酶与酶工程实验

暨南大学本科实验报告专用纸

课程名称酶与酶工程实验成绩评定

实验项目名称从植物材料中提取过氧化氢酶指导教师李任强

实验项目编号实验项目类型实验地点

学生姓名郑子豪学号 2010052045

学院生命科学技术学院系生物工程学专业生物技术

实验时间2012年9月20日下午~ 9月27日下午温度 25 ℃湿度

一实验目的

1.1 学习从植物材料中制备过氧化物酶的方法。

1.2 了解纯化酶的一些基本步骤。

1.3 掌握酶含量与活性测定的方法。

二实验原理

过氧化物酶是一类以铁卟啉环为辅基的氧化酶，可溶于水，溶解度约为5％（w/v)，溶液棕色透明，许多植物如辣根、柑橘叶子、白萝卜等含有较多的过氧化物酶，在这些植物材料的溶出物中，加入不同浓度的硫酸铵进行分段盐析，由于该酶可溶于0.58饱和度以下的硫酸溶液，而在0.62饱和度以上则不溶，可由此对过氧化物酶进行粗提，然后用有机溶剂沉淀、结晶等方法可对该酶进行纯化、得到较纯的制品。过氧化物酶能催化愈创木酚瓜产生有色物质，以此可用分光光度计测其含量及活性，对实验结果进行检测。

三实验器材

3.1材料：新鲜柑橘叶

3.2试剂：愈创木酚、0.2mol/l磷酸缓冲液、0.004％过氧化氢、硫酸铵

3.3仪器：高速组织捣碎机、冰箱、紫外可见分光光度计、离心机

四实验步骤

4.1粗酶提取液的制备

取新鲜柑橘叶剪碎后用捣碎机捣烂（加少许纯净水使总体积少于200ml),转移到500ml烧杯中（冰浴）加水至200ml，于冰箱中浸提约1小时（中间多次搅动）。

4.2第一次盐析纯化

上述样品经多层纱布挤压过滤后以4000r/min离心15min，10ml上清液用来测酶活力，其余上清液测体积后按226g/l加硫酸铵盐析，冰箱中静置半小时以上。

4.3第二次盐析纯化

以上上清液以4000r/min离心15min后去沉淀，再按258g/l加硫酸铵盐析，冰箱中静置。

4.4透析去盐

离心收集沉淀，用水溶解至约10ml，用水透析去盐，离心去沉淀，取部分酶液稀释后测活力，其余酶液用作精制样品。

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4.5第一次丙酮纯化

在搅动下沿着杯壁加入一倍体积预冷（-15℃）的丙酮于酶液中，混匀，静置10min，低温离心（8000r/min,4℃) 去沉淀。

4.6第二次丙酮纯化

按上清液与丙酮之比为1: 0.8 ，再次加入预冷丙酮，静置10min 后离心（8000r/min,4℃),收集沉淀，溶于少量水中。

4.7透析去丙酮

将上述样液透析去丙酮，然后测定其酶活力，最后冷冻干燥酶液得较纯的酶制品。

4.8酶活性测定方法

按下表于试管中加入试剂（ml):

在37℃保温10min，管1作为对照在时间扫描470nm调好零点，混合管2与3，即倒入比色杯中进行470nm的时间扫描，读取30s或60s时（直线部分）的OD值，测定OD280和OD260，计算出蛋白含量。以OD470/毫克蛋白质×分表示酶比活和以OD470/克鲜重×分表示酶活性。

五数据处理

5.1 数据记录

5.1.1 新鲜柑橘叶30.11 g , 得到粗酶提取液V= 225.00 ml

5.1.2 第一次盐析中，除去10 ml用于测活后：

实际加入硫酸铵48.59 g

5.1.3 第二次盐析中，上清液V= 242.00 ml

实际加入硫酸铵62.43 g

5.1.4 沉淀经溶解透析后为11.00 ml,其中1.00 ml用于测活，其余经丙酮沉淀纯化：

第一次丙酮沉淀：样品V= 10.00 ml 丙酮V’= 10.00 ml

第二次丙酮沉淀：样品V= 17.30 ml 丙酮V’= 13.84 ml

最后沉淀溶于2.50 ml水中

5.1.5 酶活性和酶含量测定结果：

5.2 数据计算与分析

5.2.1 数据计算.含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的

经验公式，即可算出蛋白质的浓度,蛋白质浓度=1.45×A280－0.74×A260(mg/ml)。而蛋白质含

量(mg/ml)= 蛋白质浓度×稀释倍数。而酶的比活=OD470/(毫克蛋白质×min) ,克鲜重=新鲜柑橘

叶质量/粗酶提取液V ,活性= OD470/(克鲜重×min) 。

经计算:

总纯化倍数=纯化后酶比活/粗酶酶比活=46.62/0.2706=172.28,

总活性回收率=纯化后酶活性/粗酶酶活性=11.52/84.77=0.1359。

5.2.2 结果分析.

经实验证明,本次提取的酶具有活性.而本实验的纯化倍数达172.28倍,纯化效果良好.而总活性回收率为0.1359,酶活性下降说明在操作过程中有大部分的酶损失或失活,而这些损失或失活有可能是在离心或盐析的过程中造成的.另一方面,本实验是通过使用紫外分光光度计来测定酶和蛋白质的浓度的,随着纯化和浓缩的进行,样品中的杂蛋白也在不断被除去,这也是导致溶液OD值大幅降低的重要原因,同时它也在酶活性下降的结果中体现出来。

通过实验的结果来比较盐析和丙酮沉淀的纯化效果,不难看出,丙酮沉淀法的纯化效果更好,但其活性回收率则比盐析法要低,说明两种方法的优点各异,若要得到纯度高的酶制剂,则应选用丙酮沉淀法提纯;而若要得到活性高的酶制剂,则应选用硫酸铵等盐进行分段盐析。

六思考题

6.1纯化前后酶比活的变化说明了什么?

答:纯化后酶比活的提高说明单位质量的酶蛋白在一分钟内使OD470增大的能力提高了,也就说明了纯化后的酶制剂的纯度更高。单位质量酶制剂的酶浓度提高了,酶制剂的效价就提高了。

6.2 纯化前后酶活性(OD470/克鲜重×min)的变化又说明什么?这些数据有何意义?

答:纯化后酶活性在不断下降,说明纯化的过程中大部分杂蛋白都被除去了,而酶也有部分被除去或在纯化过程中失活,从而使0D260和0D280下降.这些数据的意义在于,显示一次纯化过程的效果,即杂蛋白去除效果和活性酶的保留效果。