实验3. 凝胶过滤法使蛋白质脱盐
蛋白质脱盐
蛋白质脱盐——凝胶过滤法【实验目的】了解凝胶过滤层析技术的工作原理，掌握凝胶过滤层析技术，获得脱盐后的目的蛋白质溶液【实验原理】目的蛋白质用盐析法从细胞裂解中沉淀分离后，其中尚有大量的硫酸铵，需要脱盐才能获得较纯的样品。
常用的脱盐方法有透析法、电透析法和凝胶过滤法。
透析法及电透析法耗时长，样品稀释度大，不易放大进行大规模生产，所以工业生产中应用较少。
凝胶过滤层析脱盐过程中盐分子和蛋白质分子大小差异巨大，蛋白质溶液中小分子的盐分子随着层析流动相进入孔径较小的固定相致辞使其在层析中的迁移速率小，而蛋白质因分子尺寸较大，不能随流动相进入固定相中，因此在层析柱中的迁移速率大，首先从层析术中流出，实现脱盐。
用凝胶过滤法脱盐时，为了使盐同蛋白质充分地分离，除了应选用足够长的层析柱之外，还应对样品的体积加以限制。
样品的体积如果过大就导致蛋白质带同盐带不能分开。
一般来就，样品体积不超过床体积的30%。
这一数据的确定是根据盐和蛋白质的分离体积（Vsep）决定的。
两种物质分离体积的定义为，当两种物质的混合物在凝胶过滤层析柱上能够完全分离时的最小体积（参看图一）。
它在数值上等于：Vsep=V eB-V eAC1/2 V由于种种原因（例如样品在柱中的微小振动、固定相和流动相之间的不平衡，样品在柱中发生的纵向扩散等），产生的洗脱峰总是比理论值要宽得多。
如果上柱用的样品体积等于Vsep时，由于上述原因，两种物质的洗脱曲线会重叠造成分离失败（如图二所示），因此，上样体积应Vsep，但是上样体积过小会造成样品过度稀释。
为了提高脱盐样品的得率，上样体积一般15-20%床体积。
一般脱盐层析柱，应为粗短型柱，以提高脱的工作效率。
用凝胶过滤层析技术对白质溶液进行脱盐处理时，样品的浓度对分离效果，没有影响，但是，如果样品浓度过大，就会造成样品粘度增大，引起层析带和洗脱速率不稳定，造成洗脱曲线变宽和扭曲。
在选用洗脱液时，应考虑蛋白质的稳定性和蛋白质同层析介质之间的非特异性吸附作用，所以一般选用离子强度大于0.02的磷酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液，如果脱盐后的蛋白质溶液要进行冷冻干燥处理时，应选用可以挥发的缓冲物质制备洗脱液，例如，乙酸铵、碳酸氢铵、乙酸乙烯二胺盐等。
实验三 凝胶过滤法分离蛋白质
实验三凝胶过滤法分离蛋白质【实验目的】了解凝胶层析的基本原理，并学会用凝胶层析分离纯化蛋白质。
【基本原理】凝胶过滤其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。
凝胶过滤的主要装置是填充凝胶颗粒的层析柱。
目前使用较多的凝胶时交联葡聚糖凝胶（商品名是Sephadex）。
这种高分子材料具有一定孔径的网络结构。
高亲水，在水溶液里吸水可膨胀。
其交联高的小号胶Sephadex-G-25适用于脱盐。
当在填充好凝胶颗粒的层析柱顶加入被分离的分子大小不同的混合物并用洗脱液洗脱时，小分子物质可进入胶粒内部，而受排的大分子不能进入胶粒内部，由此二者在洗脱过程所经路程长短不同而得以分离。
由于大分子物质只能沿着胶粒之间的间隙向下流动，所经路程短，最先流出；而渗入胶粒内部的小分子物质受迷宫效应的影响，要经过层层扩散向下流动，所经路程长，最后流出；通透性居中的分子则后于大分子而先于小分子流出。
从而按由大到小的顺序流出实现分离的目的。
凝胶过滤的操作条件温和，适于分离不稳定的化合物。
凝胶颗粒不带电荷，不与被分离物质发生反应，因此溶质回收率接近100%，而且设备简单、分离效果好、重现性强，凝胶柱还可反复使用，所以广泛应用于蛋白质等大分子物质非分离纯化、分子质量测定、脱盐等用途。
在含有血红蛋白（M w=64500）的溶液中加入过量的高铁氰化钾（K3Fe（CN）6，M w=327.25）,血红蛋白与高铁氰化钾反应生成高铁血红蛋白（MetHb）。
为了除去多余的高铁氰化钾，等到较纯的MetHb（红褐色）洗脱较快，而小分子高铁氰化钾（黄色）洗脱较慢，从而达到将MetHb完全分离出来的目的。
【实验试剂、材料和器材】（一）试剂（1）0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）：称取磷酸氢二钠20.7472g和磷酸二氢钠3.1167g，溶于约900mL的蒸馏水中，调pH值到7.0，最后定容到1000mL。
蛋白质生化技术实验报告
蛋白质生化实验报告生殖免疫研究所薛樱子学号：1133111003实验一溶液中蛋白质浓度的测定一光吸收法（测量范围：0.1—2mg）1实验原理：由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，它们具有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在280nm波长处，且在此波长内吸收峰的光密度值OD280nm与其浓度成正比关系，故可作为蛋白质定量测定的依据。
纯蛋白的A280/A260为 1.8，纯核酸的A280/A260为2步骤：2.1）打开仪器的电源开关（接220V交流电），打开比色槽暗箱盖，选择光源，选档，选波长，用调零旋钮调暗电流至0 。
2.2）将空白对照样品和待测溶液装入石英比色杯2.3）将仪器的比色槽暗箱合上，比色槽处于蒸馏水（或校正缓冲液）校正位置，旋转光量调节器使电表指针正确处于0 。
2.4）拉出比色槽手柄拉杆使比色槽处于样品位置读数。
2. 5）在260nm和280nm分别读数（分别用缓冲液调0），根据上表查处相应蛋白浓度，根据喜事倍数计算原溶液蛋白浓度，根据体积计算总蛋白量。
3结果与分析：A280=0.571 A260=0.340根据公式：蛋白浓度=1.5 ×A280 —0.75 ×A260=1.5×0.571—0.75×0.340=0.6015也可以根据蛋白质和核算含量折算图表画出一条直线估算蛋白质的浓度。
结果说明我的蛋白样品浓度是0.6015mg/ml。
二Folin—酚法（测量范围：10-300ug/ml）1实验原理：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。
Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合物）。
在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。
2试剂：2.1）甲液：１，4%碳酸钠；2，0.2n氢氧化钠；3，1%硫酸铜；4,2%酒石酸钾钠。
1和2，4溶于500ml水中，然后和4以50：1混合。
葡聚糖凝胶Sephadex G–25柱层析法脱盐分离蛋白质实验技术总结
凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结 构。网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富 于弹性的半固体状态。人工合成的凝胶网 眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼， 小于筛眼的物质分子均可通过，大于筛眼 的物质分子则不能，故称为“分子筛”。 小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼，并 随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动， 从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒 的网眼，如此连续下去，直到流过整个凝
胶
柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢； 大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不 能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶 颗粒的间隙流动，其流程短、阻力小、 流速快，比小分子先流出层析柱；小分 子最后流出。分子大小介于完全排阻不 能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质 分子，则居中流出。这样被分离物质即 被按分子的大小分开。
层析法的基本原理
层析法是利用混合物中各组分物理化学性 质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲 和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为 固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为 流动相）体系中的分布程度不同，从而使各组分 以不同的速度移动而达到分离的目的。
如盐析（粗分级分离）向蛋白质 溶液中加入大量的中性盐[（NH4)2SO4， Na2SO4，Na2SO4]，使蛋白质脱去水化 层而聚集沉淀，这种现象称为盐析。
可见，不同类型的各种凝胶溶涨所需 的最少时间是不相同的，请参考有关的技 术数据。 在凝胶溶涨的处理过程中，不能进行 剧烈搅拌，禁止使用电磁搅拌器，以为这 样会使凝胶颗粒破裂而产生碎片。
2. 装柱
将层析剂装入柱中进行层析的方法称 柱层析法。 作层析用的柱子称层析柱。 柱子的一 端为进口，另一端为出口，出口端底部有 烧结玻璃砂板 ，能阻止层析剂流出，溶剂 则可流过。 层析柱的长短粗细根据实验的 目的而定，一般说来，凝胶层析时柱越长， 分离效果越好。但柱过长，层析时间长， 样品易稀释造成扩散。
凝胶过滤法分离蛋白质实验报告
凝胶过滤法分离蛋白质实验报告
凝胶过滤法是一种分离蛋白质的方法。
本实验使用交联葡聚凝胶，其具有一定孔径的网络结构，能够根据分子大小的不同进行分离。
大分子物质只能沿着胶粒之间的间隙向下流动，所经路短，最先流出；而小分子物质要经过层层扩散向下流动，所经路程长，最后流出，通透性居中的分子则后于大分子而先于小分子流出。
从而实现分离的目的。
实验步骤包括凝胶溶胀、装柱、样品处理、上样和过滤、部分收集和凝胶回收。
在收集洗脱液的过程中，开始时为无色透明，但时间过去，试管中收集的红褐色开始变深，到最后，试管的颜色为深褐色，接着溶液的颜色开始变浅，红褐色几乎要消失。
接着又开始出现浅黄色，再到黄色，再黄色开始慢慢变浅，最后又变成无色透明。
这是因为分子的扩散有快有慢，少量的高铁血红蛋白与缓冲液一起滴出，使得溶液慢慢加深。
3.经过过滤后，溶液变成深褐色，这是高铁血红蛋白的本色。
颜色越深，表示过滤后蛋白质越纯。
4.随着洗脱的进行，红褐色开始变浅。
这是因为大部分高铁蛋白已经被洗脱，只剩下一小部分洗脱较慢的高铁蛋白。
5.开始呈现浅黄色，并逐渐变成无色，这是由于高铁氰化钾的扩散速度不同。
一部分高铁氰化钾扩散得很快，接着大部分K3Fe(CN)6被洗脱出来，最后全血几乎被洗脱完毕。
试管中接收的是缓冲液。
6.红褐色先释放出来，然后才是黄色。
这是因为血红蛋白与高铁氰化钾反应生成高铁血红蛋白，因为高铁血红蛋白的分子较大，洗脱速度较快。
而小分子的高铁氰化钾（黄色）洗脱较慢，因此红褐色先被洗脱出来，黄色则稍后。
实验三蛋白质的盐析分离和凝胶层析
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蛋白质提取、分离、纯化及鉴定技术
• 材料（取材一定要新鲜，在低温下操作）
• 破细胞（匀浆器，研钵，超声波，反复冻融，化学方法，酶 解等）
• 蛋白质提取（根据物质的性质，水、盐溶液、稀酸、稀碱、有 机溶剂）
• 蛋白质分级分离（盐析分级分离、有机溶剂分级分离、等电点 分离）
• 进一步纯化（透析、柱层析：分子筛、离子交换、亲和层析、 HPLC）
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二、有机溶剂沉淀分离
有机溶剂沉淀出的蛋白质沉淀比盐析沉淀出的蛋白质沉淀易于过 滤或离心分离，分辨率好，但容易使蛋白质变性，通常在低温下 进行。
三、选择性沉淀法（等电点、热变性、酸 碱变性等）
四、吸附法 五、重金属盐沉淀法
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蛋白质的进一步纯化（细分级）
• 一、透析和超过滤
• /~cmg/
• / • 赵永芳. 生物化学技术原理及应用.北京. 科学出版
社.2002 • 沈同 王镜岩.生物化学.高等教育出版社.2002
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２、蛋白质的盐析分离和凝胶层析脱盐
• 蛋白质的盐析分级分离 • SephadexG-25脱盐 • 盐离子的跟踪检测 • ＵＶ检测蛋白质
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凝胶层析原理
• 凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等 。
• 对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全
被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体
积为外水体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进
入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的
体积为内水体积）。分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程
凝胶过滤法分离蛋白质.
实验三凝胶过滤法分离蛋白质【原理】在含有血红蛋白(Mw＝64 500)加入过量的高铁氰化钾(K3Fe(CN)6，Mw＝327.25)，血红蛋白与高铁氰化钾反应生成高铁血红蛋白(methemoglobin，MetHb)。
为了除去多余的高铁氰化钾，得到较纯的MetHb样品，将上述混合物通过交联葡聚糖凝胶柱，用磷酸缓冲液洗脱，从颜色的不同，可直接观察到MetHb(红褐色)洗脱较快，而小分子高铁氰化钾(黄色)洗脱较慢，达到将MetHb完全分离出来的目的。
【试剂】1．抗凝全血2．四氯化碳(CCl4)3．生理盐水4．交联葡聚糖G-25(细粒)5．0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)6．0.4% K3Fe(CN)6 。
【操作步骤】1．凝胶准备称取5g交联葡聚糖G-25，倾入锥形瓶中，加蒸馏水约60ml溶胀，搅动后静置。
待凝胶沉积后，用倾注法除去浮于表面的细粒，重复3次。
将溶胀后的凝胶用10倍体积的磷酸缓冲液浸泡过夜，以达平衡。
2．装柱取玻璃层析柱(25cm×1.5cm)一支，垂直装好。
加入缓冲液，打开出口，将气泡赶出，关闭出口。
然后从管顶向柱内加入缓冲液8cm左右高，将平衡后的交联葡聚糖G-25悬浮液边搅拌边加入柱内，再打开出口，使液体流出，继续不断地加入交联葡聚糖G-25悬浮液，柱内凝胶柱床沉积至高20cm左右时为止。
床面上覆盖3ml缓冲液，关闭出口，在凝胶柱面上加盖一层圆形滤纸，使层析柱稳定5～10min后，接储液瓶，打开出口，用2倍于床体积的磷酸缓冲液洗脱平衡，最后关闭出口。
3．样品处理(1) 血红蛋白溶液的制备取草酸盐抗凝全血3ml离心，吸去上层血浆，加入5倍体积的冷生理盐水，混匀后3 000r/min离心5min，弃去上清液，重复洗3次。
最后一次吸去上清液后，在红细胞层上面加等体积蒸馏水，振摇。
再加1/2体积CCl4，用力振摇3min，3 000r/min离心5min。
吸取上层澄清的血红蛋白液备用。
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4.收集检查 用刻度离心管收集洗出液，每管收集1ml。 边收集边进行蛋白质与铵盐的检查。 （1）取洗出液2滴加入白瓷板穴中，加入钠 氏试剂1滴，如有铵盐洗脱下来，则有黄红色沉 淀。 （2）取洗出液2滴置小试管中，加入磺柳酸 1滴，如有蛋白质洗脱下来，则有白色混浊或沉 淀出现。
1）NH4+检查
2）蛋白质检查
（二）连接层析装置
1. 先将层析柱垂直固定在铁架台上。 2. 按下图将各部位连接起来。
洗 脱 液 连 接 软 管 层 析 柱
连 接 软 管 收 集 容 器
（三）装柱与层析
1.装柱 向层析柱中注入少量洗 脱液（去离子水），将凝胶 浆液沿玻棒缓慢倾入柱中 （注满）。凝胶自然沉积约 1～2cm 高度后打开下端出 水口,待凝胶床面上升到约 3/4柱高停止。关闭出水口, 静置。
生物化学实验之－－
实验三
凝胶过滤法使蛋白质脱盐
山东师范大学生命科学学院
【实验目的】
学习凝胶过滤法分离纯化蛋白质的原 理与操作技术
【实验原理】
凝胶层析又称分子筛层析、排阻层析或 凝胶过滤，是以凝胶为载体，根据蛋白质的 大小和形状，即蛋白质的相对分子质量进行 分离和纯化。 该方法广泛用于生将烧杯中的洗脱液与层 析柱接通，然后拧松螺旋夹，让洗脱液滴下冲洗 层析柱，以除杂质并使柱床均匀密实（此步也称 作平衡）。适当时间后（流下的洗脱液体积一般 。 为柱床体积的2～3倍），再拧紧螺旋夹。 洗柱过程中注意调整流速约2ml/min。
3.加样与洗脱 用刻度吸管吸取 1ml 样品（蛋白质－硫酸 铵溶液），其尖头小心沿层析柱内壁伸到床面 之上，慢慢将样品加到凝胶床面上（不可搅动 床面），此时能看到床面上样品与洗脱液之间 有一清晰界面。拧松螺旋夹，待样品全部进入 凝胶柱中 , 接通洗脱液，开始洗脱并收集洗出 液。
凝胶过滤蛋白质 实验报告
凝胶过滤蛋白质实验报告引言凝胶过滤是一种常用的分离和富集蛋白质的方法，可以帮助实验室快速纯化目标蛋白质。
本实验旨在探索凝胶过滤蛋白质的原理、步骤和应用。
原理凝胶过滤是利用由聚合物构成的过滤介质对蛋白质进行筛选和富集的方法。
通过选择合适的孔隙大小，可以将目标蛋白质分离出来，同时去除其他小分子的干扰物。
实验步骤以下是凝胶过滤蛋白质的基本步骤：1.准备工作：清洁实验器材，并确保实验环境无菌。
2.制备样品：收集待处理的蛋白质样品，并进行必要的预处理，例如去除细胞碎片和其他杂质。
3.准备过滤器：选择适当的凝胶过滤器，根据样品的性质和目标蛋白质的大小选择合适的分子量截止值。
4.过滤处理：将样品缓冲液加入过滤器上方的容器中，然后缓慢注入待处理样品。
5.收集蛋白质：将目标蛋白质从过滤器中收集下来，并用适当的缓冲液洗脱。
6.蛋白质的浓缩和储存：将收集到的蛋白质溶液进行浓缩处理，然后储存在低温条件下。
实验结果凝胶过滤蛋白质实验可以得到以下结果：1.目标蛋白质的分离：通过凝胶过滤，可以将目标蛋白质从其他较小分子的干扰物中分离出来。
2.蛋白质的纯度提高：凝胶过滤可以去除杂质，从而提高蛋白质样品的纯度。
3.蛋白质的浓缩：通过凝胶过滤，可以将稀释的蛋白质样品浓缩，使其更易于后续实验操作。
实验注意事项在进行凝胶过滤蛋白质实验时，需要注意以下事项：1.实验环境无菌：确保实验器材和操作环境无菌，以避免外部污染对实验结果的影响。
2.适当选择过滤器：根据样品的性质和目标蛋白质的大小，选择合适的凝胶过滤器和分子量截止值。
3.调整缓冲液pH值：根据目标蛋白质的特性，调整缓冲液的pH值，以确保其最佳分离效果。
4.避免过度浓缩：在浓缩蛋白质样品时，注意不要过度浓缩，以免损害蛋白质的结构和功能。
应用领域凝胶过滤蛋白质的方法在生物化学、分子生物学和生物医药等领域得到广泛应用。
以下是一些常见的应用领域：1.蛋白质纯化：凝胶过滤可以帮助实验室从复杂的混合物中高效纯化目标蛋白质。
凝胶过滤层析脱盐
2.点击“方法”， 打开界面，点击界 面左下方选项，分 析输入参数。
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点击“方法”，再 点击下方的“采样 控制”，将采样结 束时间改为180分 钟，点击“采用”。
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记录图谱 保存路径
点击“电压范 围”及“时间 范围”调整电 压值范围1~10 和时间值范围 0~10。（放大 查看）
合适型号的凝胶。蛋白质脱盐一般选用Sephadex G -25。 凝胶的前处理: 凝胶干粉在使用前需充分溶胀，并脱气。溶胀时间和方
法见上表。凝胶使用完后经处理可重新使用，而且凝胶
的价格比较昂贵，故使用完毕需回收。 层析柱的选择：当用同样体积的层析柱分离两种以上物质时，长的层析柱
比短的分辨率要高，一般理想的层析柱的直径与长度之比
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N 2000 生化工作站使用方法：
基本的液相层析由流路系统、层析分离系统、检 测系统、数据处理系统等部分组成。在本实验中 流路系统为恒流泵、层析分离系统为层析柱、检 测系统为紫外检测仪、数据处理系统为N2000生化 工作站（包括数据采集器及N2000数据分析软件）。 数据采集器、N2000数据分析软件及电脑部分的安 装连接已经完成并编好号安放在固定的位置，使 用时注意数据线与仪器的配套。鼠标保存在教师 处，请使用者到教师处登记领取，用毕交回。
峰高
0
4
8
12
16
20
24
28
32
36
40
44
48
52
56
60
64
流速0.4
流速0.7
流速1.4
管数
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洗脱峰收集方法：越靠近峰顶，收集液越纯。
10Leabharlann 试剂和器材主要仪器
恒流泵(点击查看操作方法） 紫外检测仪 N2000生化工作站软件 电脑
实验三 蛋白质脱盐(透析和凝胶过滤)
用部分收集器收集洗脱液。合并与峰值相对应的试管中的洗脱液，即为脱盐后的蛋白质
溶液。
7、 用氯化钡溶液检测蛋白质溶液和其他各管收集液，评价脱盐效果。
结果处理
记录并解释实验现象，讨论凝胶过滤的脱盐效果。 注意事项
1、 整个操作过程中凝胶必须处于溶液中，不得暴露于空气，否则将出现气泡和断层，应当 重新装柱。
分子的大小和工作目的，选择适合的凝胶型号。交联度高的小号胶如 Sephadex G-25 适于脱
盐。
当在凝胶柱顶加上分子大小不同的混合物并用洗脱液洗脱时，自由通透的小分子可以进
入胶粒内部，而受排阻的大分子不能进入胶粒内部。二者在洗脱过程中走过的路程差别较大，
大分子只能粘着胶粒之间的间隙向下流动，所经路程短，最先流出。而渗入胶粒内部的小分
在真空干燥器中减压除气，准备装柱。
2、 装柱：将层析柱垂直固定，加入 1/4 柱长的蒸馏水。把处理好的凝胶用玻棒搅匀，然后
边搅拌边倒入柱中（柱口保持排放）。最好一次连续装完所需的凝胶，若分次装入，需
用玻棒轻轻搅动柱床上层凝胶，以免出现界面，影响分离效果。最后放入略小于层析柱
内径的滤纸片，保护凝胶床面。
实验材料
1、Sephadex G-25
2、鸡蛋清溶液: 将新鲜鸡蛋的蛋清与水按 1:20 混匀,然后用六层纱布过滤。
操作步骤
1、 凝胶溶胀：取 5g Sephadex G-25，加 200ml 蒸馏水充分溶胀（在室温下约需 6h 或在沸水
浴中溶胀 2h）。待溶胀平衡后，用虹吸法除去细小颗粒，再加入与凝胶等体积的蒸馏水，
子受迷宫效应影响，要经过层层扩散向下流动，所经路程长，最后流出。通透性居中的分子
则后于大分子而先于小分子流出。从而按由大到小的顺序实现大小分子分离。
实验三 凝胶层析法脱盐和分离蛋白质(0806)
实验三Sephadex G-25凝胶层析法脱盐和离子交换柱层析分离菠萝蛋白酶一、Sephadex G-25凝胶层析法脱盐（一）目的和要求掌握凝胶层析法的原理及操作技术。
（二）原理凡盐析所获得的粗制蛋白质（盐析得到的IgG）中均含有硫酸铵等盐类，这类将影响以后的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为“脱盐”（desalthing）。
脱盐常用透析法和凝胶过滤法，这两种方法各有利弊。
前者的优点是透析后析品终体积较小，但所需时间较长，且盐不易除尽；凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也短，但其凝胶过滤后样品体积较大。
凝胶过滤（gel filtration），又称为凝胶层析（gel chromatography）、分子筛过滤（molecular sieve filtration）、凝胶渗透层析（gel osmotic chromatography）等。
它是20世纪60年代发展起来的一种层析技术。
其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。
凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构。
网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的半固体状态。
人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼，小于筛眼的物质分子均可通过，大于筛眼的物质分子则不能，故称为“分子筛”。
凝胶之所以能将不同分子的物质分开是因为当被分离物质的各成分通过凝胶时，小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼，并随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动，从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒的网眼，如此连续下去，直到流过整个凝胶柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢；大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动，其流程短、阻力小、流速快，比小分子先流出层析柱；小分子最后流出。
分子大小介于完全排阻不能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质分子，则居中流出。
这样被分离物质即被按分子的大小分开。
实验3. 凝胶过滤法使蛋白质脱盐
（二）连接层析装置
1. 先将层析柱垂直固定在铁架台上。 2. 按下图将各部位连接起来。
洗 脱 液 连 接 软 管 层 析 柱
连 接 软 管 收 集 容 器
No Image
（三）装柱与层析
1.装柱 向层析柱中注入少量洗 脱液（去离子水），将凝胶 浆液沿玻棒缓慢倾入柱中 （注满）。凝胶自然沉积约 1～2cm 高度后打开下端出 水口,待凝胶床面上升到约 3/4柱高停止。关闭出水口, 静置。
葡聚糖凝胶的商品名称为 Sephadex，它具有三维空间的 多孔网状结构，呈珠状颗粒。
本实验用G-25使蛋白质与(NH4)2SO4分离，当 蛋白质的盐溶液进入葡聚糖凝胶时，小分子的 (NH4)2SO4扩散进入G-25的网孔中，而大分子的 蛋白质因颗粒直径大，不能进入网孔中，被排阻 在凝胶颗粒的外面。加入洗脱液洗脱时，因大分 子的蛋白质从凝胶颗粒的间隙随洗脱液向下流动， 首先被洗脱下来，而小分子的(NH4)2SO4可以扩散 进出凝胶颗粒的网孔之中，随洗脱液移动时受到 阻滞力较大，在层析柱中移动较慢，这样蛋白质 与(NH4)2SO4很容易地分离开，从而达到对蛋白质 样品脱盐的目的。
加入洗脱液洗脱时因大分子的蛋白质从凝胶颗粒的间隙随洗脱液向下流动首先被洗脱下来而小分子的nh42so4可以扩散进出凝胶颗粒的网孔之中随洗脱液移动时受到阻滞力较大在层析柱中移动较慢这样蛋白质与nh42so4很容易地分离开从而达到对蛋白质样品脱盐的目的
生物化学实验之－－
实验三 凝胶过滤法使蛋白质脱盐
山东师范大学生命科学学院
2.洗柱 通过细乳胶管小心地将烧杯中的洗脱液与层 析柱接通，然后拧松螺旋夹，让洗脱液滴下冲洗 层析柱，以除杂质并使柱床均匀密实（此步也称 作平衡）。适当时间后（流下的洗脱液体积一般 。 为柱床体积的2～3倍），再拧紧螺旋夹。 洗柱过程中注意调整流速约2ml/min白质－硫酸 铵溶液），其尖头小心沿层析柱内壁伸到床面 之上，慢慢将样品加到凝胶床面上（不可搅动 床面），此时能看到床面上样品与洗脱液之间 有一清晰界面。拧松螺旋夹，待样品全部进入 凝胶柱中 , 接通洗脱液，开始洗脱并收集洗出 液。
凝胶过滤层析脱盐
❖ 材料
葡聚糖凝胶G-25（ SephadexG-25)
❖ 试剂
0.02mol/L, pH6.5磷酸缓冲液
精品课件
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操作步骤
液相层析系统的组成……13 层析柱的结构……………15 层析柱的安装…………..18 装柱………………………20 装柱效果举例…………..23 检测仪的准备…………..24 加样………………………26 层析检测过程示意图…..28 洗脱峰收集方法………..29 凝胶回收………………..30 分离效果例举…………..31 紫外检测仪的使用………32 N 2000 生化工作站使用…35
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液相层析系统的组成：
基本的液相层析由流路系统、层析分离系统、 检测系统、数据处理系统等部分组成。在本实验中：
1.流路系统： 恒流泵及输液管道 2.分离系统： 层析柱 3.检测系统： 紫外检测仪 4.数据采集处理系统：
数据采集器 N2000色谱工作站分析软件 5.输出系统： 电脑显示器及打印机
精品课件
凝胶过滤层析脱盐
在进行离子交换层析纯化之前，样品要 求尽可能去除盐分子。
凝胶过滤层析简介
概念：以葡聚糖凝胶为固定相，以水溶液为流动相， 当水溶
小不同而
性生物大分子通过层析柱时，根据它们分子大
进行分离的技术。
原理： 凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，
被分离的混合物流过层析柱时，比凝 胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内， 在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，洗 脱体积小，最先被洗脱出来；比网孔 小的分子能不同程度的自由出入凝胶 孔内外，在柱内经过的路程较长，洗 脱体积大，最后被洗脱出来。由此达 到分离。
下端柱头结构
滤膜 密封圈
垫圈
生物化学与分子生物学基本试验试验一蛋白质的盐析与透析试验
生物化学与分子生物学基本实验实验一蛋白质的盐析与透析实验目的了解蛋白质的盐析与透析的原理和意义实验原理血清中的蛋白质，用盐析的方法，可以分离出清蛋白、α、β球蛋白和γ-球蛋白三种。
详情见盐析技术。
另选择适宜孔径的半透膜，使蛋白质分子被截留，小分子的中性盐透出而达分离的目的。
但透析时正负离子透过半透膜的速度不同，如硫酸铵中的NH4+的透出较快，膜内SO42-剩余而生成H2SO4，其酸度足以使蛋白质变性，因此，除盐时开始应对0.14 mol·L-1的NH4OH透析。
本实验分别用双缩脲试剂和Nessler试剂检验蛋白质和NH4+的存在。
仪器材料和试剂药品仪器材料：（1）离心管、试管及试管架。
（2）2m1刻度吸管、玻璃棒、小烧杯。
（3）透析袋。
（4）离心机。
试剂药品：（1）饱和硫酸铵溶液。
（2）硫酸铵粉末。
（3）双缩脲试剂称取CuSO4·5H2O 2.5g，加蒸溜水少许，微热溶解后稀释至100ml。
另取酒石酸钾钠（NaKC4H4O6·H2O）10g和KI 5g，溶于500ml蒸馏水中，再加入20％氢氧化钠300ml，混匀后，慢慢加入硫酸铜溶液中，加蒸馏水至1000ml。
此液可长期储存。
（4）Nessler试剂称取150g碘化钾置于三角烧瓶中，加蒸馏水100ml使之溶解，再加入110g碘，待完全溶解后加140g～150g汞，用力振摇10分钟左右，此时产生高热，须将三角烧瓶放入水中继续摇动，直至棕红色的碘转变成带绿色的碘化汞钾为止。
将上清液倾入2000ml容量瓶中，并用蒸馏水洗涤瓶内的沉淀数次，将洗涤液一并倒入容量瓶内，用蒸馏水稀释至刻度，此为贮存液，储于棕色瓶中备用。
取贮存液150ml，加10％氢氧化钠700ml，混匀后加蒸馏水150ml，混匀，此为应用液，储于棕色瓶中，如混浊可过滤或静止数天后取上清液使用。
本试剂需有适宜的pH值，调节至用1 mol/L盐酸20ml滴定时，需本试剂11.0ml～11.5ml时为宜。
葡聚糖凝胶层析脱盐
注意事项
检查胶平面是否水平； 加样品及洗脱液时勿冲到胶平面； 控制流速；
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思考题
蛋白质脱盐的方法：
半透膜透析 超滤
离子交换色谱等
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思考题
影响凝胶分离效果的因素： 1、凝胶的选择：视分离混合物的组成而定，是大分子 物质与小分子物质分开，即组别分离；还是相对分子质 量比较接近的物质进行分离，即分级分离。
若鉴定的第6号管中，仍有样品，表明洗脱和收集不够， 需增加7号、8号……
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操作步骤
管号 项目
白色沉淀量 蓝色深浅
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
+ ++
++ +
8、再生 鉴定完毕，打开出水口，继续用２～３倍床体积洗脱
剂洗脱，洗脱后关闭出口，以备下次使用。
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结果处理
1、根据实验结果，在同一坐标系中，以收集的管号为横 坐标，检测物质的量为纵坐标，绘制二条（蛋白质及 （NH4）2SO4）洗脱曲线。 2、分析混合样品分离效果。
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操作步骤
5、上样与收集 打开出口排水，当胶床与上方水层的弯月面相切时，
加入0.6mL混合样液。上样完毕，开始收集一号管。每管 收集洗脱液2mL。
当样液进入胶床，其弯月面与胶平面相切时，暂停排 液，用滴管将洗脱剂沿柱内壁旋转着加入1cm高水位，然 后排液，至其弯月面与胶平面相切，再缓缓注入3～5cm高 的洗脱剂。
6、洗脱
不断向柱内加洗脱剂，保持胶床上水位3～5cm。出口
流速控制在每6秒1滴，直至收集到6号管达2mL。
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操作步骤
7、鉴定 另取6只干净试管，按收集顺序将洗脱液一分为二。
实验三蛋白质的盐析分离和凝胶层析
版社.2002
２、蛋白质的盐析别离和凝胶层析脱盐
• 蛋白质的盐析分级别离 • SephadexG-25脱盐 • 盐离子的跟踪检测 • ＵＶ检测蛋白质
蛋白质提取、别离、纯化及鉴定技术
• 材料〔取材一定要新鲜，在低温下操作〕 • • 破细胞〔匀浆器，研钵，超声波，反复冻融，化学方法，酶
蛋白质的分级别离〔粗分级〕
一、盐析沉淀别离 1、盐溶和盐析现象：低盐浓度下蛋白
质的溶解度随盐浓度的增加而增加； 盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的 溶解度随盐浓度的增加而减小析出。 2、盐的选择：通常采用中性盐，硫酸 铵、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠等。 3、硫酸铵浓度的计算与调整： 〔1〕加硫酸铵饱和液：V=V0〔S2— S1〕/〔1—S2〕；
二、有机溶剂沉淀别离 有机溶剂沉淀出的蛋白质沉淀比盐析沉
淀出的蛋白质沉淀易于过滤或离心别离， 分辨率好，但容易使蛋白质变性，通常 在低温下进展。 三、选择性沉淀法〔等电点、热变性、酸 碱变性等〕 四、吸附法 五、重金属盐沉淀法
蛋白质的进一步纯化〔细分级〕
• 一、透析和超过滤 • 二、层析〔色谱〕别离 • 1、气相色谱〔色谱仪〕 • 2、液相色谱：纸层析和薄层层析〔分配层析〕、柱
端采用数据库工具
MS-SQL 在网络上
进展分析结果的存档、
检索及打印等。
• 高效液相色谱仪
气 相 色 谱 仪
蛋白质的盐析别离原理
用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程 称为蛋白质的盐析作用。蛋白质是亲水胶体，在 高浓度的中性盐影响下脱去水化层，同时，蛋白 质分子所带的电荷被中和，结果蛋白质的胶体稳 定性遭到破坏而沉淀析出。经透析或用水稀释时 又可溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。分 子量大的蛋白质〔如球蛋白〕比分子量小的〔如 白蛋白〕易于析出。改变盐浓度，使不同分子量 的蛋白质分别析出。
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主讲人：XXX
生物化学实验之－－
实验三 凝胶过滤法使蛋白质脱盐
山东师范大学生法分离纯化蛋白质的原 理与操作技术
【实验原理】
凝胶层析又称分子筛层析、排阻层析或凝 胶过滤，是以凝胶为载体，根据蛋白质的大小和 形状，即蛋白质相对分子质量进行分离和纯化。
谢谢观看
共同学习相互提高
本实验用G-25使蛋白质与(NH4)2SO4分离，当 蛋白质的盐溶液进入葡聚糖凝胶时，小分子的 (NH4)2SO4扩散进入G-25的网孔中，而大分子的 蛋白质因颗粒直径大，不能进入网孔中，被排阻 在凝胶颗粒的外面。加入洗脱液洗脱时，因大分 子的蛋白质从凝胶颗粒的间隙随洗脱液向下流动， 首先被洗脱下来，而小分子的(NH4)2SO4可以扩散 进出凝胶颗粒的网孔之中，随洗脱液移动时受到 阻滞力较大，在层析柱中移动较慢，这样蛋白质 与(NH4)2SO4很容易地分离开，从而达到对蛋白质 样品脱盐的目的。
凝胶过滤层析过程示意图
【器材与试剂】
（一）器材 1. 层析柱 (15mm×300mm） 2. 铁架台 3. 滴定管夹 4. SephadexG－25 5. 刻度吸管
（二）试剂 1. 样品溶液 蛋白质－硫酸铵溶液 2.10％黄柳酸 3.钠氏试剂 4.洗脱液（去离子水）
【实验操作】
（一）凝胶的溶胀 取Sephadex G－25， 加入去离子水置室
温溶胀 24小时 以上，反复倾 泻去掉细颗粒， 或沸水浴中煮沸 2～3小时，可去 除颗粒内部的空 气及灭菌。
（二）连接层析装置
1. 先将层析柱垂直固定在铁架台上。 2. 按下图将各部位连接起来。
洗 脱 液
连 接 软 管
层 析 柱
连 接 软 管
收 集 容 器
（三）装柱与层析
1.装柱 向层析柱中注入少量洗
脱液（去离子水），将凝胶 浆液沿玻棒缓慢倾入柱中 （注满）。凝胶自然沉积约 1～2cm 高度后打开下端出 水口,待凝胶床面上升到约 3/4柱高停止。关闭出水口, 静置。
2.洗柱 通过细乳胶管小心地将烧杯中的洗脱液与层
析柱接通，然后拧松螺旋夹，让洗脱液滴下冲洗 层析柱，以除杂质并使柱床均匀密实（此步也称 作平衡）。适当时间后（流下的洗脱液体积一般
。
为柱床体积的2～3倍），再拧紧螺旋夹。 洗柱过程中注意调整流速约2ml/min。
3.加样与洗脱
用刻度吸管吸取1ml样品（蛋白质－硫酸 铵溶液），其尖头小心沿层析柱内壁伸到床面 之上，慢慢将样品加到凝胶床面上（不可搅动 床面），此时能看到床面上样品与洗脱液之间 有一清晰界面。拧松螺旋夹，待样品全部进入 凝胶柱中, 接通洗脱液，开始洗脱并收集洗出 液。
该方法广泛用于生物大分子的分离、纯化、 浓缩等。
凝胶是一类具有多孔立体网状结构的不溶 性珠状颗粒。多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂 糖)类物质，用它来进行物质分离，主要是根据 多孔凝胶对不同相对分子质量的物质具有不同 的排阻效应实现的。
葡聚糖凝胶的商品名称为 Sephadex，它具有三维空间的 多孔网状结构，呈珠状颗粒。
4.收集检查 用刻度离心管收集洗出液，每管收集1ml。 边收集边进行蛋白质与铵盐的检查。 （1）取洗出液2滴加入白瓷板穴中，加入钠
氏试剂1滴，如有铵盐洗脱下来，则有黄红色沉 淀。
（2）取洗出液2滴置小试管中，加入磺柳酸 1滴，如有蛋白质洗脱下来，则有白色混浊或沉 淀出现。
1）NH4+检查 2）蛋白质检查