酶联免疫吸附试验(ELISA)
酶联免疫法;酶联免疫吸附试验法
酶联免疫法;酶联免疫吸附试验法
酶联免疫法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）
是一种常用的免疫学实验技术，用于检测样本中特定蛋白质或其他
分子的存在。
酶联免疫法通过利用特异性抗体与特定抗原结合的原
理来进行检测。
这种方法的原理是将待检测的抗原或抗体与特定的
酶标记的抗体或抗原结合，然后通过酶的底物来检测酶的活性，从
而确定待检测物质的存在或浓度。
酶联免疫法主要分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间
接竞争ELISA等几种类型。
直接ELISA直接将被检测的抗原或抗体
吸附在固相载体上，然后加入与其特异性结合的酶标记的抗体或抗原，通过酶的底物来检测酶活性。
间接ELISA则是在固相载体上吸
附抗原后，再加入特异性抗体和酶标记的抗体，以增强检测的灵敏度。
竞争ELISA则是将待检测的抗原与酶标记的抗原竞争结合，通
过竞争程度来检测待检测物质的浓度。
间接竞争ELISA结合了间接ELISA和竞争ELISA的特点，可以用于检测抗体的浓度。
酶联免疫吸附试验法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种高度敏感和特异性的实验技术，广泛应用于医学诊断、生物学研究和生物制药工业等领域。
它的优点包括操作简便、成本
低廉、高通量性和可定量性等，因此被广泛用于检测疾病标志物、药物残留、植物病原体和基因工程产品等。
同时，酶联免疫法也有一些局限性，比如可能受到干扰物质的影响、需要一定的实验条件和设备等。
因此，在使用酶联免疫法时需要综合考虑其优缺点，并结合具体的实验要求来选择合适的方法和条件。
酶联免疫吸附试验实验报告
酶联免疫吸附试验实验报告一、实验目的。
本实验旨在通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测目标蛋白或抗原的存在与浓度，以及对特定抗体的识别和结合情况。
通过本实验，我们可以了解到酶联免疫吸附试验的原理和操作步骤，以及在生物医学研究和临床诊断中的应用。
二、实验原理。
酶联免疫吸附试验是一种利用酶和抗体的特异性结合来检测抗原或抗体的方法。
其原理是将待检测的抗原或抗体吸附在微孔板表面，然后加入特异性抗体，并通过酶标记的二抗或底物来检测特异性结合的信号。
当待测物与特异性抗体结合后，通过底物的酶反应产生可定量的颜色反应，从而测定待测物的浓度。
三、实验材料和方法。
1. 实验材料，微孔板、待测抗原或抗体、特异性抗体、酶标记的二抗、底物溶液等。
2. 实验步骤，将待测抗原或抗体加入微孔板孔中，加入特异性抗体，洗涤孔板，加入酶标记的二抗，再次洗涤孔板，加入底物溶液，停止反应，测定吸光度。
四、实验结果。
通过本次实验，我们成功检测出待测物的存在与浓度，并观察到特异性抗体与待测物的结合情况。
根据实验结果，我们可以得出待测物的浓度，并进一步分析其在生物学过程中的作用和意义。
五、实验结论。
酶联免疫吸附试验是一种高度敏感和特异性的实验方法，广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域。
通过本次实验，我们深入了解了酶联免疫吸附试验的原理和操作步骤，掌握了实验技术和数据分析方法，为今后的科研工作和临床诊断提供了重要的参考和支持。
六、实验展望。
酶联免疫吸附试验作为一种重要的生物学实验方法，具有广阔的应用前景。
今后，我们将进一步深入研究酶联免疫吸附试验的原理和技术，开展更多的实验和应用，为生物医学研究和临床诊断提供更多的支持和帮助。
七、参考文献。
1. Smith, J. et al. (2010). Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Methods Mol Biol, 588, 89-94.2. Green, N. M. (2015). Avidin and streptavidin. Methods Enzymol, 184, 51-67.以上就是本次酶联免疫吸附试验的实验报告，谢谢阅读。
elisa酶联免疫吸附试验报告
.elisa酶联免疫吸附实验报告一．实验目的酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。
借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。
待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。
二．实验原理用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。
常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。
由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化1 / 11.作用使颜色加深，无法准确地定量。
辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（protonhemin）区作辅基。
酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。
氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以mg/ml 计算是HRP的A（1cm 403nm mg/ml=2.5）HRP纯度（RZ）=A403nm/A275nm纯度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。
高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。
用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。
ELISA的基本原理有三条：（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。
酶联免疫吸附试验结果
酶联免疫吸附试验结果酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA），是一种广泛应用于生命科学中的试验技术，主要用于检测生物体内特定蛋白质和抗体的存在和数量。
本文将根据不同类别，介绍ELISA试验结果的分析。
一、直接ELISA试验结果分析直接ELISA试验是指将已知抗原沉淀于微孔板上，再加入待检测物，之后加入特定抗体进行检测的试验方法。
当待检测物含有对应的抗原，则抗原和特定抗体结合，形成固定的复合物。
此时，待检测物在微孔板中残留，被进一步检测。
如果待检测物中含有特定抗体，则会与预先添加的抗原结合。
根据特定抗体标记的物质进行检测。
直接ELISA试验结果为同轴柱，并且呈现梯度性图谱。
二、间接ELISA试验结果分析间接ELISA试验是指使用抗原沉淀于微孔板上，加入待检测物，并再次加入特定抗体进行检测的试验方法。
在该试验中，患者血清或其他样品中含有抗体，抗体与固定的抗原结合，形成复合物。
之后添加特定抗体，间接ELISA试验的结果为同轴柱，并且呈现梯度性的图谱。
三、竞争ELISA试验结果分析竞争ELISA试验是对样品中的特定物质进行检测的试验方法。
在试管中，抗体与已知抗原结合后，特定抗体标记的物质被加入竞争ELISA反应体系中。
如果合适的特定抗体分子与抗原分子竞争结合，则可抑制特定抗体分子与标记物结合，标记物的含量随之减少。
竞争ELISA试验结果为逆向梯度性的图谱，表示抑制率和特定物质的含量呈反比。
四、间接竞争ELISA试验结果分析间接竞争ELISA试验是对患者中特定物质的抗体进行检测的试验方法。
在该试验中，已知抗原沉淀于微孔板上，加入患者样品，之后加入特定抗体。
如果患者样品中含有特定抗体，将与特定抗体竞争结合，导致标记物与它竞争结合量的减少。
间接竞争ELISA试验结果为逆向梯度性的图谱，表示抑制率和特定物质的含量呈反比。
总之，酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种基于特异性分子识别原理的分析方法，具有操作简单、稳定可靠、敏感度高等特点。
ELISA酶联免疫吸附试验报告
大学实验报告酶联免疫吸附试验学院：专业：姓名：学号：一．实验原理酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种用酶标记抗原或抗体的方法，此法是将抗原、抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用原理有机地结合起来的技术，可敏感地检测体液中微量的特异性抗原或抗体。
基本原理如下：①先使用抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性；②使抗原或抗体与某种酶联结成酶标抗原或酶标抗体，这种酶标抗原或酶标抗体即保留了其免疫活性，又保留了酶活性；③试验时，把受检标本（抗体或抗原）和酶标抗原或酶标抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，用洗涤法去除固相载体上的游离物质，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的多少有关。
当加入酶反应的底物后，底物被酶催化而产生有色物质。
颜色反应深浅与受检抗原或抗体的量成正比。
因此，可借助颜色反应的深浅来定性、定量抗体或抗原。
本技术的特点是敏感性高，特异性强，操作简易，结果容易观察。
图1 ELISA实验原理示意图二．实验材料BSA抗原、兔抗BSA抗体（一抗，分别用PBS稀释成1:2, 1:4, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256七个浓度）、酶标羊抗兔IgG（二抗）、0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液、洗涤液（PBS）、底物溶液、2mol/L H2SO4。
三．实验方法1.包被板的处理：加BSA（包被缓冲液稀释为10μg/ml）至酶标板中，每孔100μl，置湿盒中4℃过夜。
第二天取出，用PBS洗涤3-4次。
2.取包被好的酶标板，在第一孔中加入100μl PBS作阴性对照，在第2-8孔加入上述稀释的一抗各100μl，置37℃保温1h。
3.倾去液体，用PBS洗涤3-4次后加入二抗各100μl，置37℃保温30min。
4.倾去液体，用PBS洗涤3-4次后加入底物溶液各100μl，在暗处37℃避光显色20min，最后加入50μl、2M H2SO4终止反应。
5.在波长490nm处，测定各孔的光密度吸收值。
酶联免疫吸附实验
酶联免疫吸附实验一、实验目的1、用间接竞争酶联免疫吸附实验（ELISA法）测定多抗血清(pAb)敏感性，从而筛选出融合备用鼠融合前3～5d腹腔注射OTA的计量。
2、采用间接ELISA 法测定pAb效价，采用阻断ELISA法鉴定pAb敏感性，从而筛选出效价高且IC50（赭曲霉毒素A（OTA）多抗血清对OTA的50%抑制浓度）低的小鼠做细胞融合备用鼠。
3、用间接ELISA 和间接竞争ELISA 筛选出效价高、敏感性好、细胞生长旺盛的杂交瘤细胞株。
4、采用间接ELISA 法测定单克隆抗体效价，采用阻断ELISA法测定单克隆抗体敏感性，采用间接ELISA 检测方法进行单克隆抗体同种型及亚类鉴定。
二、实验原理ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。
测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。
其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。
这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。
这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。
ELISA法根据种类和变化可分为以下几类：双抗体夹心法、间接法、竞争法、阻断法双位点一步法、捕获法测IgM抗体、应用亲和素和生物素的ELISA。
在本实验中应用了间接法、阻断法和竞争法，利用酶分子与小鼠血液中的抗体共价结合，在底物的作用下，产生颜色反应，通过颜色的深浅筛选出融合备用鼠融合前腹腔注射OTA的计量和效价高且IC50低的小鼠做细胞融合备用鼠。
三、实验试剂与器材1、实验试剂在本测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）②酶标记的抗原或抗体（标记物）③酶作用的底物（显色剂）在此实验中所采用的免疫吸附剂是1μg/mL OTA-OV A；标记物是1:1000 倍用含5% 猪血清的PBST 稀释的50μL/ 孔的GAM-IgG-HRP；显色剂是50μL/ 孔的T M BOTA、牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵清蛋白(OV A)、小鼠单抗同种型检测试剂盒美国Sigma公司；碳化二亚胺(EDC)英国Thermo Scientific 公司；弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)、基础培养基1640、选择培养基HAT、HT、PEG21500美国Invitrogen公司；羊抗鼠酶标二抗(GAM-IgG-HRP)华美生物工程有限公司；实验用水为重蒸去离子水2、实验器材U-3000紫外扫描仪日本岛津公司；550 型酶标仪美国Bio-Rad 公司；HI9321酸度计美国Hanna 公司；AE260 电子天平德国Mettler公司；DK-8D电热恒温水槽上海一恒科技有限公司；2-93自动双重纯水蒸馏器、93-3定时恒温双向磁力搅拌器上海亚荣生化仪器厂；1201 超净工作台美国Forma Scientific公司；DMI3000B倒置生物显微镜德国Leica 公司；GS-15R多功能冷冻离心机美国Beckmen公司；3701型CO2培养箱美国Precision 公司；96孔、24 孔细胞培养板美国Costar 公司；96孔酶标板浙江玉环芦蒲塑化器械厂。
酶联免疫吸附实验ppt课件
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第四.五部分: 注意事项(1)
1、手工洗板时，甩尽孔内液体，每孔加洗涤 液350μl，静止30秒后甩尽液体，在厚迭吸 水纸上拍干，洗4次。
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工作液 100ul/孔，封住板孔， 37℃孵育60分钟。
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第四.三部分: 实验方法和步骤
9、洗板4次。 10 、除空白孔外，加入1：100稀释的酶结合
工作液(100 ul/孔).封住板孔, 37℃孵育30分 钟. 11 、洗板4次. 12、各孔加入显色剂100 ul/孔,避光37℃孵育 10-20分钟。 13、各孔加入终止液100ul/孔,混匀后即刻测 A450值(5分钟内)。15ຫໍສະໝຸດ 第四.三部分: 实验方法和步骤
5、从密封袋中取出所需板条，其它板条密封放回 4℃
6、除空白孔外，分别将不同浓度标准品/标本100ul/ 孔加入板条的相应孔中，标准品和标本应作双复 孔或三复孔。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育 90分钟。
7、洗板4次。 8、除空白孔外，加入1:100稀释的生物素化抗体(2a)
• 2、将浓缩洗涤液（4）用双蒸水稀释(1:20)。未 用完的放回4℃。
• 3、标准品:以标准品/标本稀释液(1b)1.0ml复溶冻 干标准品(1a), 静置15分钟后混匀，按说明稀释至 所需浓度，再进行倍比稀释至所需浓度。未用完 的复溶标准品放入-20℃保存, 稀释的标准品不应 重复使用。
• 4、可根据实际情况，将标本做适当倍数稀释(可 做预实验，以确定稀释倍数)。
ELISA酶联免疫吸附试验
夹心elisa具有高灵敏度、高特异 性和高稳定性等优点，适用于多 种抗原的检测。
04 elisa酶联免疫吸附试验的 优缺点
优点
高灵敏度
特异性
ELISA酶联免疫吸附试验具有高灵敏度，能 够检测出微量的抗原或抗体，适用于各种 生物样本中低浓度蛋白质的检测。
ELISA基于抗原与抗体特异性结合的原理， 能够准确地区分目标蛋白和其他蛋白质， 减少交叉反应，提高检测的特异性。
A 假阳性结果
由于ELISA试验的交叉反应和抗体间 的互相干扰，可能导致假阳性结果 的出现。
B
C
D
影响因素多
ELISA试验结果受到多种因素的影响，如 样本保存条件、试剂质量、操作时间等， 可能导致结果的差异和不稳定。
操作要求高
ELISA试验对操作要求较高，需要严格控 制实验条件和避免污染，以确保结果的准 确性和可靠性。
间接elisa是将特异性抗体与固相载 体结合，对待测样本中的抗原进行吸 附，再加入酶标记的抗抗体，通过底 物显色反应来检测抗原。
间接elisa可以用于检测未知抗原，操 作相对简单，但灵敏度较低。
夹心elisa
01
夹心elisa是将两种不同的特异性 抗体分别与固相载体和酶标记物 结合，通过形成“夹心”结构来 检测样本中的抗原。
洗板方式
可以采用手工洗板或洗板机进行洗涤，以减少误差和提高试验效率。
洗板次数
根据试验要求确定合适的洗涤次数，以保证试验的准确性和重复性。
显色
显色
加入显色剂使抗原抗体复 合物呈现颜色反应，是 ELISA试验中判断阴阳性的 依据。
显色剂
常用的显色剂包括TMB、 ABTS等，根据试验需求选 择合适的显色剂。
环境监测领域
酶联免疫吸附法
酶联免疫吸附试验ELISA一种酶联免疫技术。
用于检测包被于固相板孔中的待测抗原（或抗体）。
即用酶标记抗体，并将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相载体表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，最后通过酶作用于底物后显色来判断结果。
酶联免疫吸附试验（以下简称ELISA）:是酶免疫测定技术中应用最广的技术。
其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。
常用的ELISA法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。
ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。
此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。
滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。
因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。
此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。
用于标记抗体或抗抗体的酶须具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室温下稳定；反应产物易于显现；能商品化生产。
目前应用较多的有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP应用最广。
1•辣根过氧化物酶（HRP）过氧化物酶广泛分布于植物中，辣根中含量最咼，从辣根中提取的称辣根过氧化物酶（HRP），是由无色酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白（含糖量18%）,分子量约40000,约由300个氨基酸组成，等电点为pH3-9，催化反应的最适pH值因供氢体不同而稍有差异，一般多在pH5左右。
此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。
简述酶联免疫吸附试验的原理及基本步骤
简述酶联免疫吸附试验的原理及基本步骤酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测体内特定抗原或抗体的存在和数量。
其原理基于抗原-抗体的特异性结合作用以及酶的催化作用。
酶联免疫吸附试验的原理：酶联免疫吸附试验主要利用酶作为标记物，将待检测的抗原或抗体与其特异性抗体或抗原结合，再用酶标记抗体或抗原与待检测物结合，形成酶-抗原-抗体或酶-抗体-抗原复合物。
最后通过酶反应产生的色素变化或发光信号，来间接或直接定量分析待检测物的含量。
酶联免疫吸附试验的基本步骤：1.固相抗原或抗体的吸附：在反应板的孔中吸附抗原或抗体。
一般采用多孔吸附板作为载体，将抗原或抗体溶液加入孔中，经过一段时间的孵育后，以使抗原或抗体与孔板表面结合。
2.无特异性位点的封闭：将未被吸附的非特异性蛋白质如牛血清蛋白（BSA）添加到孔中，对未被特异性抗原或抗体吸附的区域进行封闭，防止非特异性结合的发生。
3.加入标记物：加入被标记的抗体或抗原，使其与孔中的特异性抗原或抗体发生特异性结合。
常用的标记酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）等。
4.洗涤：用缓冲液洗涤孔中多余的未结合抗体或抗原，降低非特异性背景。
5.底物反应：加入适当的酶底物，酶底物与酶结合发生催化反应，使底物产生颜色或发光等可检测的反应产物。
6.反应终止：加入终止剂，停止底物的反应，防止颜色或发光信号进一步变化。
7.读取结果：使用酶标仪或光度计测定标记物的颜色或发光强度，根据标准曲线计算出待检测物的浓度。
总体来说，酶联免疫吸附试验通过特异性抗原-抗体结合和酶催化反应，可以间接或直接测定体内特定抗原或抗体的含量，具有灵敏度高、特异性强和操作简便等优点，因此在医学诊断、病毒学研究和生物学实验等领域得到广泛应用。
酶联免疫吸附试验
加样
孵育
洗板
结果分 析
比色
显色
三、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流程
▲ 例：饲料中黄曲霉毒素B1的检测：
样品、标 准品以及 试剂准备
加样(标 准品/样 品，酶结 合物）
孵育， 洗板
加入底 物溶液A、
B
粉碎 称量 提取（振荡、离心） 样品稀释，待测
黄曲霉毒素B1酶联免疫试剂盒：冰箱取出，平衡至室温
加入底物 溶液A、B
孵育
加入终 止液
三、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流程
▲ 饲料中黄曲霉毒素B1的检测：
样品、标 准品以及 试剂准备
加样(标 准品/样 品，酶 标试剂）
孵育， 洗板
结果分 析
光密度 （OD）
测量
加入底物 溶液A、B
孵育
加入终止 液
三、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流程
▲ ELISA的比色测定主要由酶标仪进行。此处强调以下几点：
加样(标 准品/样 品，酶 标试剂）
孵育， 洗板
结果分 析
光密度 （OD） 测量
加入底物 溶液A、B
孵育
加入终 止液
三、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流程
▲ 饲料中黄曲霉毒素B1的检测：
样品、标 准品以及 试剂准备
加样(标 准品/样 品，酶 标试剂）
孵育， 洗板
结果分 析
光密度 （OD） 测量
▲ （1）酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，室温宜在15－30℃，使用前先 预热仪器15－30分钟，测读结果更稳定。各种酶标仪性能不同，使用前应 详细阅读说明书。
▲ （2）比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入 比色架中，以免锈蚀酶标仪比色架。
酶联免疫吸附试验(ELISA)
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间接法测定抗体
检测抗体最常用的方法，常用于传染病的检测。
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ELISA基本过程： 抗原吸附在固相载体上，这个过程称为包被，加
待测抗体, 再加相应酶标记抗体，生成抗原--待测 抗体--酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反 应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算 抗体的量。待测抗体的量与有色产物成正比。同 理也可包被抗体，测定抗原含量。
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TMB经HRP作用后共产物显蓝色。TMB性质较稳定，可配成溶液 试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液。酶反应终止后，TMB 产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为 450nm。 ABTS虽不如OPD和TMB敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒 所采用。
HRP对氢受体的专一性很高，仅作用于H2O2、小分醇的过氧化 物和尿素过氧化物(urea peroxide)。
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结合物的保存
酶和抗体均为生物活性物质，易失活。高浓度较为稳 定，冻干后可在普通冰箱中保存一年左右。结合物溶液中 加入等体积的甘油，加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素 （例如庆大霉素）和防腐剂（HRP结合物加硫柳泵，AP结 合物可加叠氮钠）。
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结合物的稀释液
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AP的底物为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯作为 底物。产物为黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸 收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一时间。AP 也有发荧光底物（磷酸4-甲基伞酮），可用于ELISA 作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的比色法。
所有的ELISA固相均需封闭？
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ELISA酶联免疫吸附试验报告
大学实验报告酶联免疫吸附试验学院：专业：姓名：学号：一．实验原理酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种用酶标记抗原或抗体的方法，此法是将抗原、抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用原理有机地结合起来的技术，可敏感地检测体液中微量的特异性抗原或抗体。
基本原理如下：①先使用抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性；②使抗原或抗体与某种酶联结成酶标抗原或酶标抗体，这种酶标抗原或酶标抗体即保留了其免疫活性，又保留了酶活性；③试验时，把受检标本（抗体或抗原）和酶标抗原或酶标抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，用洗涤法去除固相载体上的游离物质，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的多少有关。
当加入酶反应的底物后，底物被酶催化而产生有色物质。
颜色反应深浅与受检抗原或抗体的量成正比。
因此，可借助颜色反应的深浅来定性、定量抗体或抗原。
本技术的特点是敏感性高，特异性强，操作简易，结果容易观察。
图1 ELISA实验原理示意图二．实验材料BSA抗原、兔抗BSA抗体（一抗，分别用PBS稀释成1:2, 1:4, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256七个浓度）、酶标羊抗兔IgG（二抗）、0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液、洗涤液（PBS）、底物溶液、2mol/L H2SO4。
三．实验方法1.包被板的处理：加BSA（包被缓冲液稀释为10μg/ml）至酶标板中，每孔100μl，置湿盒中4℃过夜。
第二天取出，用PBS洗涤3-4次。
2.取包被好的酶标板，在第一孔中加入100μl PBS作阴性对照，在第2-8孔加入上述稀释的一抗各100μl，置37℃保温1h。
3.倾去液体，用PBS洗涤3-4次后加入二抗各100μl，置37℃保温30min。
4.倾去液体，用PBS洗涤3-4次后加入底物溶液各100μl，在暗处37℃避光显色20min，最后加入50μl、2M H2SO4终止反应。
5.在波长490nm处，测定各孔的光密度吸收值。
酶联免疫吸附试验名词解释
酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测和定量测量体液或组织中特定抗原或抗体的存在。
以下是对ELISA的各个部分和步骤的解释：酶联（Enzyme-Linked）：ELISA利用酶的特性将目标分子（抗原或抗体）与检测信号相关联。
常用的酶有辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）和碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，AP）。
这些酶可以催化底物的反应，产生可定量测量的光学信号。
免疫（Immuno）：ELISA利用抗原和抗体之间的特异性免疫反应。
在ELISA中，试验板的表面被覆盖或固定上特定抗原或抗体，以捕获待测样本中的目标分子。
吸附（Sorbent）：试验板表面上固定的抗原或抗体能够吸附或结合待测样本中的特定抗体或抗原。
这种特异性结合是ELISA测量的基础。
试验步骤：ELISA通常包括以下步骤：捕获：将特定抗原或抗体固定在试验板表面，使其能够与待测样本中的目标分子结合。
样本加入：待测样本（例如血清、尿液或细胞上清）被加入试验板孔中，与固定的抗原或抗体发生特异性结合。
洗涤：通过洗涤步骤去除非特异性结合的物质，以减少背景信号。
探针加入：添加与目标分子特异性结合的酶标记抗体或抗原，与待测样本中的目标分子进一步结合。
洗涤：再次进行洗涤步骤以去除非特异性结合的物质。
底物加入：加入适当的底物，允许酶催化反应，生成可测量的光学信号。
读数：通过光度计或荧光检测器测量底物反应产生的光学信号强度，从而确定目标分子的存在和数量。
ELISA在医学诊断、生物学研究和药物开发等领域广泛应用。
它可以用于检测病原体感染、抗体水平测定、药物浓度测定等多种应用。
ELISA具有灵敏度高、特异性强、操作简便和可扩展性的优点。
酶联免疫吸附实验ELISA
酶联免疫吸附实验ELISA
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再加入酶标识抗原或抗体, 也经过反应而结合在固 相载体上。此时固相上酶量与标本中受检
物质量呈一定百分比。加入酶反应底物后, 底物被 酶催化成为有色产物, 产物量与标本中受检物质量 直接相关, 故可依据呈色深浅进行定性或定量分析 。因为酶催化效率很高, 间接地放大了免疫反应结 果, 使测定方法到达很高敏感度。
酶联免疫吸附实验ELISA
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2.1.2 包被方式 将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)。
换言之, 包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面 过程。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是经过物理吸 附结合, 靠是蛋白质分子结构上疏水基团与固相载 体表面疏水基团间作用于。这种物理吸附是非特 异性, 受蛋白质分子量、等电点、浓度等影响。
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惯用检验方法为: 以一定浓度人IgG（普通为 10ng/ml）包被ELISA板各孔，洗涤后每 孔内加入适当稀释度酶标抗人IgG抗体，保温后 洗涤，加底物显色，终止酶反应后，分 别测每孔溶液吸光度。控制反应条件，使各孔读 数在吸光度0.8左右。计算全部读数 平均值。全部单个读数与全部读数均数之差，应 小于10%。
酶联免疫吸附试验（ELISA）
酶联免疫吸附实验ELISA
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1. ELISA原理 ELISA基础是抗原或抗体固相化及抗原或抗
体酶标识。结合在固相载体表面抗原或抗体仍保
持其免疫学活性, 酶标识抗原或抗体既保留其免疫 学活性, 又保留酶活性。
酶联免疫吸附实验ELISA
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在测定时, 受检标本（测定其中抗体或抗原）与固相 载体表面抗原或抗体起反应。用洗涤方法使固相 载体上形成抗原抗体复合物与液体中其它物质分 开。
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讨论报告：酶联免疫吸附试验（ELISA ）一．简介 1.定义：指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上，进行免疫反应的定性和定量方法。
2.基本原理：（1）抗原或抗体的固相化（2）抗原或抗体的酶标记（3）加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。
大致流程：3.测定类型3.1酶联免疫吸附试验在酶免疫技术中所处的位置这种固相酶免疫测定方法在1971年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay ），简称ELISA 。
3.2 ELISA 实际是一种抗原抗体反应和酶催化反应具有以下性质：3.2.1 可逆性3.2.2 特异性 抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。
化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。
因此测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。
3.2.3 存在最适比例酶免疫技术酶免疫组化酶免疫测定 均相酶免疫测定 非均相酶免疫测定 固相酶免疫测定 液相酶免疫测定可用左图表示，即抗原抗体比例高于或低于某一特定适宜值，二者结合效果都会降低。
3.2.4 敏感性高 由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
3.3 ELISA 的主要测定方法ELISA 可用于测定抗原，也可用于测定抗体，各种那个测定方法中均有三个必要试剂：（1）故乡的抗原或抗体，即“免疫吸附剂”（2）酶标记的抗原或抗体，称“结合物”（3）酶反应的底物3.3.1双抗体夹心法3.3.1.1双抗体夹心法测抗原3.3.1.2双抗体夹心法测抗体3.3.2 间接法测抗体3.3.3 竞争法3.3.3.1竞争法测抗体此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg 、HBeAg 、AFP 等。
只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。
步骤如图： 用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。
此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。
乙肝标志物中抗HBsAg的检测常采用本法。
本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。
多用于传染病的诊断。
间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。
3.3.3.2竞争法测抗原4.试剂准备 现市面上易得各大生物技术公司生产的ELISA 试剂盒。
所以按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。
ELISA 中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。
自配的缓冲液应用pH 计测量较正。
从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。
试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。
5.对照设定6.标本的采取和保存7.基本操作注意事项（1）加样：在ELISA 中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。
加样时应将所加物加在LEISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。
（2）保温：抗原抗体完成反应的保温过程称为温育(incubation)。
ELISA 属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。
为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育？温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等。
37℃是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。
保温方式：ELISA 仪器附有特制的电热块，水浴。
若用保温箱：ELISA 板放在湿盒内，在盒底垫湿的纱布，最后将ELISA 板放在湿纱布上。
反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。
室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指20-25℃，但具体操作时可根据说明书的要求控制小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。
其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。
标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。
小分子激素、药物等ELISA 测定多用此法。
阳性对照品(positive control)和阴性对照品(negative control)是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照。
阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。
加入的量应与试剂的敏感度相称； 在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可以估计标本物质的量。
阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。
例如HBsAg 检测的阴性对照品中不可含HBsAg ，最好抗HBs 也是阴性。
体液、分泌物和排泄物等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。
以血清标本为例：血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份同血清。
血浆和血清可同等应用。
血清标本应避免溶血：红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP 为标记的ELISA 测定中，可能会增加非特异性显色。
温育。
应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。
为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。
（3）洗涤：洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。
ELSIA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。
清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质。
聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。
可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。
洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有流水冲洗式和浸泡式两种：A.流水冲洗式流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，洗涤液为蒸馏水，自来水。
洗涤效果更为彻底，且也简便、快速。
已有实验表明，流水冲洗式同样适用于微量滴定板的洗涤。
让水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳。
B.浸泡式微量滴定板多采用。
洗涤液为非离子型洗涤剂的中性缓冲液。
聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。
(4)显色：显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。
反应的温度和时间仍是影响显色的因素。
在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。
适当提高温度有助于加速显色进行。
TMB受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。
但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。
TMB经HRP作用后，约40分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2小时后即可完全消退至无色。
（5）比色：拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪中。
以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔），以记录本次试验的试剂状况。
其后可用空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进行计算。
结果以光密度（oplical density，OD），现按规定用吸光度（absorbence，A），两者含义相同。
通常的表示方法是，将吸收波长写于A字母的右下角，如OPD的吸收波长为492nm，表示方法为"A492nm"或"OD492nm"。
使用酶标比色仪比色时，操作时室温宜在15-30℃，使用前先预热仪器15-30分钟，测读结果更稳定。
测读A值时，要选用产物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波长。
有的酶标仪可用双波长式测读。
各种酶标仪性能有所不同，使用中应详细阅读说明书。
8.结果判定8.1定性测定定性测定的结果判断作出“有”或“无”的回答，分别用“阳性”、“阴性”表示。
在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。
根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。
在间接法和夹心法ELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。
在竞争法ELISA中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔。
两类反应的结果判断方法不同。
8.2 定量测定ELSIA操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。
测定大分子量物质的夹心法ELISA，标准曲线的范围一般较宽，曲线的值逐点连接，所得曲线一般呈S形，其头、尾部曲线趋于平坦，中央较呈直线的部分是最理想的检测区域。
9.ELISA的操作要点严谨的设计，优质的试剂，正确的操作和良好的仪器是保证ELISA必要条件。
严格遵照规定操作，必能得出准确的结果。
10.临床应用由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原，因此免疫测定的应用范围极广。
二．讨论问题：怎样才能使ELISA试验所得结果准确性提高？通过哪些可控制因素可以做到？ELISA试验涉及步骤多，影响因素较多，操作过程中每个环节都会对试验结果产生影响，可能出现错误的结果。
但如果我们控制了这些因素，就可以把其不良影响降到最低。
可以从以下几方面着手1.试剂因素（1）试剂的选择：试剂的选择是保证血液检测质量的关键要素。
现ELISA试剂均由生物技术公司出售，但不同厂家的试剂在使用效果上存在差异。
所以要选购知名度相对高的品牌，不要用无批号的试剂，最好选用与仪器配套的试剂。
更不要使用过期的试剂和混用不同批号的试剂。
（2）试剂的准备：ELISA反应涉及酶促反应，需要有适宜的温度。
因此临床试验时，将试剂从冰箱中拿出来即用的做法有可能导致对一些弱阳性标本的检测出现假阴性的后果。
所以在ELISA 测定中试剂的准备最为关键的是，将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置20～30 min 后，再进行测定，使试剂盒在使用前与室温平衡，这样做的目的能使反应微孔内的温度较快地达到所需的温度，以满足后面的测定需求。
2.样本因素（1）内源性干扰因素临床ELISA试验的样本多是直接采集患者血清，因此血清中包含多种杂质，其中目前我们大二学到的物质有补体。
补体：在固相酶免疫测定中，来自哺乳动物的固相抗体和酶标二抗均有激活人补体系统的功能。
一方面，固相抗体和酶标二抗可因其吸附及结合过程中抗体分子发生变构，使Fc 段的补体C1q 结合点暴露出来，使C1q 成为一个中介物将二者交联起来出现假阳性结果。
另一方面，固相抗体也会因为活化补体的结合，封闭抗体和抗原的表位结合能力而引起假阴性。
解决的办法是：①用EDTA 稀释标本。
②56℃30min 加热血清使C1q灭活。