流式细胞仪结果分析
sybergreen流式细胞结果解读
Sybergreen流式细胞仪是一种用于检测细胞遗传学和细胞分化的先进工具，其结果解读需要结合实验的具体情况以及相关知识和技能。
首先，Sybergreen流式细胞仪主要用于检测细胞内Syber Green I染料标记的DNA的荧光强度，从而确定细胞的DNA倍体和细胞类型。
在正常的情况下，二倍体细胞和单倍体细胞的荧光强度会有明显的差异，而异常倍体细胞的荧光强度可能会下降。
因此，Sybergreen流式细胞仪结果通常会显示不同倍体细胞的荧光强度分布图。
其次，对于结果的分析，需要注意以下几点：
1. 阳性细胞数量：观察荧光强度分布图中的阳性细胞数量，如果数量较多，则说明该指标在某些细胞中存在异常。
2. 倍体类型：观察荧光强度分布图中的各倍体类型的比例，如果某一种异常倍体细胞的荧光强度明显高于其他倍体类型，则说明该异常倍体细胞的数量较多。
3. 阳性细胞的形态：在观察异常细胞时，需要注意阳性细胞的形态是否与正常细胞存在差异。
异常细胞的数量增多时，需要观察是否有一些特殊形态的细胞出现。
在具体的应用中，Sybergreen流式细胞仪可以用于检测肿瘤细胞的DNA倍体和增殖活性，从而判断肿瘤的恶性程度、患者的预后以及治疗效果等。
同时，该仪器还可以用于干细胞研究、组织分化研究等领域。
但是需要注意的是，在解读Sybergreen流式细胞仪结果时，需要结合患者的临床资料、病理诊断、免疫组化染色以及其他检测结果等进行综合分析。
综上所述，解读Sybergreen流式细胞仪结果需要具备一定的细胞遗传学和流式细胞仪方面的知识，并结合患者的具体情况进行分析。
只有在充分理解实验数据的基础上，才能准确地评估病情、制定治疗方案和评估治疗效果。
流式结果分析
流式检测细胞凋亡
常用检测试剂盒：FITC-PI(常见细胞) PE-ADD（绿色荧光的细胞）
正常细胞，膜电位正常时，JC-1通过线粒体膜极性进入 线粒体内，并因浓度升高而形成发射红色荧光的多聚体，而 凋亡细胞，线粒体跨膜电位去极化，JC-1从线粒体内释放， 浓度降低，逆转为发射绿色荧光的单体形式。故而可以通过 检测绿色和红色荧光来定性(细胞群的偏移）定量（细胞群 的荧光强度）的检测线粒体膜电位的变化
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
流式原理
流式原理
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流式结果分析
流式原理
流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束 ，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射 下，产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二 极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角 度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光 信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和 带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。
流式检测细胞周期
表面标志物、蛋白等
将所要检测的蛋白用带有荧光标记的一抗 孵育后，蛋白就会带上相应的荧光，之后用 流式检测荧光值，便可得到表达情况
表面标志物——以CD44为例
线粒体膜电位的检测
线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，线粒体跨膜电 位的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事 件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出 现之前，一旦线粒体DYmt崩溃，则细胞凋亡不可逆转。
流式细胞仪及流式细胞术
流式细胞仪及流式细胞术流式细胞仪技术流式细胞仪技术，主要是测量群体中单个细胞经适当染色后其成分所发出的散射光和荧光，经染色的细胞在悬液中以单行流过高强度光源的焦点，当每个细胞经过焦点时，发出一束散射光/或荧光。
它们经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器(光电倍增管或一个固态装置)，光检测器把散射光定量转化成电信号，经数字转换器进行数字化后而成整数，然后进行电子存储，以后数据可以调出显示和进行分析。
其优点如下：1、具有操作简便，只要将染色的单个细胞推入仪器中，就会得出数据。
2、具有较高的灵敏度及测定速度，而且每次可测出许多数据，一般情况下，每秒可测5000个细胞，能迅速分析和记数大量细胞，并能准确统计群体中荧光标记细胞的比例。
3、应用广泛，即可用于测定细胞活力、繁殖周期和细胞定型分析，也可区别死亡细胞、分裂细胞和静止细胞群，既可测定DNA和RNA、测凋亡峰，又可测蛋白含量，特别是胞浆蛋白。
基本流程原理：1、将待测细胞染色后制成单细胞悬液，用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定的角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。
2、流式细胞仪通常以激光作为发光源。
经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。
这两种信号同时被前向光电二极管和90度方向的光电倍增管接收。
散射光不依赖任何细胞样品的制备技术，被称为细胞的物理参数或固有参数，散射光有包括前向角散射和侧向叫散射，前向角散射与被测细胞直径的平方密切相关，侧向角散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信号。
荧光信号也有两种，一种是细胞自身在激光照射下发出的微弱荧光信号，另一种是经过特异荧光素标记后的细胞受激发照射后得到的荧光信号。
流式细胞术分析PMA诱导THP1分化为巨噬细胞的表型特征
流式细胞术分析PMA诱导THP1分化为巨噬细胞的表型特征一、本文概述流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种在液流中快速分析单个细胞的多参数特性的强大技术。
该技术通过标记特异性抗体与细胞表面或内部抗原的结合，结合流式细胞仪的高通量分析能力，使我们能够精确测量细胞群体的表型特征。
在生物医学研究中，流式细胞术广泛应用于细胞分化、细胞周期、细胞凋亡、信号转导等多个领域。
本文旨在利用流式细胞术分析佛波酯（Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）诱导人急性单核细胞白血病细胞系THP-1分化为巨噬细胞的表型特征。
我们将通过流式细胞术检测分化过程中细胞表面标志物的表达变化，如CDCD68等，以及细胞内分子如肿瘤坏死因子TNF-α、白介素IL-1β等的表达情况，从而全面揭示PMA诱导THP-1细胞向巨噬细胞分化的分子机制。
通过本文的研究，我们期望能够为深入理解巨噬细胞分化过程中的分子事件提供新的视角，并为开发针对巨噬细胞相关疾病的治疗策略提供理论依据。
本文还将探讨流式细胞术在细胞分化研究中的应用价值，以期为生物医学领域的研究人员提供有益的参考。
二、材料与方法1 细胞系：人单核细胞系THP-1，购自美国ATCC（American Type Culture Collection）。
2 试剂：佛波酯（Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA），购自Sigma-Aldrich公司；RPMI 1640培养基、胎牛血清（FBS）、青霉素/链霉素双抗，购自Gibco公司；流式细胞术抗体，包括但不限于CDCDHLA-DR等，购自BD Biosciences或eBioscience公司。
3 仪器：流式细胞仪（如FACS Canto II，BD Biosciences）；二氧化碳培养箱；离心机；倒置显微镜。
1 细胞培养：THP-1细胞在含有10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素双抗的RPMI 1640培养基中，于37℃、5% CO2的条件下培养。
流式细胞术的原理与应用-FACS-aria
信号检测
FALS Sensor
Freq
散射光信号 （FSC、SSC）： 物理参数
Fluorescence
Fluorescence detector (PMT3, PMT4 etc.)
荧光信号： 非特异荧光 + 特异荧 光
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散射光信号
前向角散射光信号（FSC ，Forward Scatter ）：与激光方向同轴 侧向角散射光信号（SSC， Side Scatter ）：与激光束垂直
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细胞膜检测： Annexin V/PI双染色法
死亡和晚 期凋亡
活细胞： annexinV-/PI早期凋亡： annexinV+/PI死亡和晚期凋亡： annexinV+/PI+
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活细胞
早期凋亡
新功能基因CB12质粒转染的293T细胞明显促 进细胞凋亡 FL1:FITC-annexinV, FL2:PI
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信号的显示方式
单参数直方图（Histogram） 双参数：
二维点图(Dot Plot) 等高线图(Contour Plot) 二维密度图(Density Plot)
三维图(3D Plot)
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单参数直方图（Histogram）
阴性区
阴性 对照
横坐标：荧光信号的 强弱 (相对强度)，反 映了细胞抗原的表达 含量
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前向散射光信号(FSC)
前向散射光信号（FSC ）：与细胞相对大小和体积相关
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侧向散射光信号（SSC)
侧向角散射光（SSC） :代表细胞内部的精细结构变化，对胞膜、 胞质、核膜变化更敏感
流式细胞仪结果分析
流式细胞仪结果分析一、获取数据在进行流式细胞仪结果分析之前，首先需要获取实验数据。
流式细胞仪会输出每个样本细胞的荧光强度、散射性质等参数。
这些参数可以代表细胞的表型特征或者亚细胞结构。
根据实验的需要，可以选择一种或多种指标进行数据分析。
二、数据清洗和预处理由于实验过程中可能会受到一些随机因素的干扰，比如机器灵敏度、噪声等，得到的数据可能存在一些异常值。
因此，在进行数据分析之前，首先需要对数据进行清洗和预处理，以减少这些异常值的干扰。
数据清洗可以通过以下几种方法进行：1.去除非细胞事件：流式细胞仪在采集数据时可能会采集到一些非细胞事件，比如细胞碎片、空白颗粒等，可以通过设置或者后续数据处理来去除这些非细胞事件。
2.去除离群值：根据实验的需要和数据的分布情况，可以使用统计学方法或者软件工具来判断和去除离群值。
3.数据归一化：如果实验中使用了多个荧光探针，不同探针之间的信号强度可能有差异。
可以通过归一化处理来消除这种差异，以确保数据的可比性。
三、统计分析数据清洗和预处理之后，可以进行统计分析来描述和解析数据。
流式细胞仪的数据通常是多维的，可以使用多种统计分析方法来从不同角度揭示数据的特点和规律。
1.基本统计分析：包括均值、标准差、中位数等指标，可以帮助了解数据的集中趋势和离散程度。
2.相关性分析：通过计算各个参数之间的相关系数，可以研究不同指标之间的关系。
例如，可以使用皮尔逊相关系数来衡量两个参数之间的线性相关性。
3.差异分析：比较不同样本或不同组的数据之间的差异。
常用的差异分析方法有t检验、方差分析等。
四、数据可视化为了更好地理解和传达数据的结果，可以使用数据可视化技术将数据以图表、图像等形式展示出来。
常用的数据可视化方法包括散点图、条形图、箱线图等。
通过数据可视化，可以帮助研究者直观地观察数据的分布情况、群体几何形状和特征变化趋势等。
五、结果解读在进行流式细胞仪结果分析时，需要根据实验目的和样本特性进行结果的解读。
流式细胞凋亡结果解读
流式细胞凋亡结果解读
流式细胞凋亡结果解读是通过流式细胞术来评估细胞中的凋亡程度。
凋亡是一种正常的细胞死亡形式，它在维持机体内细胞平衡中起着重要的调节作用。
在流式细胞凋亡结果解读中，我们通常会关注两个参数：细胞凋亡率和凋亡程度。
细胞凋亡率是指在一定细胞总数中凋亡细胞数量所占的比例。
常用的流式细胞仪会使用特定的荧光探针，如Annexin V和PI，以区分细胞的生死状态。
Annexin V可以结合在凋亡细胞表面的磷脂，而PI则能够进入已损伤的细胞。
通过流式细胞仪的检测和分析，我们可以确定细胞的凋亡率。
凋亡程度是指凋亡细胞中发生的具体变化。
在凋亡过程中，细胞会发生DNA 断裂和染色质凝固，体积也会减小。
通过流式细胞仪可以进一步评估这些变化。
例如，可以使用荧光染料如Hoechst 33342染色核酸，以观察DNA断裂。
同时，还可以使用其他荧光探针或标记特定蛋白来检测凋亡相关的分子信号途径。
通过准确评估细胞凋亡率和凋亡程度，我们可以了解细胞对于各种刺激的响应和机体内细胞死亡的调节情况。
这对于研究疾病的发生机制、药物研发以及评估治疗效果都具有重要意义。
总之，流式细胞凋亡结果解读是通过流式细胞术来评估细胞中的凋亡程度和凋亡细胞比例。
这种评估可以为我们研究细胞死亡的机制和判断治疗效果提供重要的参考。
药物开发和生物制品表征：质谱流式实验数据分析-百泰派克生物科技BTP
药物开发和生物制品表征：质谱流式实验数据分析-百泰派克生物科技BTP质谱流式技术（Mass Cytometry）在药物开发和生物制品表征中的潜力巨大。
质谱流式细胞术将质谱技术与流式细胞仪相结合，能够实现对单个细胞的生化成分进行深入研究，帮助我们理解疾病机制，验证药物的效果，发现新的药物靶点以及增强生物制药质量控制。
这在生物制品表征中非常有用，它可以帮助解决以下一些问题：单细胞层次的分子表征：传统的质谱技术通常需要大量的样本以获取可靠的结果，而质谱流式技术则可以分析单个细胞的生化成分，这可以帮助我们更深入地理解细胞的生物学特性。
生物分子的定量分析：质谱流式技术可以对细胞内的生物分子进行定量分析，包括蛋白质、代谢物和其他生物分子。
细胞异质性的研究：细胞群体中的细胞并非完全相同，它们之间的差异可能影响疾病的发展和治疗的效果。
质谱流式技术可以帮助我们研究这种细胞异质性。
百泰派克生物科技BTP采用基于Fluidigm Helios流式细胞仪（Mass Cytometry System for Single Cell Analysis）用于单细胞质谱分析，该平台能够完成包括单细胞捕获、cDNA合成、实时定量PCR分析、目标区域扩增以及质谱流式细胞分析。
相较于传统流式，质谱流式的特点在于包含巨大的信息量。
质谱流式提供的高维数据能够检查单个样本中大量细胞亚群的特征、研究已知细胞群内的异质性、识别与临床状态相关的细胞群变化、评估靶细胞群与已知参考群体的相似性、确定细胞群生理状态的变化、识别发育途径中的中间状态或分支点。
图1. 质谱流式细胞术与传统流式数据分析比较。
1、质谱流式数据导出使用质谱流式仪器检测的数据，需要进行数据合并、校正、归一化等数据转换操作后方可导出，导出的文件格式为FCS（图2）。
图2. 质谱流式细胞术数据导出。
质谱流式原始数据通常以具有不同表达范围的偏态分布为特征。
由于可视化和聚类性能取决于规模和分布，使表达峰尽可能接近正态分布非常重要。
流式细胞仪实验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除流式细胞仪实验报告篇一：流式细胞术实验报告流式细胞术实验目的掌握流式细胞仪的工作原理掌握用流式细胞仪测量细胞群体DnA含量分布的方法了解流式细胞术在细胞生物学研究中的应用实验原理流式细胞仪的工作原理是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。
在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。
通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其体积、内部结构、Dn(:流式细胞仪实验报告)A、RnA、蛋白质、抗原等物理及化学特征。
细胞内的DnA含量随细胞周期进程发生周期性变化，如g0/g1期的DnA含量为2c，而g2期的DnA含量是4c。
利用pI标记的方法，通过流式细胞仪对细胞内DnA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。
仪器、材料与试剂仪器：流式细胞仪、离心机。
材料：hela细胞样品、试管、离心管、封口膜、微量移液器、Tip头、eppendorf管。
试剂：70％乙醇（保存于4℃），Rnase（-20℃保存），pI染液（避光保存于-20℃），pbs(ph7.4，保存于4℃)实验步骤样品细胞由老师于课前收集并置于70%(预冷)乙醇中4℃下固定过夜。
2000rpm15min收集固定细胞，pbs洗2次。
用100μLpbs重悬细胞并转至试管中轻轻吹打（防止细胞破碎）。
加pI染液50μL和Rnase约2μL室温放置15min。
上机检测。
样品测定并使用modFitLT软件分析结果。
实验结果与讨论:所测样品中各周期时相的百分比：g1期68.48%g2/m期16.63%s期14.89%g2：g1=1:1.77cV12.16提示结果可能不可靠或存在多倍体细胞。
流式细胞术是一种对悬液中细胞、微生物或细胞器等进行单个快速识别、分析和分离的技术。
用以分析细胞大小、细胞周期、DnA含量、细胞表面分子以及进行细胞分选等。
这种技术具有以下特点1.测量速度快；2.可进行多参数测量；3.是一门综合性的高科技方法（Fcm综合了光学，电子学，流体力学，细胞化学，免疫学，激光和计算机等多门学科和技术）；4.既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
流式细胞仪数据分析
流式细胞仪数据分析5.1 数据采集及显示光信号转换成电压脉冲后，再通过模数转换器转换成为计算机能够储存处理的数字信号。
流式细胞仪的数据以FSC标准格式存储，该标准由“分析细胞学协会”制定。
根据FSC标准，数据存储格式应包括三个文件：样本获取文件，数据设置文件和数据分析结果。
4参数（FSC，SSC，FITC和PE）的单细胞分析会生成8位数据。
当单个样品累计收集到10000个细胞时，FCS数据文件为80kB。
数据采集存储完毕后，细胞亚群可以几种不同格式显示。
单参数如FSC或FITC（FL1）可使用直方图，横轴表示荧光通道。
纵轴表示在该通道内收集到的细胞数量（如图5-1）。
处在同一通道的每一细胞均符合该通道的信号值，而且具有相同的信号密度。
通道右侧信号的荧光强度明显高于左侧，越靠右侧荧光亮度越强。
图5-1 流式数据分析图双参数可在二维散点图中同时显示，X轴显示通道1（FL1），Y轴显示通道2（FL2）。
3维图通过X，Y，Z三个轴分别显示每个通道的细胞量（如图5-1）。
习题：数据采集及显示1 在直方图中横轴和纵轴分别表示。
2 二维点图用于显示参数。
3 在CellQuest软件中3维图中Z轴代表。
5.2 设门通过设门的方法可以定义细胞亚群的区域。
如：血样本是混合细胞群，如果想单独分析淋巴球细胞，可根据FSC或细胞大小，在FSC，SSC的散点图中设门，其数据结果只反映淋巴细胞亚群的荧光特性。
图5-2 全血样本中淋巴细胞亚群的数据分析图习题：设门1 设门的方法通常用于分析样本内的指定细胞。
（对错）5.3 细胞亚群的数据分析数据分析包括从点图中的list-mode文件中显示数据,然后统计点图中的细胞分布情况。
如前所述，分别有几种形式的点图用于显示数据，而且可通过设门的方法区分指定的细胞亚群。
如图5-3所示，在淋巴细胞亚群周围设门，以单独分析或分选该亚群细胞。
图5-3 选定淋巴细胞亚群设门门内细胞的数据结果可在随后的图中显示。
流式细胞周期结果图解读(仅供参照)
流式检测细胞周期操作步骤1. 细胞培养：取对数生长期的细胞，按1×106cells/ mL以1mL接种24孔板或2mL接种于6孔板内，进行所需的处理（比如加入药物），特定时间后终止培养，进行下一步的实验。
2. 细胞固定：800rpm离心5min，收集细胞沉淀，弃上清，用预冷PBS洗涤两次，加入预冷75%乙醇，于4℃固定4h以上。
3. 细胞染色：1500rpm离心5min，弃上清，以3mL的PBS洗涤一次，加入400uL溴化乙锭（PI，50ug/mL），100ul RNase A（100ug/mL ），4℃避光孵育30min。
4. 流式分析：以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2~3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。
注：上机前要以50um尼龙网膜或35um细胞过滤器过滤细胞！因为PI具有很强的粘附性，容易使细胞聚团！流式细胞周期结果图解读1、纵坐标Cell Number：即计数的有效细胞数；2、横坐标DNA Content：即DNA含量；3、G1、G2、S三期在图中已经标示；4、右侧数字含义：Dip G1-53.84% at 55.56，即G1期DNA含量平均值为55.56；53.84%即G1期细胞数占总数的53.84%；Dip G2-5.64% at 107.72，即G2期DNA 含量平均值为107.72，5.64%即G2期细胞数占总数的5.64%；以此类推…流式细胞周期结果图的意义，主要从细胞周期的角度看各参数的意义：1、细胞周期指由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，所需的时间叫细胞周期时间。
1、细胞周期可分为四个阶段：①G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间；②S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期；③G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间；④M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。
PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡的影响因素
基本内容
、特异性和自动化程度，从而为细胞凋亡研究提供更加可靠的工具。
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解决方法：熟练掌握流式细胞仪数据分析的方法和技巧，理解细胞凋亡的生 物学过程。在数据分析中，应选择经验证的参数设置，并结合研究目的进行调整。 对于结果的解读，应结合凋亡相关文献和实验数据进行综合分析，避免主观偏见。
4、数据分析与解读
总结：使用PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡时，需要注意多个影响因素。这 些因素包括PI染料的浓度和作用时间、样本处理过程、流式细胞仪的操作和维护 以及数据分析与解读等。为了获得准确的实验结果，需要对这些因素进行严格的 控制和优化。
1、PI染料的浓度和作用时间
1、PI染料的浓度和作用时间
PI（Propidium Iodide）是一种常用的细胞凋亡染色剂，可以与DNA结合并 使其发出红色荧光。然而，PI的浓度和作用时间对实验结果有很大影响。如果PI 浓度过低，则不能有效地染色细胞；而如果浓度过高，则可能导致细胞膜通透性 改变，
基本内容
结果可以以图表形式展示，如散点图、柱状图和曲线图等，以便直观地反映 细胞凋亡状态。
基本内容
总之，流式细胞术在细胞凋亡检测中具有广泛的应用价值，可以提供快速、 准确和多参数的结果。随着生物学和医学研究的不断发展，流式细胞术在细胞凋 亡检测中的应用将不断完善和拓展。未来，随着技术的进步，流式细胞术有望实 现更高的灵敏度
第二部分：双脱氧核苷酸法
与DAPI、PMA-RPN和IBF-IP等其他几种方法相比，双脱氧核苷酸法在检测细 胞凋亡方面具有较高的灵敏度和特异性。然而，双脱氧核苷酸法操作较为繁琐， 且需要使用较多的双脱氧核苷酸，可能会增加实验成本。
第三部分：聚合酶链反应法
第三部分：聚合酶链反应法
流式细胞仪结果分析
A 淋巴细胞 B 单核细胞 C 中性粒细胞
A、B、C均 为任意门
线性门
•Region设置:
区阈（region, R）与门(gate, G ) 是两个相关的概念，区阈可 与门对应，但是也可以包含于门。
如十字门分析时，起 就可以由四个区域构 成，即 G=D1+D2+D3+D4。
Flow-count
（四）免疫检测的质控
• 同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，选用相同源性的未标记单 抗作为对照调整和设置电压，以保证特异性。
• 全程质量控制：与待测标本一起标记和检测，结果达靶值，提示本次 实验结果可靠。
第四节 在免疫学检验中的应用
流式细胞术目前已广泛地被应用于免疫学 基础研究和逐步进入临床应用各方面，用流式 细胞仪对细胞表面的抗原成分进行标记分析， 可区别多种细胞的特性，为细胞免疫的研究增 加了有效的手段和帮助。
荧光染料的特性
•激发波长(EXCITING) •发射波长(EMISSION)
荧光补偿
四、细胞分选原理
通过流式细胞仪进行细胞分选 主要是在对具有某种特征的细胞需 进一步培养和研究时进行的。
（一）分选基本原理
细胞悬液形成液流柱 压电晶体 产生机械振动
流动室振动
液流断裂成液滴
空白液滴 不充电
弃去
（一）几种常见的荧光染料
细 胞 悬 液
激光
FITC
FL1
异硫氰酸荧光素
Texas red
FL2
得州红
PE.PC.APC
FL3
藻胆蛋白类
PEcy5
FL4
能量传递复合染料
流式细胞仪分选原理
流式细胞仪分选原理
流式细胞仪分选是一种利用流式细胞仪对细胞进行快速分选的技术，其原理如下：
1. 细胞样品进样：将待分选的细胞样品通过一根细管引入流式细胞仪中。
为了确保样品中的细胞以单细胞悬浮状态进入流式细胞仪，通常需要对样品进行预处理，如细胞颗粒过滤、细胞悬浮液制备等。
2. 细胞激发：细胞进入流式细胞仪后，可通过激光束对细胞进行激发。
不同类型的流式细胞仪激光束的波长和强度可以根据不同的应用需要进行调节。
3. 光散射和荧光信号检测：细胞被激发后，会发出散射光和荧光信号。
流式细胞仪通过一组透镜和光电倍增管（PMT）对
这些信号进行检测。
在散射光信号检测中，主要有前向散射光信号（FSC）和侧向散射光信号（SSC）。
荧光信号检测则是
根据不同的细胞标记物使用不同的激光和荧光色素，通过检测荧光信号来确定不同类型的细胞。
4. 制定分选策略：根据细胞的特定参数，如大小、形状和荧光表达，可以通过设置特定的门限值和筛选条件来制定分选策略。
5. 细胞分选：根据制定的分选策略，流式细胞仪将符合条件的细胞通过电荷静电作用或压力差分选到不同的集合管中。
通常，可以通过开启或关闭电荷静电作用板上的电场或调节气泡的位置来控制细胞的分选方向。
6. 分选结果分析：将分选好的细胞进行培养、鉴定或其他实验，对细胞分选的结果进行进一步的分析和应用。
总结起来，流式细胞仪分选原理主要包括细胞样品进样、细胞激发、光散射和荧光信号检测、制定分选策略、细胞分选和分选结果分析等步骤。
流式细胞仪细胞周期图详解
1
流式细胞术检测细胞周期
1. 纵坐标Cell Number：即计数到的有效细胞数；
2. 横坐标DNA Content：即DNA量，为什么用DNA量来区别各周期
3. G1、G2、S三期在上图已经用箭头标示；
4. 右侧数字含义：Mean G1=19
5.4即G1期DNA含量平均值为
195.4；%G1=73.6即G1期细胞数占总数的73.6%；
1 G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间；
② S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期；
2 G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时
间；④ M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。
3
3、流式细胞结果图各参数的意义：
前面讲过，常用的流式细胞术分析细胞周期的方法是依据细胞DNA含量（横坐标）来分析的：
G1期：细胞DNA复制还没有开始，也是DNA含量最少的，即流式检测结果图的第一个峰；
S 期：细胞开始复制，到完成复制，是一个一倍DNA到二倍DNA的过程，在流式结果图中显示期跨度特别大（第二个不高但很宽的峰）；
G2期：DNA复制完成至分裂的一段时间，此时细胞内含二倍DNA，在流式结果图中的第二个峰；
M期：细胞分裂过程，此时细胞内也是二倍DNA，用DNA含量的方法是无法与G2期分开，所以有第三峰明显升高时报告：G2/M期阻滞。
基因组流式结果
基因组流式结果
基因组流式结果是一种通过流式技术对基因组进行检测和分析的方法。
流式技术是一种基于单细胞的分析技术，可以对细胞进行多参数、快速、高通量的检测和分析。
在基因组流式结果中，可以获得以下几个方面的信息：
1. 细胞周期：通过检测DNA的含量和倍体变化，可以了解细胞周期的变化，判断哪些细胞周期受到了阻滞。
2. 细胞凋亡：通过检测细胞碎片的面积，可以了解细胞凋亡的情况，判断凋亡细胞的比例和程度。
3. 细胞分群：通过使用不同的参数对细胞进行分类，可以将不同的细胞群区分出来，更有针对性地进行分析。
4. 基因表达：通过检测特定基因的表达水平，可以了解基因的表达情况，分析基因的功能和作用机制。
总之，基因组流式结果是一种非常有用的技术，可以对基因组进行全面、深入的检测和分析，为遗传学、肿瘤学、免疫学等领域的研究提供重要的帮助。
造血细胞分离、集落培养及表型分析
造血细胞分离、集落培养及表型分析动性好，同时也避免了细胞因受力而损伤的情况。
流式细胞仪通过激光束照射细胞，检测细胞表面标记物的荧光强度，进而分析细胞表型，包括细胞表面标志、大小、形态等。
2、集落培养集落培养法是一种常用的检测造血干细胞的方法。
将待测细胞在半固体培养基中培养，待细胞分裂形成集落后，根据集落的形态和数量来判断细胞的分化能力。
常用的集落包括粒-巨嗜细胞集落形成单位（CFU-GM）、红系爆式集落形成单位（BFU-E）、巨核细胞集落形成单位（CFU-MK）等。
集落培养法可以检测细胞的增殖能力和分化潜能，是评估细胞功能的重要方法。
二、实验步骤1、细胞样品制备将待测细胞制成单细胞悬液，使得细胞可以均匀地分布在流式细胞仪的流动室中，方便后续的细胞表型分析。
2、流式细胞仪分析将制备好的细胞悬液加入样品管中，加入特异性荧光染料后，通过流式细胞仪进行细胞表型分析。
根据细胞表面标志物的荧光强度，可以判断细胞的类型和状态。
3、集落培养将待测细胞在半固体培养基中培养，待细胞分裂形成集落后，根据集落的形态和数量来判断细胞的分化能力。
常用的集落包括粒-巨嗜细胞集落形成单位（CFU-GM）、红系爆式集落形成单位（BFU-E）、巨核细胞集落形成单位（CFU-MK）等。
三、实验结果分析通过流式细胞仪和集落培养的结果，可以分析细胞的表型和功能。
例如，CD34+、CD38-、HLA-DR-、Thy-1+、c-kit+、LFA-1-、CD45RA-、CD71-、lin-等标志物被广泛认为是造血干细胞的标志。
同时，集落培养的结果也可以评估细胞的增殖能力和分化潜能。
这些结果对于研究造血干细胞的生物学特性和临床应用具有重要意义。
本实验采用流式细胞仪技术对脐血中的造血干细胞进行分离和检测。
流式细胞仪的测量区利用样品流和鞘流的气压差的层流原理，使细胞依次排列成单行，每个细胞以均等的时间依次通过测量区。
被荧光染料染色的细胞受到强烈的激光照射后发出荧光，同时产生散射光。
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双 参 数 散 点 图 分 析
散点图
等高线图
密度图
FCM的主要测定指标：FSC, SSC, FL1, FL2, FL3 (FL4)
FCM标记方法
单标：一种单抗/tube--FL1, FSC, SSC（三参数）
双标：两种单抗/tube--FL1, FL2, FSC, SSC（四参数）
三/四标：三种单抗/tube、四种单抗/tube--FL1-FL3/4, FSC, SSC
……
1. 上机检测
单色/双色/多色样本 参数调节
电压、阈值、设门、补偿
2. 细胞分选 3. 细胞表面和胞内标志检测 4. 细胞周期(PI单染) 5. 细胞凋亡（Annexin V与PI双染）
举例：FACS Calibur可检测FL1-4四个通道的4个颜色
检测器组 所需探测器 （激光器） （PMT）位置
流式细胞仪分析细胞周期
依据细胞DNA含量（横坐标）： G1期：DNA复制还没开始，
也 是 DNA 含 量 最 少 的 ， 即 流 式 检测结果图的第一个峰；
S期：DNA开始复制，到完 成 复 制 ， 是 一 个 一 倍 DNA 到 二 倍 DNA 的 过 程 ， 在 流 式 结 果 图
中显示期跨度特别大（第二个 不高但很宽的峰）；
“设门”就是确定阳性细胞群，去除散点部分。
指在细胞分布图中，根据该图的细胞群分布选定其中
想要分析的特定细胞群（细胞基本来自于同一状态，有数据显示
1. 直方图（Histogram）
可比较性）。通过“设门”得到不同的区域，从而对 其中的细胞进行单参数或多参数分析。
设门是流式细胞仪分析中的一种重要技术，只有
颗粒杂质、气泡 对检测的影响
FSC：反映细胞相对大小及其表面积
外周全血细胞散射光双参数点图
SSC：反映颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性
（红细胞溶解后）
离线设门
在 线 设 门
对血液中淋巴细胞设门（R1）分析其免疫表型
B T
细胞分选
细胞表面标志物检测
从增殖的角度分类高等动物细胞
①连续分裂细胞，在细胞周期中连续运转因而又称为周期细胞，如表皮生发层细胞、 部分骨髓细胞。
FL1
带通/长通透镜 530/30
适用染料 FITC
488nm蓝
FL2
色激光
FL3
635nm红 色激光
FL4
585/42 670 LP 661/16
PE, PI PerCP, PerCP-Cy5.5, PE-Cy7
APC
搭配荧光素原则
1. 不同型号的流式细胞仪的同样的一个通道检测荧光素的能力是不一样的。 2. 每个通道只能选择1种荧光素。 3. 各个通道之间的荧光素可以随意搭配
1. 细胞核的改变
凋亡细胞核的改变，造成各种染色体 荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。 研究表明，用各种染色体荧光染料对经固 定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。 许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋 亡细胞的标志之一。
信号中去除任何其他的干扰荧光信号。
使用单种荧光素标记的单克隆抗体和其余荧光素
对应的同型对照抗体分别进行染色。
实验样本：自发荧光＋非特异荧光＋特异荧光
同型对照：自发荧光＋非特异荧光
单参数直方图分析
荧光峰的高低即在纵轴对 应的高度反映了具有此种 荧光强度的细胞在样本中 所占比例的相对多少，而 非绝对数目。
G2期：DNA复制完成至分
裂的一段时间，此时细胞内含 二 倍 DNA ， 在 流 式 结 果 图 中 的 第三个峰；
M期：细胞分裂过程，此 时 细 胞 内 也 是 二 倍 DNA ， 用 DNA含量的方法是无法与G2期
分开，所以有第三峰明显升高 时报告：G2/M期阻滞。
流式细胞仪检测细胞凋亡
细胞凋亡会产生特征性改变，包括细胞核、细胞器、细胞膜成分和细胞形态等的改 变，其中细胞核的改变最具特征性。
流式细胞仪的检测范围
细胞结构
• 细胞大小 • 细胞颗粒度 • 细胞表面积 • 核浆比例 • DNA含量与细胞周期 • RNA含量 • 蛋白质含量 • ……
细胞功能
• 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原 • 细胞活性 • 细胞内/外的细胞因子 • 激素结合位点、细胞受体 • 蛋白磷酸化 • pH值 • 钙离子浓度 • 细胞膜电位、线粒体膜电位
流式抗体荧光标记搭配
将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，区别经这些特殊处理发生选 择性凋亡的淋巴细胞亚型以及活细胞的分类。
由流式细胞仪能检测多少个通道（由有多少激光以及每激光的功能决定的）、需 要同时检测多少个指标、厂家的抗体有多少种荧光标记等决定。
不推荐APC和PE-Cy5一起使用，上流式以后，容易导致补偿过度。 推荐使用Alex Fluro488和Alex Fluro647。因为这些荧光非常明亮，对激光非常稳定 ，适合流式细胞仪的光谱性质，对PH值不敏感，具有水溶性。此外，他们联合使用时 发射光谱存在巨大差异，无需补偿。
2. 二维点图（Dot Plot）
通过最佳的设门方式，才能准确地获取和分析。包括
3. 等高线图（Contour Plot） 在线设门和离线设门。
4. 密度图（Density） 5. 三维图（3D Plot）等
补偿对照（双色或多色分析中，荧光素发射光谱 重叠时）荧光补偿是指在流式细胞多色分析中，纠正
荧光素发射光谱重叠的过程，即从一个被检测的荧光
②休眠细胞暂不分裂，但在适当的刺激下可重新进入细胞周期，称G0期细胞，如淋 巴细胞、肝、肾细胞等。
③不分裂细胞，指不可逆地脱离细胞周期，不再分裂的细胞，又称终端细胞，如神 经、肌肉、多形核细胞等等。
不同类型细胞的G1长短不同，是造成细胞周期差异的主要原因。细胞周期的时间长 短与物种的细胞类型有关。
G1 期 (gap1) ； S 期 (synthesis phase) ； G2 期 (gap2) ； M 期 又 称 D 期 (mitosis or division)
分析时，使用FL2-w和FL2-A显示。 FL2-A是指荧光峰面积，反映了细胞DNA含量（前 提是用Rnase处理去除RNA）； , FL2-H是指荧光峰的脉冲高度；FL2-W是指检测荧光峰的脉 冲宽度，该值通常在做细胞周期分析时应用, 用于去除粘连细胞。
流式测细胞周期，一般分为G0/G1,S,G2/M期三部份，如果有凋亡，在G0/G1期前面有个凋 亡峰(也称sub-G0期)，而如果分析时细胞窗口没设置好，可能在最前面还有细胞碎片峰。