植物可溶性蛋白的测定

植物组织可溶性蛋白质的测定-考马斯亮蓝G-250法

更新时间2015-5-19

1、目的：测定植物组织的可溶性蛋白含量，测定范围为100-1000ug/ml，高浓度需要稀释后测定。小分子蛋白和肽的测定需要用福林酚试剂。

2、提取：用测定SOD （0.05M pH7.8磷酸缓冲液）或者POD （0.1 mol / L 磷酸缓冲液 （pH6.0）的提取液或者用水提取均可，但混匀后要放置0.5-1小时再离心，以充分提取。单独测定时，取样品5g，加水50ml，破碎，冷藏存储，测前10000rpm离心10分钟备用，取样0.1-0.2ml测定（如果加水比较少，计算时应考虑材料水分）。

3、测定：以提取液为对照，以牛血清标准蛋白为标准，以考马斯亮蓝G-250为显色剂，显色2-30分钟内，在595nm 比色。

4、计算：

可溶性蛋白含量（ug/g鲜重）=测定含量（ug）*总提取体积ml/取样体积ml/鲜重g。

5、试剂配制：

5.1、牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取0.100g牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为1000μg／mL的原液，此液不用时应冷藏保存，可用15天。将1000μg／mL牛血清白蛋白用提取液稀释10倍，作为工作液，浓度为100μg／mL。 5.2、考马斯亮蓝G-250蛋白显色剂：称取0.050g考马斯亮蓝G-250，溶于25mL95％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸50mL，最后用蒸馏水定容到500mL。此溶液在常温下可放置1个月。 标准曲线及样品配制表 蛋白含量（μg） 100μg/ml标准蛋白（μl） 提取液 （μl） 考马斯亮蓝G-250显色剂 （ml）

0 0 1000

2.5 20 200 800

40 400 600 60 600 400 80 800 200

100 1000 0

样品* X（一般叶片为1000） 1000-x

*注1：样品量依据显色调整，生长旺盛期小麦叶片可溶性蛋白含量一般为1mg/g数量级。 注2：比色需用玻璃比色杯，不能用石英比色杯，因石英吸附颜色，影响测定。 注3：最好首先让比色杯吸附颜色，再测定标准样品和未知样品，可消除部分误差。 注4：因染料吸附特性决定，本曲线非直线，不要用直线模式（4次拟合较好） 注5：缓冲液对显色强度影响较大，需要使标准曲线和样品保持相同的缓冲液浓度。 注6：如果配制的考马斯亮蓝G250有沉淀，可过滤后使用，在排除其他试剂形成沉淀后，表明G250已经过期，下次不能再用。

注7：此方法消光值随时间变化巨大，最好随加染色液随测定。