法制备缺少当归、白芍、炙甘草、白术和茯苓的阴性样品，按“2.1.2”项方法制备阴性样品溶液。

2.2 色谱条件色谱柱为Kromasil C18 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为
乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)系统，梯度洗脱：0～10 min，5%A；10～25 min，5%A→15% A；10～70 min，15%A→60%A；测定波长：0～27.0 min为326 nm(绿原酸)，27.0～30.5 min 为230 nm(芍药苷)，30.5～36.0 min为280
nm(甘草苷、阿魏酸)，36.0～52.0 min为276 nm(甘草酸)，52.0～70.0 min为350 nm(Z-藁本内酯)；流速为1.0 mL·min-1；柱温：35 ℃，进样量为：10 μL。

2.3 系统适用性实验分别取阴性样品溶液、混合对照品溶液和供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件测定，记录色谱图，考察方法系统适用性。

结果各峰分离均
大于1.5，对称性好，且阴性样品对各目标峰无干扰，各峰理论板数均大于4 500，该方法适用性好。

见图1。

2.4 方法学考察
2.4.1 线性关系考察分别取混合对照品溶液1，3，5，7，8，10 mL，置同一个
10 mL量瓶中，加甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，得一系列混合对照品溶液，按“2.2”项色谱条件进行分析，记录色谱图。

以各成分的浓度(μg·mL-1)为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)，绘制各成分标准曲线，并进行线性回归。

结果6种成分的回归方程分别为绿原酸：Y=122.84X+3.45，r=0.999 0，线性范围27.09～270.90 μg·mL-1；芍药苷：Y=67.89X-16.81，r=0.999 5，线性范围30.22～
302.23 μg·mL-1；甘草苷：Y=264.65X-1.40，r=0.999 5，线性范围12.45～124.48 μg·mL-1；阿魏酸：Y=324.88X+32.09，r=0.999 2，线性范围9.79～97.92 μg·mL-1；甘草酸：Y=208.45X+34.43，r=0.999 4，线性范围6.89～68.92 μg·mL-1；Z-藁本内酯：Y=120.08X+50.06，r=0.999 2，线性范围
7.46～74.56 μg·mL-1。

结果表明在线性范围内各组分进样量与响应值间呈良好的线性关系。

A.阴性样品；
B.混合对照品；
C.供试品；1.绿原酸；2.芍药苷；3.甘草苷；4.阿魏酸；5.甘草酸；6.Z-藁本内酯
图1 3种溶液的HPLC图
A.negative sample；
B.mixed reference substances；
C.sample；
1.chlorogenic acid；
2.paeoniflori；
3.liquiritin；
4.ferulic acid；
5.glycyrrhizic acid；
6.ligustilideFig.1 HPLC of three kinds of solution
2.4.2 精密度实验取同一批(批号：1606121)供试品溶液，在“2.2”项色谱条件
下连续进样6次，记录色谱图，计算各组分峰面积RSD值。

结果绿原酸、芍药苷、甘草苷、阿魏酸、甘草酸和Z-藁本内酯峰面积的RSD 值分别为0.15%，0.47%，0.44%，0.48%，0.13%和0.75%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 重复性实验取同一批(批号：1606121)供试品，按“2.1.2”项下制备方法，平行制备6 份，在“2.2”项色谱条件下检测，记录色谱图，按标准曲线法计算各组分含量。

结果绿原酸、芍药苷、甘草苷、阿魏酸、甘草酸和Z-藁本内酯的平均
含量分别为：12.33，10.32，5.43，5.10，2.04和2.72 mg·g-1，RSD分别为
0.78%，0.84%，1.38%，0.78%，1.14%和1.29%，表明方法重复性良好。

2.4.4 稳定性实验取同一批(批号：1606121)供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下，于0，3，6，9，12 h测定，记录色谱图，计算各组分峰面积RSD。

结果绿
原酸、芍药苷、甘草苷、阿魏酸、甘草酸和Z-藁本内酯峰面积的RSD 值分别为1.45%，1.00%，0.23%，0.99%，0.56%和1.27%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.4.5 加样回收率实验取同一批(批号：1606121)供试品6份，干燥处理，研细，取细粉0.5 g，分别加入临配制对照品溶液(含绿原酸5.34 mg·mL-1、芍药苷5.04 mg·mL-1、甘草苷
3.41 mg·mL-1、阿魏酸
4.80 mg·mL-1、甘草酸2.54 mg·mL-1和Z-藁本内酯2.36 mg·mL-1)1mL，按“2.1.2”项下方法制备，按“2.2”项色谱条件分析，记录色谱图，按标准曲线法计算各组分含量。

结果各组分平均加样回收率分别为98.7%，98.8%，100.8%，97.9%，99.8%和99.6%，RSD分别为1.10%，1.12%，1.83%，0.99%，0.67%和0.87%，表明该方法准确度高。

见表1。

表1 6种成分加样回收率实验结果Tab.1 Results of recovery tests on six components成分样品量加入量测得量mg回收率/%绿原酸
6.1395.3411.46899.796.1235.3411.43799.516.1105.3411.3179
7.516.0905.34 11.3289
8.096.1995.3411.5309
9.836.1545.3411.37297.72芍药苷
5.2025.0410.13197.805.0995.0410.162100.465.1145.0410.12299.375.2545.0 410.24999.115.1515.0410.05997.385.1725.0410.15098.77甘草苷
2.301
3.415.822103.262.2443.415.62899.242.2333.415.745103.002.2883.415. 68799.682.2413.415.64399.772.2353.415.63399.65阿魏酸
2.5474.807.23697.692.4874.807.16197.382.5164.807.18497.252.5184.807.21 697.882.5264.807.31899.832.4894.807.16797.46甘草酸
1.017
2.54
3.54699.571.0422.543.608101.021.0072.543.54499.881.0182.543.5 4299.371.0392.543.579100.001.0212.543.53999.13Z-藁本内酯
1.351
2.36
3.70099.531.3672.363.753101.101.3342.363.66298.641.3312.363.6
7499.281.3322.363.692100.001.3342.363.67299.07
2.5 含量测定取逍遥丸供试品6批，按“2.1.2”项下方法制备，以“2.2”项色谱条件进行分析，记录色谱峰峰面积，以标准曲线法计算各组分质量分数。

见表2。

表2 6批逍遥丸中6种成分定量测定结果Tab.2 Quantitative determination of six components in six batches of Xiaoyao pills mg·g-1，n=2批号绿原酸芍药苷甘草苷阿魏酸甘草酸Z-藁本内酯
151026112.3010.435.635.122.062.72160325112.2810.455.645.142.082.7416 0326112.2510.405.595.092.032.69160422112.2810.385.585.072.012.671605 22112.2710.435.625.122.062.72160612112.2610.415.615.102.042.70
3 讨论
逍遥丸由七味药材制得，含有多种成分，因结构不同各成分检测参数不尽相同，本研究结合高效液相色谱仪特点，采用变换检测波长的方式实现同时测定6种成分。

通过扫描紫外-可见光谱图可知，绿原酸在326 nm处有最大吸收，芍药苷最大吸收波长为230 nm，甘草苷及阿魏酸为280 nm，Z-藁本内酯在350 nm处有最大吸收，而甘草酸在276 nm处吸收值最强，所以波长变换程序设置为：0～27.0 min 为326 nm(检测绿原酸)，27.0～30.5 min 为230 nm(检测芍药苷)，30.5～36.0 min 为280 nm(检测甘草苷和阿魏酸)，36.0～52.0 min 为276 nm(检测甘草酸)，52.0～70.0 min 为350 nm(检测Z-藁本内酯)。

实验先后考察3种流动相系统，分别是甲醇-0.1%磷酸盐水溶液系统、乙腈-磷酸
盐0.1%水溶液系统和乙腈-醋酸盐0.2%水溶液系统，发现甘草酸和阿魏酸出峰时间很接近，两色谱峰完全分离对流动相提出来严格的要求，只有当选择乙腈-磷酸
盐0.1%水溶液作为流动相时，各色谱峰峰形较好，且甘草酸和阿魏酸能分离完全，分离度大于1.5，故实验流动相得以确定。

本研究建立波长变换HPLC法，能同时测定逍遥丸中绿原酸、芍药苷、甘草苷、
阿魏酸、甘草酸和Z-藁本内酯等6种成分含量，方法专属性强、灵敏度高、重复性好，能为逍遥丸的质量控制提供参考依据。

参考文献
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