鸡IgM μ 链在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达

鸡IgM µ 链在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达及其反应原性的测定赵莉1，2，3，步志高2*，鲍恩东1*（1.南京农业大学动物医学院南京 210095；2.中国农科院哈尔滨兽医研究所国家重点实验室生物技术六室，哈尔滨 150001； 3.瑞普（天津）动物药业有限公司天津 300300）摘要：本研究构建了表达鸡IgM µ链蛋白的重组杆状病毒rBac-c IgMµ。

采用抗c IgM µ 链蛋白的多克隆抗体间接免疫荧光检测重组杆状病毒表达的c IgMµ 蛋白，显示出良好的特异免疫反应原性。

以感染rBac-c IgMµ 的昆虫细胞裂解液上清包被96孔ELISA板，抗鸡IgM µ 链蛋白多克隆抗血清为一抗间接ELISA 检测，同样具有良好的敏感性和特异性。

结果表明，重组杆状病毒能良好表达鸡IgM µ 链蛋白，且其表达产物具有良好的反应原性。

关键词：鸡IgM µ 链； 重组杆状病毒；反应原性IgM是机体初次体液免疫应答中最早出现的免疫球蛋白，其在血清中的含量会在首次接触抗原的几天内达到高峰（杜念兴，1997），然后通过免疫球蛋白类转换作用转变为IgG而使其含量逐渐下降（Nossal et al, 1964；Coleclough et al, 1980; DePinho et al, 1984；Wabl et al, 1978；Yancopoulos et al, 1986；Burrows et al, 1983）。

由于记忆B细胞并不大量分泌IgM，所以IgM的升高预示近期机体内有抗原出现，因此，IgM在动物疾病的早期诊断方面发挥着重要作用（杨汉春, 2003）。

由于目前各类传染病危害严重，迫切需要一种有效的早期诊断试剂进行快速诊断以控制病情，淘汰感染畜禽，减少损失。

本试验利用杆状病毒—昆虫细胞系统表达了鸡IgM µ 链蛋白，由于杆状病毒表达系统在外源基因的表达方面具有糖基化、磷酸化和蛋白切割加工修饰过程，表达产物的理化性质和生物学特性与天然蛋白相似（刘高强等，2004；王清华等，2006；董双林等，2006；李雪菲等，2005），因此用该蛋白包板建立的间接ELISA便于筛选出可以与天然IgM表位特异性反应的单抗，从而可为进一步建立快速灵敏的抗鸡IgM µ 链诊断试剂盒奠定基础。

1材料和方法1.1材料pFastBac1（Invitrogen）供体质粒、sf9细胞系、DH10Bac感受态细胞（Invitrogen）均由国农科院哈尔滨兽医研究所生物技术六室保存和提供；pBlue-cIgM µ质粒、抗鸡IgM µ 链多克隆抗体均由国农科院哈尔滨兽医研究所生物技术六室制备保存；荧光素（FITC）标记的羊抗兔IgG购自北京中杉生物技术公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG购自Sigma 公司；Grace’s培养基、转染试剂（Cellfectin Reagent）购于Invitrogen公司；引物（M13 Forward 5，GTTTTCCCAGTCACGAC 3，，M13 Reverse 5，CAGGAAACAGCTATGAC）由上海博亚生物工程公司合成。

1.2原核表达重组cIgMµ 免疫血清的制备以cIgMµ-f原(5’CTAGTGAATTCCCCATACAGATGA3’)和cIgMµ-r原(5’ CTTGCGTCGACCAACACCCAGGAG3’)为引物，以pBlue-cIgM µ 扩增cIgM µ原去信号肽片段，将PCR扩增目的片段用EcoR I和SalＩ双酶切后克隆于表达载体pET-30a(+)的EcoR I和Sal Ｉ位点，使鸡IgM µ 蛋白的表达框架与载体上的His标签融合。

将构建好的重组质粒pET-30a-IgM µ转化BL21，IPTG诱导目的蛋白表达，并通过SDS-PAGE检测蛋白是否正确表达以及表达量大小，Ni化琼脂糖柱纯化。

将纯化的蛋白浓缩后进行SDS-PAGE，估测其浓度后，按每只约100 µg的剂量接种家兔。

共免疫3次，免疫间隔为3周，首免用弗氏完全佐剂乳化抗原，后腿肌肉注射；二免用弗氏不完全佐剂乳化抗原，背部皮下多点注射；三免用弗氏不完全佐剂乳化抗原，颈部皮下注射。

三免后10天采血分离血清，检测抗体效价，制备多抗血清。

1.3 重组杆状病毒的构建和重组阳性种毒的制备以cIgMµ-f真(5’GTGGAGAATTCATGCAGATGAATCAA3’)和cIgMµ-r真(5’ AATGTCGACTCATTACAACACCCAGGA3’)为引物，以pBlue-cIgM µ 扩增cIgM µ真片段，将PCR扩增目的片段用EcoR I和SalＩ限制酶双酶切后克隆至转移载体pFastBac1的EcoR I和SalＩ位点，将pFastBac1-cIgM µ 转化至DH10Bac，PCR筛选阳性重组杆状病毒基因组克隆rBacmid-cIgM µ。

利用脂质体转染试剂，将制备的阳性重组杆状病毒的基因组DNA转染sf9细胞，待细胞出现病变后，按文献（Cho-Hua Wan et al, 1995）进行重组病毒嗜斑纯化和病毒扩增，蛋白酶K-SDS-酚/氯仿抽提法提取病毒基因组DNA，并以其做模板，M13-48f和M13-47r为引物，PCR验证cIgM µ 基因在纯化病毒中获得稳定重组，重组病毒命名为rBac-cIgM µ。

扩增种毒完成嗜斑形成单位（PFU）滴定后，于4℃保存备用。

1.4间接免疫荧光上述rBac- cIgMµ 种毒液按1:10体积比感染新鲜制备的sf9细胞，至细胞病变达90％时，收获细胞，PBS洗涤重悬后滴一滴于载玻片上，自然阴干后95％乙醇固定，同时设野生型杆状病毒感染细胞为阴性对照。

分别以1:200倍稀释的兔抗IgM µ原高免血清和相同稀释倍数的正常非免疫兔的阴性血清为一抗。

PBST洗涤后加入1:50倍稀释的荧光素（FITC）标记的羊抗兔二抗，作用30 min，PBST洗涤，荧光显微镜观察并拍照。

1.5间接ELISA将rBac- cIgM µ 种毒液按1:10体积比感染新鲜制备的sf9细胞，至细胞病变达90％时，1000 rpm ，离心10 min 收获感染细胞，PBS 离心洗涤两次，用PBS 重悬，三次冻融后超声波裂解细胞，离心后收获上清，用Na 2CO 3/NaHCO 3（pH 9.6）缓冲液10倍稀释后，按每孔100 µL ，4℃包被96孔ELISA 板过夜；10%脱脂乳（0.05％ Tween20）封闭2 h ；兔抗IgM µ原 高免阳性血清（1:500）为一抗作用2 h ；HPR 标记山羊抗兔IgG （1:3000）为二抗作用1 h ；另设野生杆状病毒感染细胞上清和正常非免疫兔的血清为阴性对照； PBST 洗涤，底物邻苯二胺（OPD ）作用15 min ，2 M 硫酸终止反应后，测定OD 值。

每个稀释度至少设3个平行孔，取平均值计算P/N 值。

2结果2.1 鸡IgM µ 原核表达蛋白的鉴定pET-30a-cIgM µ 阳性质粒转化BL21，IPTG 诱导表达蛋白鸡IgM µ 蛋白，将菌液裂解后进行12%SDS-PAGE ，电泳结果表明, 鸡IgM µ 蛋白已经获得表达，分子量（含融合部分）为49.7 KD （图1）。

图1含有重组质粒pET-30a-cIgM µ 的大肠杆菌诱导及SDS-PAGE 鉴定结果1.含阳性质粒pET-30a-cIgMµ诱导1h 后菌体裂解物;2.含阳性质粒pET-30a-cIgMµ诱导2h 后菌体裂解物;3.含阳性质粒pET-30a-cIgMµ诱导3h 后菌体裂解物;4.含空质粒pET-30a 诱导3h 后菌体裂解物;5.含阳性质粒pET-30a-cIgMµ诱导前菌体裂解物6.低分子量标准蛋白。

Fig 1 SDS-PAGE Analysis of E.coli BL21 containing recombinant plasmid of pET-30a-cIgMµ after induced1.Cell extraction of E .coli containing pET-30a-cIgMµ induced 1h;2.Cell extraction of E .coli containing pET-30a-cIgMµ induced 2h;3.Cell extraction of E .coli containing pET-30a-cIgMµ induced 3h;4.Cell extraction of E .coli containing pET-30a induced 3h;5.Cell extraction of E .coli containing pET-30a-cIgMµ uninduced.6.Protein marker of low molecular weight.2.2表达鸡IgM µ蛋白的重组杆状病毒rBac-cIgM µ的构建与鉴定为构建表达鸡IgM µ 蛋白的重组杆状病毒，首先将鸡IgM µ 基因亚克隆至pFastBac1，构建重组转移载体pFastBac1-cIgM µ，EcoR Ⅰ和Xhol Ⅰ双酶切后获得约4700 bp 和1170 bp 两个片段，与理论预期值相符（图2）。

将pFastBac1-cIgM µ 转化至DH 10Bac ，经蓝白斑筛选和PCR 鉴定获得转移质粒rBacmid-cIgM µ。

进一步提取重组质粒rBacmid- cIgM µ，转染sf9细胞拯救重组杆状病毒，提取病毒基因组核酸DNA ，以M13-48f 和M13-47r 为引物PCR 扩增出特异的2.8 kb 的产物（图3），表明鸡IgM µ 基因在杆状病毒rBac- cIgM µ 中获得重组。

2.3 IFA 检测昆虫细胞表达重组鸡IgM µ 蛋白抗原间接免疫荧光方法检测特异性抗体具有特异性强、快速简便的突出优点（胡清海等，2001）。

为此，分别以rBac-cIgM µ 和野生杆状病毒感染sf9细胞，至CPE 达90％时收集细胞悬液制备涂片，再分别以1:200稀释的兔抗IgM µ原 高免血清和相同稀释倍数的正常非免疫兔的阴性血清为一抗进行间接免疫荧光染色。