ClonExpress一步法定向克隆无缝克隆试剂盒说明书
无缝克隆说明书+原理+实例
HB-infusion TM 无缝克隆试剂盒使用说明（基于Gibson Assembly 原理，原理附后）一、产品简介HB-infusion TM 无缝克隆试剂盒是一种新型、快速并且高效的Gibson Assembly DNA 定向克隆技术，可以在任意载体的任意位置一次插入多个目的基因片段。
HB-infusion TM 无缝克隆试剂盒操作极其简单，仅需在载体的克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR 引物的5’端引入与载体克隆位点两端完全一致的15~25 bp 同源序列（图1，图3）。
将上述线性化的克隆载体和带有同源序列的PCR 片段按合适比例混合，并加入HB-infusion TM Master mix，通过反应体系中DNA 外切酶、DNA 聚合酶以及连接酶的在50℃反应20 min 即可快速完成定向克隆，阳性率几近100%。
图1. HB-infusion TM 快速克隆试剂盒原理示意图。
1. 线性化目的载体（左上）；2. PCR 获取目的片段。
设计的引物５’需要和线性化载体末端有15~25 bp 的重叠（图中蓝色和黄色片段，细节可参考图3）；3. 按照一定比例把二者混合在HB-infusion TM 的2预混液内，50 C 反应20 min 后直接转化E.coli 即可。
二、HB-infusionTM 试剂盒的优点1. 相比于传统的同源重组的无缝克隆方法进行，HB-infusion TM 试剂盒更高效，操作更简单，只需要一次反应即可完成定向克隆；2. 对酶切位点无要求，可以把目的片段插入到任意载体的任意位点；3. 连接片段之间不会引入任何其他序列；4. 可以同时克隆多个片段。
三、产品包装产品组成使用次数体积2 x HB-infusion TM Master mix 20 tests 200 lPositive linearized pUC vector （250 ng） 5 tests 25 lPositive control insert (500 ng) 5 tests 25 l储存条件-20 ℃四、使用说明汉恒生物建议2-3 个片段连接时，DNA 片段的使用总量为0.02~0.5 pmols，4~6 片段连接时加入的DNA 总量为0.2~1.0 pmols。
无缝克隆试剂盒原理
无缝克隆试剂盒原理小伙伴们！今天咱们来唠唠无缝克隆试剂盒这个超酷的东西，它的原理就像一场奇妙的分子拼接魔法呢！咱先得知道啥是无缝克隆。
你可以把基因想象成一个个小积木块，无缝克隆就是要把这些小积木块按照咱们想要的方式组合起来，还不能有那种难看的“缝隙”，就像搭乐高积木，要搭得严丝合缝。
那无缝克隆试剂盒是怎么做到的呢？这里面的关键就是一种特殊的酶啦。
这种酶就像是一个超级灵巧的小工匠。
它能够识别咱们要拼接的基因片段的末端。
这些基因片段的末端可不是随随便便的哦，它们经过了特殊的处理。
比如说，有的是平末端，有的是粘性末端，就像不同形状的小榫头和榫眼。
酶就像能看透这些形状一样，它找到合适的片段，然后把它们拉到一起。
这个酶在工作的时候啊，特别聪明。
它不会像那种笨手笨脚的工人一样，把片段乱拼一气。
它会按照一定的顺序，把咱们想要的基因片段一个一个地连接起来。
就好像它心里有一张设计图似的。
比如说，我们想要把基因A、基因B和基因C按照A - B - C的顺序拼接起来。
这个酶就会先找到基因A的末端和基因B的起始端，把它们完美地连接起来，然后再把基因B的末端和基因C的起始端接上。
而且哦，无缝克隆试剂盒还有个很厉害的地方。
它在连接这些基因片段的时候，能够让连接的地方看起来就像原本就是那样的，没有那种多余的东西。
这就好比你缝衣服，缝完了之后，线脚都看不出来，衣服就像一体成型的一样。
在基因拼接里，这就意味着没有那些额外的碱基序列，不会影响基因后续的表达。
你看啊，这个试剂盒里的各种成分就像一个小团队一样。
酶是那个主力的工匠，负责拼接。
还有其他的一些成分呢，就像是助手。
它们有的负责保护基因片段，不让它们在拼接的过程中被破坏。
就像给这些小积木块套上一个保护罩，在运输和拼接的过程中都安安全全的。
还有的成分像是一个小监工，确保整个拼接的过程都是按照正确的方向进行的。
从本质上讲，无缝克隆试剂盒利用了生物分子之间那种精确的相互作用。
它就像是利用了基因片段之间的一种天然的“吸引力”，只不过这种吸引力是通过酶和其他成分来精确调控的。
ClonExpress One Step Cloning一步法定向克隆无缝克隆讲座
Vector with One Insertion Design specialized primers Amplify your insertion by PCR Linearize your cloning vector Mix them and react for 30 min Transform 3.5 hr over all
Vector with Multi Insertions Design specialized primers Amplify your insertion by PCR Linearize your cloning vector Mix them and react for 30 min Transform
BamHI (1794) SalI (596) SalI (355) Eco RI (16) Xho I (347) Xho I (1424) SalI (1473) SalI (1965) SalI (2220) Xho I (2381)
ORF
ORF
2514 bp
Poor sites for digestion: buffer choice Poor sites for ligation: blunt-sticky ends ligation
First and most important thing: Select you cloning site GC content/repeat sequence 40-60%/try to avoid
Vector with One Insertion Design specialized primers Amplify your insertion by PCR Linearize your cloning vector Mix them and react for 30 min Transform
汉恒生物无缝克隆试剂盒使用说明(附原理)
汉恒生物无缝克隆试剂盒使用说明(附原理)HB-infusion TM无缝克隆试剂盒使用说明（附原理说明）一、产品简介HB-infusion TM无缝克隆试剂盒是一种新型、快速并且高效的Gibson Assembly DNA定向克隆技术，可以在任意载体的任意位置一次插入多个目的基因片段。
HB-infusion TM无缝克隆试剂盒操作极其简单，仅需在载体的克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR引物的5’端引入与载体克隆位点两端完全一致的15~25 bp同源序列（图1，图3）。
将上述线性化的克隆载体和带有同源序列的PCR片段按合适比例混合，并加入HB-infusion TM Master mix，通过反应体系中DNA外切酶、DNA聚合酶以及连接酶的在50℃反应20 min即可快速完成定向克隆，阳性率几近100%。
图1. HB-infusion TM快速克隆试剂盒原理示意图。
1. 线性化目的载体（左上）；2. PCR获取目的片段。
设计的引物５’需要和线性化载体末端有15~25 bp的重叠（图中蓝色和黄色片段，细节可参考图3）；3. 按照一定比例把二者混合在HB-infusion TM的2⨯预混液内，50︒C反应20 min后直接转化E.coli即可。
二、HB-infusionTM试剂盒的优点1. 相比于传统的同源重组的无缝克隆方法进行，HB-infusion TM试剂盒更高效，操作更简单，只需要一次反应即可完成定向克隆；2. 对酶切位点无要求，可以把目的片段插入到任意载体的任意位点；注：1. 为了降低载体自连背景，提高阳性率，建议采用双酶切载体质粒。
酶切最好能切出一个较大片段，这样回收的目的条带可以和没有切开的质粒明显分开。
2. 质粒单酶切容易造成载体切割不完全和自连，导致假阳性的产生。
因此，必须单酶切的时候建议延长酶切时间并脱磷处理（酶切2h-过夜，CIP处理20 min），同时做好空载的对照。
3. 请务必跑胶回收线性化的载体，否则非线性化质粒会带来极高的背景。
诺唯赞同源重组试剂盒说明书
诺唯赞同源重组试剂盒说明书同源重组试剂盒是一种简单、快速并且高效的DNA定向可将插入片段PCR 产物定向克隆至任意载体的任意位点。
将载体在克降位点进行线性化并在插入片段PCR物5端引入线性化克隆载体未端序列，使得插入片段PCR产物5和3最未端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列(15bp~20bp)。
这种两端带有载体末端序列的PCR 产物和线性化克隆载体按一定比例混合后，在Exnase的催化下，仅需反应30min即可进行转化完成定向克隆。
克隆阳性率可达95%以上。
产品优点-简单、快速、高效~适用于向几乎任何载体在任何位点进行定向克隆无需考虑插入片段自身携带的酶切位点可高效克隆50bp~10kb片段不依赖于连接酶及磷酸酶，克隆阳性率可达95%以上线性化克隆载体和PCR产物可不进行纯化直接克隆应用范围快速克隆~高通量克隆~无缝克隆-DNA定点突变>产品保存本产品应置于-20°C储存，使用过程中尽量避免反复冻融。
>实验方案1实验流程概览(1）线性化克隆载体制备(2)插入片段扩增物设计(3)插入片段PCR扩增(4)进行重组反应(5).反应产物转化、涂板(6)克隆鉴定2制备线性化载体选择合适的克隆位点，并对克隆载体进行线性化。
我们推荐您尽量选择无重复序列且GC 含量均匀的区域进行克隆。
当载体克隆位点上下游20bp 区域内GC含量均在40%~60%范围之内时，重组效率将达到最大。
克隆载体线性化方式可以为限制性内切酶酶切消化也可以为反向PCR扩增。
A线性化克隆载体由酶切制备双酶切线性化：线性化完全转化背最（假阳性克隆）低。
推荐使用。
单酶切线性化：线性化程度较差，可适当延长酶切时间以降低转化背景。
注：本产品无DNA连接酶，不会发生载体自连反应，因此，即使是以单酶切方式制备的线性化载体也无需进行未端脱磷酸处理。
重组产物转化后出现的假阳性克隆（无插入片段）是由未线性化环状载体转化而形成的。
Fast-Fusion
Fast-Fusion™克隆试剂盒使用说明书快速有效地进行PCR产物克隆Cat.No.FF001(20reactions)Cat.No.FF002(50reactions)GeneCopoeia,Inc.广州易锦生物技术有限公司广州高新技术产业开发区广州科学城掬泉路3号广州国际企业孵化器F区8楼邮编：510663电话：4006-020-200邮箱：******************网址：©2022GeneCopoeia,Inc.Fast-Fusion™克隆试剂盒使用说明书I.产品介绍II.组分与储存方法III.关键步骤IV.克隆及转化V.常见问题VI.附录VII.使用限制与质量保证I.产品介绍Fast-Fusion™克隆试剂盒为PCR产物克隆提供了一种快速有效的方法，只需在室温条件（25℃）下反应15分钟，任何PCR产物片段都能克隆到线性化载体上。
经过简单纯化的PCR产物片段或者其他纯化的DNA片段能够与载体DNA末端的重叠序列融合链接（见图1）。
单个Fast-Fusion™克隆反应能够同时融合多达3个DNA片段。
预处理好的载体克隆阳性率几乎达到100%。
利用本产品进行克隆连接无需限制性酶切位点，这项优势使得载体上的任何位点都可用于插入外源片段。
线性化载体可通过PCR或者限制性酶切准备，PCR产物片段可通过Taq DNA聚合酶或其他高保真DNA聚合酶扩增获得。
图1.利用Fast-Fusion™Cloning Kit将单个PCR片段插入线性化载体的流程图技术原理Fast-Fusion™克隆试剂通过两个同时进行的步骤对同源片段进行重组：a.同源性识别；b.链置换和闲置链的降解。
重组后双链产生的缺口，在转化大肠杆菌后被细菌内部的酶修复，得到完整的质粒。
产品优势●快速简便——1分钟操作时间，15分钟室温反应；●适用性强——无需特定的限制性酶切位点或重组位点，PCR或酶切产物都可克隆；●无缝克隆——不附加任何多余碱基序列；●灵活多变——一步完成多片段融合，多点突变易如反掌；●高效率高通量——转化简单，阳性率高达90%以上。
ClonExpress
使用说明书Version 22.101/产品概述 02/产品组分03/保存条件04/适用范围05/自备材料06/注意事项07/实验原理与流程概要08/实验流程08-1/线性化载体制备08-2/插入片段获得08-3/线性化载体与插入片段的使用量08-4/重组反应08-5/重组产物转化08-6/重组产物鉴定09/常见问题与解决方案.....................................................................................................02 .................................................................................................... 02.................................................................................................... 02..................................................................................................... 02.................................................................................................... 02.................................................................................................... 03.................................................................................. 04.................................................................................................... 04.. (04) (04) (06) (07) (07) (07).................................................................................. 09目 录 Contents*所有商标均属于各自商标所有者的财产。
一步法无缝克隆试剂盒适用单片段
版本号:2018-03-20
一步法无缝克隆试剂盒（适用单片段）
SE 2×Seamless Cloning Mix
(目录号：ZC231)
·快速
·简单
·高效
·无缝
·定向
一步法无缝克隆试剂盒（适用单片段）
■ 产品组成
试剂盒组成 SE 2×Seamless Cloning Mix 保存：-20℃至少保存1年。
■ 操作步骤
A. 载体制备--线性化处理 1. 酶切法： 选取合适的位点，单酶切或双酶切皆可，但是单酶切容易导致载体自 连，载体线性化不彻底容易导致假阳性的产生。为了降低自连背景，提高阳性率，建议 采用双酶切，而且对酶切后的载体进行割胶纯化。 注： 一步法无缝克隆反应体系内无双链DNA连接酶，不会发生载体自连反应。因 此，即使是以单酶切方式制备的线性化载体也无需进行末端脱磷酸处理。重组产物转化 后出现的假阳性克隆 (无插入片段) 是由酶切不完全未线性化环状载体转化而形成的。 我们推荐酶切后胶回收可以把这种未线性化载体比例降低到最低程度。 2. PCR法 选取合适的位点，设计正向和反向引物，建议采用高保真的DNA聚合酶 扩增。 注：以质粒为模板的PCR来源线性载体（PCR产物）纯化前用Dpn I内切酶消化质 粒模板，可以降低背景，提高阳性率。但是一般情况下，经过胶回收已经足以把这种未 线性化载体比例降低到最低，因此PCR来源的线性化载体我R仪中放置30分钟，然后转移到冰上。 3. 立即进行感受态细胞转化实验，剩余反应液可保存在-20 ℃待用。 注意事项： *本试剂盒连接效率较低，为了得到更多的克隆数，感受态转化效率需＞108 Cfu/ug DNA,如果效率不够会影响实验效果。 *大片段载体和基因，可以提高载体和目的片段的量。 本试剂盒不适用多片段连接。
(pEC-T)克隆及鉴定试剂盒 说明书
(pEC-T) 克隆及鉴定试剂盒地址：上海市浦东张江高科技园区蔡伦路720号2号楼电话：************传真：************-13主页： email ：****************保存温度：-20o C SinoBio 目录号：T003产品组成：质量控制：Control Insert克隆后的白色菌落中，有90%以上含有Insert DNA片段。
Control Insert经克隆后，经测序确认“T” 突出的存在。
产品描述：SinoBio Easy Clone T-vector是一种PCR产物高效TA克隆的专用T载体。
它由pBluescript II KS载体改造而成：保留了pBluescript II KS载体全部的酶切位点；PCR产物插入位点处于多克隆酶切位点的中间，其两侧都有众多的酶切位点可供选择。
由于本载体以pBluescript II KS载体为基础构建而成，所以它具有同pBluescript II KS载体相同的功能：PCR产物插入后可以利用a -互补性进行蓝白斑筛选，挑选阳性克隆。
可以用M13通用引物和T7，T3启动子引物对PCR产物进行测序。
含有T7 及T3 RNA聚合酶的启动子，可以对插入片段进行体外转录。
15分钟快速连接：l 随酶提供独特配方的2×快速及10×普通T4 DNA Ligation Buffer; l 使用2X 快速buffer在室温(25°C)下，仅需15分钟即可完成连接反应;自带超快PCR 鉴定2×Fast Taq Master Mix 及DNA Marke ：2×Fast Taq Master Mix (Quick Load型)已含有PCR反应所需的快速型PCR聚合酶、dNTP混合物、MgCl2、上样染料以及反应缓冲液预先，使用时只需再加入模板和引物并稀释到1倍浓度即可进行PCR反应。
其扩增速度为普通Taq酶的数倍，因此可大幅度缩短PCR鉴定过程所需要的时间， 试剂盒自带预混1×Loading Buffer的DL2,000 Plus DNA Marker，能满足绝大部分PCR产物电泳的需要。
M5 SuperFast Seamless Cloning Mix产品说明书
M5 SuperFast SeamlessCloning Mix使用说明书产品名称单位货号M5 SuperFast Seamless Cloning Mix 20T(100ul) MF017-01M5 SuperFast Seamless Cloning Mix 4x20T MF017-04【储存条件】长期保存，请置于-20˚C，有效期6个月。
使用后请及时放入-20˚C保存以保证酶的活性。
【产品简介】本产品不依赖于T4连接酶，不受载体和目的片段的酶切位点限制，而直接用重叠片段重组的方法，该试剂盒采用特殊的酶组合可以将任意方法线性化后的载体和与其两端具有16-25bp重叠区域的PCR片段定向重组连接，可以30分钟内实现A’粘性末端或者平末端PCR产物片段高效定向无缝克隆至载体的任意位点。
【产品特点】1. 30分钟内可以将一个50bp-15kb PCR扩增片段（平末端、A末端均可）插入载体的任意位置。
不受载体和插入片段酶切位点的可用性和平端/粘性末端的限制，可以在任意位点进行克隆。
2. 无缝克隆，插入点不会引入不需要的碱基序列。
3. 不依赖于连接酶及磷酸酶，克隆阳性率可达95%以上。
【原理示意】<线性化载体和插入DNA片段的制备>：A、线性化载体的制备1). 酶切来源：酶切所得线性载体，平末端或者粘端、单酶切或者双酶切均可，酶切后胶回收。
注意：一步法无缝克隆反应体系内无DNA连接酶，不会发生载体自连反应。
因此，即使是以单酶切方式制备的线性化载体也无需进行末端脱磷酸处理。
重组产物转化后出现的假阳性克隆(无插入片段) 是由酶切不完全未线性化环状载体转化而形成的。
我们推荐酶切后胶回收可以把这种未线性化载体比例降低到最低程度。
2). 反向PCR来源：建议使用超保真DNA聚合酶（W5系列超保真酶或mix，货号MF740，MF743等）制备，如果扩增条带单一可以通过PCR产物纯化或者胶回收（货号：MF029）获得载体。
clone smarter C5863-25说明书
clone smarter C5863-25说明书产品名称：零背景粘性末端TOPO克隆试剂盒（Amp/kan）进口 TOPO载体试剂盒TA品牌：CloneSmarter产品编号：5863-25/50C5853-Amp末端加A片段C5854-Kan末端加A片段C5863-Amp末端加A片段带酶切位点C5864-Kan末端加A片段带酶切位点产品规格：25次/50次产品简介:适用于Taq系列的DNA聚合酶扩增的末端加“A"片段的克隆;连接+转化，最快只需5min;载体不含L acZ基因,无需通过蓝白斑筛选，因此不需使用含有IPTG、X-gal的培养基平板;对照插入片段克隆效率可达98%以上;PCR产物(仅有目的条带、无非特异条带和引物二聚体)可直接进行克隆，无需纯化。
产品特点:1.真正做到零背景！载体不会自连！由于拓扑异构酶I可以把任何DNA连接起来，所以TOPO载体自连的背景高，但Clone Smarter克服了这一点，该独特技术全球独有！2.高效率（转化子数更多，阳性率更高，≥5kb基因仍有95%以上的阳性率）。
3.省时：连接+转化最快仅5min ( 真正做到长片段连接5min也能保证足够转化子 )。
4.无需蓝白班筛选：载体不含LacZ基因，平板无需涂IPTG和X-Gal（省时省钱），不会产生“白边蓝芯”克隆菌。
5.操作简单： PCR片段 + TOPO载体 + 增强剂，PCR产物无需酶切，室温下连接混匀时间≤5min即可转化。
6.耐受部分毒性基因：由于载体含有3个终止子，能最大程度降低表达背景，可耐受一些低毒性基因的克隆。
7.原装进口，超高性价比！。
ClonExpress一步法定向克隆无缝克隆试剂盒说明书
One Step Cloning Kit
Vazyme Biotech Co., Ltd
网站/Web: 咨询热线/Tel: 400-600-9335 销售/Sales: sales@ 技术支持/Support: support@ 技术服务/Service: service@
图二：重组引物设计方案 注：如最终引物长度超过40bp，我们推荐您在引物合成时选用PAGE纯化，可提高克隆成功 率。计算扩增引物退火温度时，只需计算基因特异性扩增序列的Tm值，载体末端同源序列不 应参与计算。
最适插入片段使用量 = [0.04×插入片段碱基对数]ng (0.06 pmol) 例如，将长度为2 kb的插入片段克隆至长度为5 kb的克隆载体时，克隆载体的最适使用 量应为：0.02 × 5000 = 100 ng; 插入片段最适使用量应为：0.04 × 2000 = 80 ng。
图一：使用 ClonExpressTM II 进 行基因克隆实验流程 用于重组反应的克隆载体必须为 线性化载体。该线性化载体可通 过内切酶消化环状载体获得，也 可由反向PCR扩增环状载体获得 (图，上左)。插入片段由PCR扩 增制备。所用扩增引物在设计时 需在其5’端添加线性化克隆载体 末端序列 (图中以红色和蓝色标 记) 。使用该引物对扩增插入片段 ，扩增产物5’ 和 3’ 最末端的序列 分别和线性化克隆载体两末端序 列完全一致 (图，上右)。以线性 化克隆载体和插入片段扩增产物 配制重组反应体系，37℃反应30 min即可完成重组反应，实现两线 状 DNA 的体外环化 (图，中)。 重组产物直接进行转化，平板上 会形成数百个单克隆供后期阳性 筛选 (图，下) 。
100 μl 50 μl 5 μl 5 μl
汉恒生物无缝克隆试剂盒使用说明(附原理)
汉恒生物无缝克隆试剂盒使用说明(附原理)HB-infusion TM无缝克隆试剂盒使用说明（附原理说明）一、产品简介HB-infusion TM无缝克隆试剂盒是一种新型、快速并且高效的Gibson Assembly DNA定向克隆技术，可以在任意载体的任意位置一次插入多个目的基因片段。
HB-infusion TM无缝克隆试剂盒操作极其简单，仅需在载体的克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR引物的5’端引入与载体克隆位点两端完全一致的15~25 bp同源序列（图1，图3）。
将上述线性化的克隆载体和带有同源序列的PCR片段按合适比例混合，并加入HB-infusion TM Master mix，通过反应体系中DNA外切酶、DNA聚合酶以及连接酶的在50℃反应20 min即可快速完成定向克隆，阳性率几近100%。
图1. HB-infusion TM快速克隆试剂盒原理示意图。
1. 线性化目的载体（左上）；2. PCR获取目的片段。
设计的引物５’需要和线性化载体末端有15~25 bp的重叠（图中蓝色和黄色片段，细节可参考图3）；3. 按照一定比例把二者混合在HB-infusion TM的2⨯预混液内，50︒C反应20 min后直接转化E.coli即可。
二、HB-infusionTM试剂盒的优点1. 相比于传统的同源重组的无缝克隆方法进行，HB-infusion TM试剂盒更高效，操作更简单，只需要一次反应即可完成定向克隆；2. 对酶切位点无要求，可以把目的片段插入到任意载体的任意位点；3. 连接片段之间不会引入任何其他序列；4. 可以同时克隆多个片段。
三、产品包装产品组成使用次数体积2 x HB-infusion TM Master mix20 tests 200 μlPositive linearized pUC vector （250 ng） 5 tests 25 μlPositive control insert (500 ng) 5 tests 25 μl储存条件-20 ℃四、使用说明汉恒生物建议2-3个片段连接时，DNA片段的使用总量为0.02~0.5 pmols，4~6片段连接时加入的DNA总量为0.2~1.0 pmols。
160680SeamlessCl...
天净沙系列CAT#:160680-25CAT#:160680-50低温运输，-20℃保存无缝克隆试剂盒Seamless Cloning and Assembly Kit使用手册V1.0北京天恩泽基因科技有限公司北京市海淀区上地信息路26号北京市留学人员海淀创业园中关村创业大厦506网址：；电话：400-6765278；电邮：****************产品及特点无缝克隆是一种简单、快速、高效的DNA定向克隆技术，该技术突破传统，不依赖内切酶和连接酶，不受限制性内切酶酶切位点的限制，利用同源重组的原理，可将任何DNA片段克隆至任何载体的任何位点。
反应及转化时间短，阳性率达95%以上。
本产品特点总结如下：1.简单、高效地定向克隆DNA片段。
2.可同时定向克隆两个或多个DNA片段。
3.不依赖内切酶和连接酶，不受限制性内切酶酶切位点的限制。
4.省时，反应时间加转化时间短至20分钟。
5.PCR产物（仅有目的条带、无非特异条带和引物二聚体）可直接进行重组反应，无需纯化。
规格及成分成份编号25次包装50次包装2x Seamless Mix160680A125uL250uL阳性对照DNA片段I160680B10uL10uL阳性对照DNA片段II160680C10uL10uL阳性对照线性化载体160680D10uL10uL超纯水1009351mL1mL使用手册1份运输及保存低温运输，-20℃保存，有效期一年。
自备试剂线性化载体、DNA片段、感受态细胞、SOC或LB培养基和培养皿（含抗菌素和不含的）使用方法 1.线性化载体的制备：可通过单酶切、双酶切或PCR扩增的方法来制备。
（如果线性化不彻底，将会导致阴性克隆的产生，推荐使用双酶切或PCR扩增的方法。
）2.DNA片段的制备：1)DNA片段可通过PCR扩增或酶切的方法制备，PCR扩增片段无需纯化即可用于重组反应。
2)PCR扩增法引物设计原则：A.引物的3‘端必须包含18-50个能与模板DNA结合的碱基序列，以便PCR扩增出目的DNA片段。
ShinoRec
ShinoRec®一步法定向克隆试剂盒（无缝克隆试剂盒）说明书目录A.ShinoRec®一步定向克隆试剂盒（无缝克隆试剂盒）说明书 (2)B.技术手册 (6)1.引物设计 (6)1.1.多片段引物设计方法 (6)1.2.载体或目的片段末端上有多余非同源片段时如何设计引物？ (6)2.重组构建 (6)2.1.载体与目的片段摩尔比的计算 (7)2.2.线性化载体的浓度 (7)2.3.不同大小目的片段的重组效率？ (7)2.4.如果载体过大，怎么处理？ (7)2.5.插入片段过大如何处理? (7)2.6.单酶切（黏性末端，平末端）载体片段的处理，是否影响阳性率？ (7)3.常见困难分析 (8)3.1.Taq末端加A影响阳性率吗？ (8)3.2.同源序列不完全匹配会不会影响重组？ (8)3.3.转化不长，是什么原因？ (8)3.4.转化后长得很好，就是没有阳性，是什么原因？ (8)3.5.鉴定有阳性，但是测序不是目的基因，为什么？ (8)3.6.阳性克隆测序后发现在序列的引物处有碱基突变，是什么原因引起的？ (8)Add:Floor2,Gate6,289#,Minqiang Road,Songjiang District,Shanghai201612Add:Floor 2,Gate 6,289#,Minqiang Road,Songjiang District,Shanghai 201612一、产品介绍ShinoRec®一步定向克隆试剂盒（无缝克隆试剂盒）,该产品可以不依赖于连接酶，不受载体和目的片段的酶切位点限制，而直接用同源重组的方法，完成目的片段与载体相连接的基因克隆技术。
该技术操作简单，PCR 产物一步定向克隆，目的片段与载体无缝连接，反应时间短至20分钟，阳性率达到95%以上，让您轻松完成实验。
三、产品组成及保存条件货号WF010S WF010M 产品组成包装规格(20次)包装规格(100次)数量ShinoRec®重组酶20μl/管100μl/管1管ShinoRec®10×反应缓冲液50μl/管250μl/管1管收到后请立即低速离心保存在-20℃；此Kit 可在-20℃长期保存，避免反复冻融。
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Vazyme biotech co., ltd.
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Version 3.2
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１／产品概要
ClonExpressTM快速克隆技术 ClonExpressTM技术是一种简单、快速并且高效的DNA定向克隆技术，可将插入片段PCR产 物定向克隆至任意载体的任意位点。将载体在克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR引物 5’端引入线性化克隆载体末端序列，使得插入片段PCR产物5’和3’最末端分别带有和线性化 克隆载体两末端对应的完全一致的序列 (15 bp～20 bp)。这种两端带有载体末端序列的PCR 产物和线性化克隆载体按一定比例混合后，在ExnaseTM的催化下，仅需反应30 min即可进行 转化，完成定向克隆。克隆阳性率可达95%以上。 ClonExpressTM II是新一代的重组克隆试剂盒，该试剂盒中包含有重组反应所需缓冲液和重组 酶ExnaseTM II。和上一代产品相比，ExnaseTM II中添加了独特的重组增强因子。一方面，这 种增强因子可以显著提高重组克隆效率，即便使用低效率感受态细胞 (107 cfu/μg)也可实 现高效克隆 (100 cfu/ng Vector)。另一方面，ExnaseTM II还兼容常规酶切、PCR反应体系。 克隆载体酶切产物或PCR产物和插入片段PCR产物可以不进行DNA纯化直接用于重组克隆 ，极大的简化了实验步骤。 产品优点 -简单、快速、高效 -适用于向几乎任何载体的任何位点进行定向克隆 -无需考虑插入片段自身携带的酶切位点 -可高效克隆50 bp～10 kb片段 -不依赖于连接酶及磷酸酶，克隆阳性率可达95%以上 -线性化克隆载体和PCR产物可不进行纯化直接克隆 应用范围 -快速克隆 -高通量克隆 -无缝克隆 -DNA定点突变
４．３ 插入片段扩增引物设计
ClonExpressTM II 引物设计总的原则是：通过在引物5’ 端引入线性化克隆载体末端同源序 列，使得插入片段扩增产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一 致的序列 (15 bp～20 bp)。以pUC18作为克隆载体为例，引物设计方案如图二所示。
100 μl 50 μl 5 μl 5 μl
C112-02 (50 rxn)
200 μl 100 μl 5 μl 5 μl
5 × CE II Buffer
01/ 02
３／贮藏条件
本产品应置于-20℃储存。
注：ClonExpressTM II重组反应体系内无DNA连接酶，不会发生载体自连反应。因此，即使是以单 酶切方式制备的线性化载体也无需进行末端脱磷酸处理。重组产物转化后出现的假阳性克隆 (无 插入片段) 是由未线性化环状载体转化而形成的。如这种假阳性克隆比例较高，应重新制备线性化 克隆载体。
ClonExpressTM II
One Step Cloning Kit
Vazyme Biotech Co., Ltd
网站/Web: 咨询热线/Tel: 400-600-9335 销售/Sales: sales@ 技术支持/Support: support@ 技术服务/Service: service@
图三：参考实例插入片段扩增引物设计 注意: 我们推荐您在PCR仪或者水浴锅等温控比较精确的仪器上进行反应。重组效率在反应 30 min左右达到最高，反应时间不足或者太长都将会降低克隆效率。
2) 克隆载体线性化 将2 μg环状pUC19质粒加入到20 μl酶切反应体系中，37℃酶切2 hr。限制性内切酶使用 量为EcoR I 和Hind III 各1μl。酶切完成后，将酶切产物置于65℃加热20 min，失活内切 酶。 3) 插入片段PCR扩增 使用PhantaTM Super-Fidelity DNA Polymerase (Vazyme, P501) 对插入片段进行扩增，扩 增模板为基因组。取少量扩增产物进行琼脂糖电泳检测，扩增特异条带单一。 4) 线性化克隆载体和插入片段扩增产物浓度测定 将线性化克隆载体和插入片段扩增产物做数个等体积稀释梯度，原始产物和稀释后产物各 取1 μl进行琼脂糖电泳，与DNA分子量标准 (DNA Marker)比较条带亮度以确定其近似浓 度(绝大多数DNA分子量标准都有确定的DNA浓度，图四)。由图可知，pUC19酶切产物 DNA浓度约为100 ng/μl；扩增产物DNA浓度约为400 ng/μl。
表一：线性化克隆载体的使用方式 注：直接使用酶切产物或扩增产物进行重组反应时，使用体积不应超过4 μl (重组反应总体积的1/5) 。
４．２ 制备线性化载体
选择合适的克隆位点，并对克隆载体进行线性化。我们推荐您尽量选择无重复序列 且GC含量均匀的区域进行克隆。当载体克隆位点上下游20 bp区域内GC含量均在 40%～60%范围之内时，重组效率将达到最大。 克隆载体线性化方式可以为限制性内切酶酶切消化，也可以为反向PCR扩增。
ClonExpressTM II 快速克隆试剂盒中提供500 bp control insert (25 ng/μl) 和pUC19 control vector, linearized (50 ng/μl) 各5 μl，需要时可进行阳性对照反应，每次反应 各加1 μl。 体系配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分，避免产生气泡 (请勿剧 烈震荡或者涡旋混匀) 。置于37℃反应30 min。待反应完成后，立即将反应管置于 冰水浴中冷却5 min。之后，反应产物可直接进行转化；也可储存于-20℃，待需要 时解 当插入片段长度大于克隆载体时，最适克隆载体与插入片段使用量的计算方式应互 换，即将插入片段当做克隆载体/克隆载体当做插入片段进行计算。 2. 线性化克隆载体的使用量应在50～200 ng之间；插入片段扩增产物的使用量应在20 ～200 ng之间。当使用上述公式计算DNA最适使用量超出这个范围时，直接选择最低/ 最高使用量即可。例如，插入片段长度为100 bp，最适使用量计算值为 4 ng，实际反 应体系内使用量应为插入片段扩增产物最少使用量 20 ng。 3. 线性化克隆载体和插入片段扩增产物不进行DNA纯化直接使用时，加入总体积应不 超过反应体系体积的1/5，即4 μl。
图二：重组引物设计方案 注：如最终引物长度超过40bp，我们推荐您在引物合成时选用PAGE纯化，可提高克隆成功 率。计算扩增引物退火温度时，只需计算基因特异性扩增序列的Tm值，载体末端同源序列不 应参与计算。
最适插入片段使用量 = [0.04×插入片段碱基对数]ng (0.06 pmol) 例如，将长度为2 kb的插入片段克隆至长度为5 kb的克隆载体时，克隆载体的最适使用 量应为：0.02 × 5000 = 100 ng; 插入片段最适使用量应为：0.04 × 2000 = 80 ng。
４．５ 进行重组反应
于冰水浴中配制如下反应体系。如果不慎将液体粘在管壁，可通过短暂离心使其沉入管底。 ddH2O 5 × CE II Buffer 线性化克隆载体 插入片段扩增产物 Exnase
TM
Up to 20 μl 4 μl 50～200 ng 20～200 ng 2 μl
II
ClonExpressTM II 重组反应体系最适克隆载体使用量为0.03 pmol；最适克隆载体与插入片 段摩尔比为1:2，即最适插入片段使用量为0.06 pmol。这些摩尔数对应的DNA质量可由以 下公式粗略计算获得： 最适克隆载体使用量 = [0.02×克隆载体碱基对数]ng (0.03 pmol)
４／实验方案
４．１ 实验流程概览 （图一）
ClonExpressTM II 重组反应体系兼容几乎所有的酶切反应体系。克隆载体酶切产物加 热失活内切酶(参见内切酶使用说明书，例如Hind III，65℃孵育20 min完全失活)后可 直接用于重组反应。 B 线性化克隆载体由反向PCR扩增制备 我们推荐您使用高保真聚合酶进行载体扩增 (PhantaTM Super-Fidelity DNA Polymerase, Vazyme, P501) 以减少扩增突变的引入。PCR扩增模板应尽量使用预线 性化质粒，以防止残留环状质粒模板对克隆阳性率的影响。 ClonExpressTM II重组反应体系兼容常规PCR反应体系。因此，如扩增模板为预线性 化质粒且PCR产物电泳条带单一，扩增产物可以无需纯化直接用于重组反应。
线性化载体制备方式 酶切消化制备 模板类型 环状质粒 快速实验方案 加热失活内切酶后 直接使用 DpnI 消化后直接使用 (降解扩增模板) 直接使用 最佳实验方案 胶回收 胶回收或DpnI 消化后 胶回收 胶回收
环状质粒 扩增特异 PCR制备 有明显非特异性 扩增 预线性化质粒、 基因组、cDNA
胶回收
PCR扩增情况
PCR模板类型 与克隆载体抗性相同 的环状质粒
快速实验方案 DpnI 消化后直接使用* 直接使用 胶回收
最佳实验方案 胶回收或DpnI 消化后胶回收
扩增特异 预线性化质粒、 基因组、cDNA 有明显非特异性扩增 胶回收
表二：扩增产物推荐使用方式 注：直接使用扩增产物进行重组反应时，使用体积不应超过4 μl (重组反应总体积的1/5) * 当线性化克隆载体为酶切制备时，插入片段扩增产物经DpnI消化结束后应置于85℃加热20 min将 DpnI 失活，以避免重组反应时残留DpnI 对克隆载体的降解。
产品概要 产品组成 贮藏条件 实验方案 参考实例 注意事项 常见问题与解决方案
２／产品组成
组
ExnaseTM II 500 bp control insert (25 ng/μl) pUC19 control vector, linearized (50 ng/μl)
分
C112-01 (25 rxn)
图一：使用 ClonExpressTM II 进 行基因克隆实验流程 用于重组反应的克隆载体必须为 线性化载体。该线性化载体可通 过内切酶消化环状载体获得，也 可由反向PCR扩增环状载体获得 (图，上左)。插入片段由PCR扩 增制备。所用扩增引物在设计时 需在其5’端添加线性化克隆载体 末端序列 (图中以红色和蓝色标 记) 。使用该引物对扩增插入片段 ，扩增产物5’ 和 3’ 最末端的序列 分别和线性化克隆载体两末端序 列完全一致 (图，上右)。以线性 化克隆载体和插入片段扩增产物 配制重组反应体系，37℃反应30 min即可完成重组反应，实现两线 状 DNA 的体外环化 (图，中)。 重组产物直接进行转化，平板上 会形成数百个单克隆供后期阳性 筛选 (图，下) 。