第三章基因工程载体.ppt
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第三章基因工程载体
3个会导致Ampr基因失活
9个导致Tetr基因失活
氨苄青霉素和四环素抗性 24个单一克隆位点。
pBR322的优点
① 双抗生素抗性选择标记
抗生素抗性基因的插入失活效应是检测重 组体质粒的有效方法，分两次先后选择： 没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。 获得重组载体的寄主细胞 在Aplasmid ）:在整个细胞
周期中随时可以复制，每个细胞中有许多拷贝, 一般10-60 拷贝，如Col E1质粒。
氯霉素扩增：在抑制蛋白合成并阻断细菌染色体
复制的氯霉素存在时，松弛型质粒可继续扩增， 其拷贝数可达2000-3000个，称氯霉素扩增效应
严紧型复制质粒 （stringent plasmid ）：
plasmid 接合型质粒（自我转移的 质粒）：质粒可从一个细胞自发转移到另一个细胞。
Non
Conjugative plasmid 非接合型质粒
（不能自我转移的质粒）：由于失去控制细菌配 对和自我转移的基因，质粒不能从一个细胞自发 的转移到另一个细胞。
结合型质粒：相对分子质量大、拷贝数小、 严紧型复制 非结合型质粒：相对分子质量小、拷贝数多、松弛型复制
① colicin E1基因的结构 cea imm 免疫基因 kil 溶菌基因
结构基因
② 杀死不含有ColE1细菌的原因 cea + kil基因产物 ③ 不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因 imm基因
克隆位点
EcoR I
EcoR I位于E1内部，插入外源DNA导致E1 失活，使受体菌不能合成E（ColE1-），但 仍表现出对E1免疫型（ImmE1+）。
外源DNA
Colicin E1
第三章 第一节 基因工程（基因表达载体的构建）
4．为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C （图1），拟将其与质粒（图2）重组，再借助农杆菌导入菊花中。下列 操作与实验目的不符的是（ C ）
A．用限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ和连接酶构建重组质粒 B．用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞 C．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞 D．用DNA分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上
三、目的基因及其表达产物的检测鉴定
1．检测与鉴定的内容、方法
阅读教材98~99页的内容，根据表格提示的项目填写表格中缺 少的内容。
检测水平
分子水 DNA 平的检 RNA
测 蛋白质 个体水平的检测
检测内容
方法
结果显示
1．检测与鉴定的内容、方法
检测水平
检测内容
方法
结果显示
检测转基因生物的染色体 DNA分子杂交法（基因探针
3．对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全 能性高，而高度分化的动物体细胞的全能性受到限制。
4．大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但 又有所不同。大肠杆菌为原核生物，而酵母菌为真核生物（具有 多种细胞器），所以酵母菌在用于生产需要加工和分泌的蛋白质 时比大肠杆菌有优势。 有内质网和高尔基体
2．病毒感染法 用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞， 也能使目的基因导入动物细胞内。
（三）将目的基因导入微生物细胞 1．感受态细胞 经过适当的处理（如用Ca2+处理）后，细胞质膜对DNA的通透性会
发生改变，细胞变得容易接受外来的DNA，处于这种状态的细胞称为 感受态细胞。
2．过程
Ca2+处理微生物细胞
感受态细胞
基因工程基因工程的载体
2020/4/4
苏州科技学院生物系
叶亚新
第三章 基因工程的载体
作为基因工程载体的基本功能
1. 运送外源基因高效转入受体细胞 2. 为外源基因提供复制能力或整合能力 3. 为外源基因的扩增或表达提供条件
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第三章 基因工程的载体
作为基因工程载体必须具备的基本条件
1）标记基因与宿主细胞 2）标记基因产物的作用机制: Apr 3）标记基因的结构与适用范围: 基因启动子, 翻译起始
序列, 密码子偏爱性
4）标记基因的结构变化对功能的影响: LacZ, GUS
4. 常用的遗传标记基因
1) 四环素抗性基因（Tcr）
Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白 质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码 一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分 子进入细菌细胞。
第三章 基因工程的载体
载体：携带外源基因进入受体细胞的工具 用于基因工程的载体
•细菌质粒载体 •噬菌体λ衍生载体 •Cosmid载体 •Phagemid载体
•酵母质粒载体 •真核病毒载体 •Bacmid载体 •YAC载体
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发展概况
1. 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，
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2) 氨苄青霉素抗性基因（Apr）
Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。Apr 抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化β—内酰胺环的 水解，使氨苄青霉素失活。
3) 氯霉素抗性基因（Cmr）
基因工程-3.1载体
非整合型质粒
所有的质粒都至少含有一段可作为复制起点 的DNA序列， 因此能够在细胞内独立于宿主细胞本身的复 制周期而实现扩增[图2-3(a)]。
小一些的质粒可以利用宿主细胞本身的DNA 复制酶来对自身进行拷贝，而一些较大的 质粒本身携带有能够编码自身质粒复制所 需的专一性酶的基因。
整合型质粒或游离型质粒(episome)
前噬菌体被从宿主细胞切除后，大量新λ 噬菌体DNA 分子通过滚环复制模式被复制出来。形成一个包含 一系列线形基因组的连环体，由COS位点连接在一起。 该内切核酸酶是λ DNA中基因A的表达产物，能够切开 双链DNA分子并形成单链的黏末端，并与其他一些蛋 白相耦联，在将每个λ 基因组包裹入一个噬菌体头 部的过程中发挥作用。
1. 基因组小于10kb：
对一个载体来说恰好处于令人满意的范围。 2. M13基因组的复制型： 非常像质粒，实验时也能够像质粒一样被处理。 3. M13基因组容易从大肠杆菌培养中获得，也能够 通过转染而重新引入。
4. 最重要的是，以M13为载体克隆基因，能够得 到单链形式的DNA。 单链形式的克隆基因在一些技术中能够发挥作 用，尤其是DNA测序和体外突变。
分类：基于质粒的主要特征 本质是质粒的基因
质粒分为以下5种：
(1)致育(fertility)质粒或称F质粒 仅携带转移基因，能促进质粒间有性接合转移； 不再具备其他的特征。 如：大肠杆菌中的F质粒
(2)耐药性(resistance)质粒或称“R”质粒 携带有能够赋予宿主细菌对一种或多种抗菌药的耐 药性的基因，如抗氯霉素、氨苄青霉素或水银。 R质粒通过正常的繁殖而传播, 对细菌感染的治疗产 生深远的影响，如RP4，通常在假单胞菌中被发现， 但也能够在其他细菌中出现
基因工程第三章基因工程的载体
基因工程载体的种类
质粒载体
质粒是一种裸露的、独立于细菌 拟核DNA之外的DNA分子，具有 自我复制能力，可携带外源DNA 片段。
病毒载体
病毒载体是指能够将外源DNA片 段插入到病毒基因组中，并利用 病毒的复制机制将外源DNA片段 导入到受体细胞中的媒介。
基因工程载体的作用
基因转移
基因工程载体能够将外源DNA片 段导入到受体细胞中，实现基因 的转移和表达。
通过优化载体结构，提高其在宿主细胞内的稳定性，降低丢失和突变 的风险。
开发NA的载体，提高基因工 程的效率和安全性。
拓展载体功能
通过基因工程技术对载体进行改造，赋予其新的功能，如表达调控、 靶向输送等。
智能化载体
利用合成生物学和纳米技术，开发具有智能响应能力的基因工程载体， 实现基因治疗的精准化和个性化。
利用基因工程载体生产食品添加剂、 酶制剂等，提高生产效率和产品质量。
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此外，噬菌体载体还可以用于疫苗研 发和生物治疗等领域。
04 人工染色体载体
人工染色体的概念与特性
人工染色体是一种通过基因工程技术 构建的染色体，具有与天然染色体相 似的结构和功能。
人工染色体具有高容量、可定制和可 调控等特性，能够承载和表达大量的 外源基因，为基因治疗、生物制药等 领域提供了新的工具。
质粒载体的应用
总结词
质粒载体在基因工程中广泛应用于基因克隆、表达和基因治疗等领域。
详细描述
质粒载体此外，质粒载体还可以用于基因治疗和疫苗研制等领域， 为疾病治疗和预防提供了新的手段。
03 噬菌体载体
噬菌体的生物学特性
基因克隆
基因工程载体可作为基因克隆的 工具，将外源DNA片段插入到载 体中，通过复制和扩增实现基因 克隆。
基因工程载体(质粒-3章)幻灯片(1)
非接合型质粒的寄主细胞中同时存在一 种接合型质粒，那么它们通常也是可以 被转移的。这种由共存的接合型质粒引 发的非接合型质粒的转移过程，叫质粒 的迁移作用（mobiligation）又叫质粒 的诱动。
带有大肠杆菌素基因的Col质粒和带有抗菌素抗性基因的R 质粒既有属于接合型的，也有属于非接合型的。
如果在非接合型质粒的寄主细胞中同时存在一种接合 型质粒，那么它们通常也是可以被转移的。这种由共存的 接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程，叫质粒的迁 移作用(mobilization)又叫质粒的诱动。ColE1是一种可以 迁移但属于非接合型质粒。
2）F 因子
F因子是最有代表性的接合型质粒，又称致育因子 (fertility factor)或性质粒(Sex plasmid)。它在寄主细胞中有 三种存在方式：①独立于染色体之外，闭环双链DNA形式 存在。这种细胞称F+细胞。②独立于染色体之外，闭环双 链DNA形式存在，但其DNA上还携带有寄主菌染色体基因 或DNA区段。这种细胞称之为F-细胞。③以线性DNA形式， 从不同位点整合到寄主菌染色体上，这种细胞称为Hfr细胞 (高频重组细胞)。
如加入不同启动子序列，用于生产单链 DNA或RNA，外源基因的大量表达。又加 入COS位点，使载体能容纳更大的DNA片 段等等。
质粒载体的选择标记：
外源DNA片段与质粒载体DNA连接，再转化入 宿主菌，经培养后需筛选鉴定转化子。这就需 要利用质粒载体的可选择标记。
质粒载体的选择标记
抗生素抗性基因选择标记
蓝-白斑实验
构建的质粒人工载体，应用最广的是 PBR322，分子量为2.6×106，含46332bp。 含有选择标记抗氨苄青霉素（Apr）基因来 自天然质粒RSF2124和抗四环素（Ter）基因 来自PSC101质粒。复制子部分来自PMB9 （一类Co1E1质粒）。多克隆限制性内节切 酶位点有9个
第三章载体ppt课件
2. 质粒载体必须具备的基本条件
（1）具有复制起点（ORI） （2）具有抗菌素抗性基因：是筛选的标志。理想的
载体应该有两种抗菌素抗性基因。 （3）若干限制性内切酶的单一位点：用来插入外源
DNA片断。且插入后不影响复制功能。 （4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。
3. 质粒的选择标记及其工作原理：
（2）长度: 约2.7kb （3）克隆位点: 10个连续的单一限制酶切位点，位于lacZ’基因的
5’端。
（4）选择标记：Ampicillin 抗性和 lacZ的肽 互补（蓝白斑）相结合。
蓝白斑选择原理： ① Xgal ② -半乳糖苷酶Xgal显色反应：-半乳糖苷
酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一 个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。 ③ lacZ的肽互补
加到1000个以上。
（4） 插入失活型质粒载体
载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内 部。如pDF41、pDF42、pBR329。
（5） 表达型质粒载体
主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。注意启动子的 性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。如果在大 肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核生物的基因置于大肠杆 菌的转录—翻译信号控制之下。
六、其它质粒载体
1. pGEM-3Z
由pUC派生而来。与pUC的主要区别是 在MCS的两侧分别加了一个噬菌体启动子 T7和SP6。可被T7和SP6的RNA聚合酶识 别转录。
2. 穿梭质粒载体（shuttle plasmid vectors）
（1）穿梭质粒载体的结构
人工构建的具有两种不同复制起点和选 择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存 活和复制的质粒载体。
1）-肽（ lacZ’ ）： -半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨
基因工程-第三章 基因工程的载体
2）根据应用对象分： 原核生物克隆载体
植物克隆载体
动物克隆载体
3）按照功能分：
克隆载体: 克隆一个基因或DNA片断 表达载体: 用于一个基因的蛋白表达 整合载体: 把一个基因插入到染色体组中
1 质粒克隆载体
2 病毒（噬菌体）克隆载体
3 染色体定位整合克隆载体
4 人工染色体克隆载体
2） Vir区：位于T-DNA 上游的一组基因，表达产物能
激活T-DNA 向植物细胞转移，引发植物肿瘤，显示细 菌的致病性。
3) Con区：含有tra基因，农杆菌之间转移接合
4) Oir区：调控质粒的自主复制
与大肠杆菌的质粒载体不同，构建的Ti质粒载体 不真正用于细菌，而是用于植物细胞，农杆菌只 起着中间介导的作用。
5 特殊用途克隆载体
1 质粒克隆载体
1.1 与构建克隆载体相关的质粒性质
1.2 质粒载体必须具备的基本条件
1.3 质粒克隆载体的构建
1.1 与构建克隆载体相关的质粒性质
质粒载体以质粒DNA 分子为基础构建的克隆载体，含有质
粒的复制起始位点，能够按质粒复制的形式进行复制。 1.1.1 质粒组成与构型 1.1.2 质粒DNA大小 1.1.3 质粒DNA的复制
为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。
克隆载体的结构特征(Character of Vector)
多克隆位点(multiple cloning site, MCS)
MCS
复制起始点
(Replication Origin, ORI)
ori
pUC
Ampr
遗传标记(Genetic selection mark)
每个宿主细胞仅含1-3份的拷贝。
基因工程第3章 基因克隆载体(1质粒载体)
诱导物：IPTG
• IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵 子的启动转录，使受体菌基因组中的 lacZ 的C端部分和载体的lacZ’肽都 表达。从而互补。 • 但载体MCS上插入外源DNA后，不能 产生肽！
lacZ的肽互补
• -肽（ lacZ’ 基因编码）：-半乳糖苷酶N端 的一段氨基酸片断（11-41氨基酸）。 • lacZ只有在4聚体的状态下才有功能。 • pUC质粒载体上的lacZ’ 编码的肽与这个缺 失突变的-半乳糖苷酶“互补”，使它能形 成4聚体，又能分解Xgal，产生蓝色物质。
• pBR322质粒是按照标准的质粒载体命 名法则命名的。
• “p”表示它是一种质粒； • “BR”则是分别取自该质粒的两位主 要构建者F．Bo1ivar和 R．L．Rodriguez姓氏的头一个字母， • “322'’系指实验室编号，以与其他质 粒载体如pBR325，pBR327， pBR328等相区别。
合适的启动子
• 真核生物基因在原核生物中表达，改 用原核生物或病毒（噬菌体）基因的 启动子。
• 原核生物基因在真核生物中表达，仍 用原核生物基因的启动子。 • 选用外界条件诱导的启动子。
(1) 质粒克隆载体pBR322
• pBR322是经人 工改造的一种较 为理想的大肠杆 菌质粒载体，应 用广泛。现在已 经被许多更优良 的新型克隆载体 所替代。 (P40)
• （1）分子量大，拷贝数低
• 第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子 长 9.1 kb。但只有一个EcoR I切点充当克隆位点， Tetr 作为筛选标志。
（2）筛选标志不理想
• ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1 （colicin E1）。 • colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌，形 成“噬菌斑”。 • 唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个基因 的内部。因此可通过插入失活筛选。但细 菌群体容易自发突变出抗colicin E1的细 胞…….
基因工程-2-载体ppt课件
③易操作,id)
1.柯斯载体的组成
由质粒和λ粘性末端“尾巴”两部分组成。
2.柯斯载体的特点
① 带有抗药性标记 ② 带有质粒的复制起始点 ③ 带有多个限制酶的单一切点 ④ 带有λ噬菌体粘性末端片段
3.cosmid载体的优点
insert) form URA3 auxotrophy selectable marker (yeast) yeast centromeric sequence ARS1 yeast origin of replication
第二节 噬菌体载体
一、 λ噬菌体载体
1. λ噬菌体结构特点: ①线性双链DNA分子 ②可在E.coli中大量繁殖 ③具非必需区(约1/3长度） ④两端具12个核苷酸单链互补粘性末端
⑷ 建立λDNA的体外包装。
噬菌体的包装过程
主要外壳蛋白质 是基因E的产物
连环DNA
头部前体
基因A的产物在cos 位点切割噬菌体 DNA
基因W和FII 的产物组装 蛋白质加完 包含在外壳中的 整的尾部 基因D的产物
λDNA的体外包装
头部基因 （琥珀突变型）
转录复制 蛋白质合成
体外包装的重组DNA比裸 露的DNA导入受体细胞的 效率高100-10000倍
2.酵母菌质粒载体的特点
①含有E.coli质粒的复制起始序列。
②含有酵母的筛选标记（如LEU2） ③具有合适的供外源基因插入的限制酶切割位点。
④酵母菌稳定型质粒载体
着丝粒
Type bacterial origin promoter selectable marker
selectable marker
一 基因工程的基本元件 ------载体
质粒载体
1.柯斯载体的组成
由质粒和λ粘性末端“尾巴”两部分组成。
2.柯斯载体的特点
① 带有抗药性标记 ② 带有质粒的复制起始点 ③ 带有多个限制酶的单一切点 ④ 带有λ噬菌体粘性末端片段
3.cosmid载体的优点
insert) form URA3 auxotrophy selectable marker (yeast) yeast centromeric sequence ARS1 yeast origin of replication
第二节 噬菌体载体
一、 λ噬菌体载体
1. λ噬菌体结构特点: ①线性双链DNA分子 ②可在E.coli中大量繁殖 ③具非必需区(约1/3长度） ④两端具12个核苷酸单链互补粘性末端
⑷ 建立λDNA的体外包装。
噬菌体的包装过程
主要外壳蛋白质 是基因E的产物
连环DNA
头部前体
基因A的产物在cos 位点切割噬菌体 DNA
基因W和FII 的产物组装 蛋白质加完 包含在外壳中的 整的尾部 基因D的产物
λDNA的体外包装
头部基因 （琥珀突变型）
转录复制 蛋白质合成
体外包装的重组DNA比裸 露的DNA导入受体细胞的 效率高100-10000倍
2.酵母菌质粒载体的特点
①含有E.coli质粒的复制起始序列。
②含有酵母的筛选标记（如LEU2） ③具有合适的供外源基因插入的限制酶切割位点。
④酵母菌稳定型质粒载体
着丝粒
Type bacterial origin promoter selectable marker
selectable marker
一 基因工程的基本元件 ------载体
质粒载体
第三章 基因工程载体
表达载体与克隆载体的区别
Hale Waihona Puke 强启动子，一个可诱导的强启动子可使外源基因 有效的转录 在启动子下游区和ATG（起始密码子）上游区有 一个好的核糖体结合位点序列（SD序列），促进 蛋白质翻译 在外源基因插入序列的下游区要有一个强转录终 止序列，保证外源基因的有效转录和mRNA的稳 定性
表达型载体（expression vector）
Apr TcS为重组子 Apr Tcr为原载体 ApS Tcr为重组子 即为非重组子
pUC系列的质粒载体
pBR322质粒的复制起点 Amp抗性基因，但核苷酸序列不含有原来限制 性核酸内切酶的单一酶切位点 大肠杆菌β-半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其 编码α-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ‘基 因 位于lacZ'基因中的靠近5”端的一段多克隆位点 (MCS ，multiple cloning sites)区，但它 并不破坏该基因的功能
4、
去除两 个PstI
pBR318 （6.3Kb)
酶切 体外重组 酶切
pBR313
EcoRII片 断去掉
pBR322 (4.3Kb)
pBR320 (2.8Kb)
四、常用质粒载体类型
1、克隆质粒载体
2、表达质粒载体
3、多功能质粒载体
4、穿梭质粒载体
1、克隆质粒载体
克隆质粒载体是指专用于基因或DNA片断无性繁
pBR322插入失活效应
筛 选 重 组 子 的 示 意 图
Amp r
1)限制酶切 2)DNA重组 无DNA插入
Tc
有DNA插入
Amp r Tcr
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载体的分类
按功能分类 克隆载体 表达载体 整合载体
克隆一个基因或DNA片断 用于一个基因的蛋白表达 把一个基因插入到染色体组中
按来源分类 质粒载体 噬菌体载体 柯斯质粒载体 人工染色体载体
第一节 克隆载体
➢质粒载体 ➢噬菌体载体 ➢噬菌体-质粒杂合载体 ➢人工染色体
一、质粒载体
1.质粒的概念
质粒（plasmid)是一种存在于细菌或 真菌染色体外的小型环状双链DNA 分 子，可自我复制和表达。
helper plasmid
mob mRNA Mob protein
recipient cell
部分质粒虽不含tra基因，但含bom位点，当宿主细胞内同时存在
含mob基因的辅助质粒时，mob基因的产物可打开非接合质粒的
bom位点(oriT位点)，借助接合质粒tra基因的产物，使非接合质 粒被动迁移到受体细胞中，这种现象称为迁移作用(mobilization)。
2. 克隆载体应具备的条件。 3. 质粒的基本性质。 4. 标记基因的分类及其作用。 5. 原核表达载体的表达元件，有哪几种表达方式。
基因工程流程图
遗传物质 + 载体 重组的DNA分子 引入细胞或生物体内 复制与表达 稳定地遗传给下代
载体的概念
1）独立的一个基因或DNA片段，不 能自我复制，一般不可以进入受体 细胞的； 2）采用理化方法进入细胞后，也不 容易在受体细胞内维持。 基因工程载体（vector）：能够把外 Cell propagation 源DNA片段带入受体细胞并进行稳 定遗传的DNA或RNA分子。
3. 生化标记基因
其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如 LacZ
并不是寄主生长所必需的，但可以赋 予寄主某些抵御外界环境因素不利影响 的能力（带有抗性基因等） 。
分子量在1-200kb之间 。
大肠杆菌的质粒
一、 质粒载体
2.质粒的空间构型 ①共价闭合环状DNA（Covalent close circular DNA，
cccDNA) 呈超螺旋（SC）（super coil）
一、 质粒载体
标记基因的种类 1. 抗性标记基因（可直接用于选择转化子）
a. 抗生素抗性基因: Apr ，Tcr ，Cmr，Kanr，G418r，Hygr ，Neor b. 重金属抗性基因: Cur ，Znr ，Cdr
2. 营养缺陷标记基因（可直接用于选择转化子）
主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因， 这 类基因在酵母转化中使用最频繁，如LEU2，HIS4等。
具有不相容性的质粒组成的群体称为不相容群，一般具有相 同的复制子。
以大肠杆菌的质粒为例： ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容
一、 质粒载体
c. 质粒的可转移性
接合型质粒(含tra基因) 能在天然条件下自发地从一个细胞转移 到另一个细胞（接合作用）。甚至能使寄主染色体上的基因随
一、 质粒载体
a. 质粒的自主复制性
质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制。 质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系。根据 在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型： 严紧型复制控制的质粒（stringent plasmid） (拷贝数少，为1-5个) 和松弛型复制控制的质粒（relaxed） (拷贝数多，可达10-200个拷 贝) 因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。
一、 质粒载体
② 开环DNA（ open circular， ocDNA） 一条链上有一至数个缺口。
③ 线形DNA （ linear ，LDNA）
一、 质粒载体
同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同： SC DNA最快、L DNA次之、OC DNA最慢。
OC L
SC
一、 质粒载体
3. 质粒的基本特性 ➢ 质粒的自主复制性 ➢ 质粒的不相容性 ➢ 质粒的可转移性 ➢ 携带特殊的遗传标记
Transformation of bacterial host cell
Recombinant vector
载体的功能
载体的功能 运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
载体的要求
A、复制起点：能在受体中复制； B、筛选标记； C、限制性内切酶切割位点； D、外源基因的表达：启动子。 E、载体的大小：原则上要求载体越小越好； F、适当的拷贝数； G、载体的安全性：质粒不能随便转移;
DNA重组技术的基本工具
基因的剪刀（分子手术刀） ——限制性核酸内切酶
基因的针线（分子缝合针） ——DNA连接酶
基因的运输工具（分子运输车） ——载体
第三章 基因工程载体
第一节 克隆载体 第二节 表达载体 第三节 其它特殊用途载体
本章重点掌握的内容
1. 掌握载体、克隆载体、表达载体、穿梭载体、质 粒、α-互补、插入失活、人工染色体载体的概念。
质粒 pBR322 及其衍生质粒 pUC 系列质粒及其衍生质粒 pSC101 及其衍生质粒 ColE1
复制子 pMB1 突变的 pMB1 pSC101 ColE1
拷贝数 15～20 500～700 ～5 15～20
一、质粒载体
b. 质粒的不相容性(incompatibility,又称质粒的不亲和性) 两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性。
其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。不符合基因工程 的安全要求
非接合型质粒(不含tra基因) 不能在天然条件下独立地发生接合 作用。
用于构建克隆载体的质粒一般是非接合型质粒 。
一、 质粒载体
质rom conjugative plasmid
bom site Mob gene
一、 质粒载体
d. 携带特殊的遗传标记 野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基
因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，如： 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 标记基因的作用
1.指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子 2.指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞