牙鲆经注射和浸泡免疫鳗弧菌灭活疫苗后7种免疫相关基因表达的变化_宋晓青

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中国水产科学
第 21 卷
杀 鲑 气 单 胞 菌 (Aeromonas salmonicida) 疫 苗 后 , 大西洋鲑 (Salmo salar)肾与肝 IL-1β、 TNFα 及 IL-8 基因的表达均有不同程度的变化
[13]
头肾、鳃 3 种组织用于检测比较 7 种免疫相关基 因表达的变化及差异。 1.4 RNA 的提取及 cDNA 的合成 取各组织样品约 20 mg, 应用 Trizol 法提取总 RNA, 1%琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的完整性 , 以 微量核酸测定仪 (NanoDrop 8000, Thermo, 美国 ) 测定 RNA 的浓度和纯度。提取的 RNA 利用反转 录 试 剂 盒 (Applied Biosystems) 经 RT-PCR 合 成 cDNA。所得 cDNA 样品 –20℃保存 , 备用。 1.5 荧光定量 PCR 所用引物的设计与验证 根据已知的牙鲆核糖体 RNA(18S RNA)、 白介 素(IL)-1β、肿瘤坏死因子 (TNF)α 、主要组织相容 性复合体 (MHC)Ⅰα、 MHCⅡα、 T 细胞表面受体 CD4-1、 T 细胞表面受体 CD8α、 免疫球蛋白 (Ig)M 基因序列 , 采用 Primer Premier 5.0 软件设计各基 因特异性引物 , 随机选取对照组的脾、头肾、鳃 的 cDNA 样品 , 进行 PCR 扩增 , 经琼脂糖凝胶电 泳检测, 选择产物为单一条带的引物, 利用 SYBR® Premix Ex Taq 试剂盒 (Takara)在荧光定量 PCR 仪 (Light Cycler® 480ⅡPCR, Roche, 德国 )上 进行扩增 , 最终以扩增反应产生的熔解曲线是单 一波峰的引物作为荧光定量 PCR 的特异性引物。 1.6 荧光定量 PCR 检测 将所有取样组织 cDNA 样品浓度调为一致 , 以 18S RNA 为内参 , 利用 SYBR® Premix Ex Taq 试剂盒在 Light Cycler® 480ⅡPCR 上进行扩增 , 扩增体系为 20 μL, 即 : 模板 cDNA 2 μL, 正反向 引物各 0.4 μL(引物浓度为 10 μmol/L), 反应混合 液 10 μL, 无菌水 7.2 μL。 每个样品设置 3 个平行 , 扩增的条件为 : 95℃ 30 s, 1 个循环 ; 95℃ 10 s, 60℃ 30 s, 45 个循环; 95℃ 5 s, 60℃ 1 min, 95℃ 5 s, 1 个循环 ; 40℃冷却。再次确认每个样品扩增反应 产生的熔解曲线是单一波峰 , 并获取 Ct 值 , 用于 数据处理及分析。 1.7 数据处理及分析 荧光定量 PCR 所得数据按照 2Ct 法进行处 利 理 , 所有数值均用平均值 ±标准差 ( x ±SD)表示。 用 Origin 8.0 软件作图 , SPSS19.0 软件进行数据统 计分析 , 采用单因子方差 (one-way ANOVA) 分析
8 8
CFU/mL 灭活疫苗菌液中 , 连续充气浸泡 30 min; 最后一组海水充气养殖 , 作为空白对照。处理后 于 0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、 7 d、 14 d 分别随机在各组取 5 尾牙鲆 , 分别取脾、
第4期
宋晓青等 : 牙鲆经注射和浸泡免疫鳗弧菌灭活疫苗后 7 种免疫相关基因表达的变化
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不同时间点基因表达量的差异 , 以 P<0.05 作为差 异显著的标准。
下降 , 至 14 d 与对照组无显著差异 (P<0.05); 浸 泡组 IL-1β 的表达量自 4 h 起显著高于对照组 (P<0.05), 48 h 达到最高值 , 是对照组的 18.79 倍 , 而后逐渐下降, 至 7 d 与对照组无显著差异 (P<0.05, 图 1B); 鳃中 , 注射组 IL-1β 的表达量自 4 h 起显著高于对照组 (P<0.05), 之后快速上升 , 24 h 达到最高值 , 是对照组的 5.58 倍 , 之后逐渐 下降 , 至 14 d 与对照组无显著差异 (P<0.05); 浸 泡组自 4 h 起显著高于对照组 (P<0.05), 之后快 速上升 , 12 h 达到最高值 , 是对照组的 4.91 倍 , 之 后 逐 渐 下 降 , 至 14 d 与 对 照 组 无 显 著 差 异 (P<0.05, 图 1C)。在注射组的脾和头肾中 , IL-1 β 基因转录水平显著高于浸泡组, 且最高值出现 时间早于浸泡组, 但鳃中该基因表达量最高值 出现时间晚于浸泡组 , IL-1 β 表达量及表达趋势 呈现出组织差异性。 2.3 TNF α 在脾、头肾和鳃中的表达 TNF α 在 3 种组织中的表达量都较低 , 峰值 均为对照组 2~3 倍。脾中 , 注射组 TNF α 自 8 h 起显著高于对照组 (P<0.05), 24 h 达到最高值 , 而 后 逐 渐 下 降 , 至 96 h 时 与 对 照 组 无 显 著 差 异 (P<0.05); 浸泡组 TNF α 的表达量自 12 h 起显著
接种疫苗是防治鱼类细菌性、病毒性疾病的 有效方法 , 且疫苗具有无污染、无残留且不易引 目前 , 对于疫苗免疫方式的研 起耐药性等优点 。 究主要集中在注射、浸泡、口服等 水平变化
[2, 5−6] [2 −4] [1]
增 殖 等 的 关 键 因 子 [10]; 主 要 组 织 相 容 性 复 合 体 (MHC) MHCⅠ、 MHCⅡ、 T 细胞表面受体 CD4 和 CD8、免疫球蛋白 (Ig)M 等则在病原入侵鱼体 后的抗原递呈、识别及免疫应答的各个阶段起到 关键作用 , 以上因子参与一系列的应答反应 , 在 清除病原体、维护机体健康的过程中发挥重要作 用。有研究发现 , 浸泡免疫爱德华氏菌 (Edwardsiella tarda)后 , 牙鲆 (Paralichthys olivaceus)肝中 IL-1β、IL-6 基因的表达量显著上调 [11]; 浸泡免疫 鳗弧菌 (Vibrio anguillarum) 灭活疫苗后 , 大菱鲆 (Scophthalmus maximus)7 种组织中多聚免疫球蛋 白受体基因的表达均呈现显著上调 [12]; 注射免疫
中国海洋大学 水产动物病害与免疫学研究室 , 山东 青岛 266003 摘要 : 制备鳗弧菌 (Vibrio anguillarum) 全菌灭活疫苗 , 采用腹腔注射和浸泡两种方式分别免疫牙鲆 (Paralichthys
olivaceus), 于免疫后 0 h、 4 h、 8 h、 12 h、 24 h、 48 h、 72 h、 96 h、 7 d、 14 d 分别取牙鲆脾、头肾、鳃 3 种组织 , 提取 mRNA, 应用实时荧光定量 PCR 法检测 3 种组织中白介素 (IL)-1β、肿瘤坏死因子 (TNF)α、主要组织相容性复 合体 (MHC)MCHⅠ、MHCⅡ、T 细胞表面受体 CD4、T 细胞表面受体 CD8、 免疫球蛋白 (Ig)M 7 种免疫相关基因 的表达。结果显示 , 两种方式免疫后各基因表达量均出现显著上调。注射组 3 种组织中 , IL-1β、TNFα 基因的表达 高峰出现时间在 12~24 h, MHCⅠ、MHCⅡ、CD4、CD8 的表达高峰出现在 48~72 h, IgM 的表达高峰出现在免疫后 7 d, 各基因表达量最高值是对照组的 2~70 倍 ; 浸泡组 3 种组织中 , IL-1β、 TNFα 基因的表达高峰出现在免疫后 12~48 h, MHCⅠ、 MHCⅡ、 CD8 表达高峰出现在 48~96 h, 但 CD4 在头肾和鳃中表达高峰出现在 72 h, 在脾中表 达高峰出现在 7 d, IgM 在鳃中表达高峰出现在 96 h, 在脾和头肾中表达量在 14 d 内逐渐上升 , 各基因表达最高值 是对照组的 2~20 倍。结果表明, 注射组各组织基因的转录水平均高于浸泡组, 且脾、头肾中表达量最高值出现时间早 于浸泡组, 但鳃中各基因峰值出现时间晚于浸泡组。研究结果为疫苗的免疫途径及免疫效果评价提供了基础数据。 关键词 : 牙鲆 ; 鳗弧菌疫苗 ; 注射免疫 ; 浸泡免疫 ; 免疫相关基因 中图分类号 : S917 文献标志码 : A 文章编号 : 10058737(2014)040747012
收稿日期 : 2014-01-17; 修订日期 : 2014-03-31. 基金项目 : 国家 973 计划项目 (2012CB114406); 国家自然科学基金项目 (31172429); 国家科技支撑计划项目 (2012BAD17B02). 作者简介 : 宋晓青 (1987–), 女 , 硕士研究生 , 研究方向为水产动物病害与免疫 . E-mail: sxq116119@163.com 通信作者 : 邢婧 , 教授 . E-mail: xingjing@ouc.edu.cn
方法上 , 对
于免疫效果的评价除了通过鱼类血清及黏液抗体 、免疫相关酶 (超氧化物歧化酶、溶
[3, 7]
菌酶、 碱性磷酸酶等)活性 呼吸爆发 、补体活性
[7]
、 淋巴细胞数量
[3, 5−6]
、
[7−8]
等指标来判定外 , 从基
因水平对疫苗免疫效果进行研究也越来越受到关 注。鱼类前炎性细胞因子如白介素 (IL)-1β、肿瘤 坏死因子 (TNF)α, 趋化因子是引起炎症反应 , 诱 导免疫细胞迁移 , 免疫调节 , 刺激 T 细胞、 B 细胞
; 注射免疫爱
德华氏菌减毒疫苗后 , 斑马鱼 (Danio rerio) 脾中 IL-1β、 TNFα、 MHCⅠ、 MHCⅡ、 CD4、 IgM 等 20 种免疫相关基因的 mRNA 表达量呈现上调或 下调的趋势
[14]
。这些研究结果均表明疫苗免疫能
引起鱼类诸多免疫相关基因的快速变化。本研究 通过制备鳗弧菌 (Vibrio anguillarum) 全菌灭活疫 苗 , 经注射和浸泡两种途径免疫牙鲆 , 利用荧光 定量 PCR 法研究免疫后牙鲆脾、头肾、鳃 3 种组 织中 IL-1β、TNFα、MHCⅠ、MHCⅡ、CD4、CD8 和 IgM 7 种免疫相关基因表达的动态变化 , 从基 因水平比较注射和浸泡两种方式对牙鲆免疫应答 的影响 , 以期为疫苗免疫方式的选择提供依据 , 也为牙鲆免疫相关基因的分子研究积累数据。
2
2.1
结果与分析
荧光定量 PCR 所用引物的获得 经过常规 PCR- 琼脂糖凝胶电泳及荧光定量
PCR 熔解曲线验证 , 最终获得 8 种基因的特异性 引物 , 各基因引物名及引物序列、退火温度等信 息见表 1。 应用特异性引物进行荧光定量 PCR, 所 有检测样品的扩增结果均为单一产物。 2.2 IL-1β 在脾、头肾和鳃中的表达 两处理组 IL-1β 基因在 3 种组织中的表达均 呈现先上升后下降的趋势。脾中 , 注射组 IL-1β 基因的表达量自 4 h 起显著高于对照组 (P<0.05), 之后快速上 升 , 12 h 达到最高值 , 是对照组的 72.95 倍 , 而后逐渐下降 , 至 7 d 与对照组无显著 差异 (P<0.05); 浸泡组 IL-1β 的表达量自 4 h 起显 著高于对照组 (P<0.05), 24 h 达到最高值 , 是对照 的 11.56 倍 , 而后逐渐下降 , 至 96 h 与对照组无显 著差异 (P<0.05, 图 1A); 头肾中 , 注射组 IL-1β 基 因的表达量自 4 h 起显著高于对照组 ( P <0.05), 24 h 达到最高值 , 是对照组的 69.17 倍 , 而后逐渐
1
1.1
材料与方法
实验动物 牙鲆购自山东日照某牙鲆养殖场, 体长为
10~13 cm, 实验前于水槽中暂养 1 周 , 水温 20~ 22℃, 连续充气。 1.2 鳗弧菌全菌灭活疫苗的制备 鳗弧菌 (Vibrio anguillarum) 由本实验室保存 , 将菌种接种于 2216 E 固体培养基中 , 28℃培养 24 h, 挑取单菌落至 2216 E 液体培养基中震荡培养 24 h, 之后 , 6 000 g/min 4℃ 离心 15 min, 去上清 液 , 无菌磷酸盐缓冲液 (PBS, pH7.4)清洗沉淀 3 次 , 最后以含 0.5%甲醛 (v/v)的 PBS 重悬 , 4℃放置 48 h, 平板培养检测无活菌存在 , 再以 PBS 离心洗涤 3 次 , 4℃保存备用。 1.3 牙鲆的免疫及取样 将暂养后的牙鲆随机分为 3 组 , 每组 60 尾。 一组腹腔注射浓度为 1×10 CFU/ mL 的鳗弧菌灭 活疫苗 , 每尾 0.1 mL; 一组浸泡于浓度为 1×10
中国水产科学 2014 年 7 月 , 21(4): 747758 Journal of Fishery Sciences of China DOI: 10.3724/SP.J.1118.2014.00747
研究论文
牙鲆经注射和浸泡免疫鳗弧菌灭活疫苗后 7 种免疫相关基因表达 的变化
宋晓青, Βιβλιοθήκη Baidu婧, 战文斌