电穿孔法转染人树突状细胞条件的优化
通过机电穿孔法（电机械穿孔）促进向细胞的分子导入
通过机电穿孔法（电机械穿孔）促进向细胞的分子导入通过机电穿孔法(电机械穿孔)促进向细胞的分子导入-电场诱发气泡的行为控制对细胞的基因操作做出贡献-重点1.应用由电介质覆盖的微细电极构成的核壳结构注1 )的泡沫喷射器，提出了史无前例的电机械装置，并举例说明了定向电场诱发气泡注2 )在生物医学工程中的可用性。
2.通过调节细胞悬液的粘度，使微泡反复膨胀收缩，促进了基因向细胞的导入，成功地向各种类型的细胞导入了大分子。
3.本操作技术有望在制药、研究基因工程、流体工程等诸多领域做出贡献。
概要九州大学研究生院工学研究院的黄文敬特任助教、佐久间臣耶副教授、鸟取直友助教、山西阳子教授、产业技术综合研究所生物过程研究部门的菅野茂夫主任研究员等研究小组通过控制电场诱发的气泡，对细胞进行力学刺激，有效地在细胞膜上穿孔，成功地将数兆道尔顿注3 )的分子导入细胞。
细胞膜穿孔技术不仅是将在细胞内表达的生物分子的活性可视化，也是使基因操作成为可能的技术。
但是，很难将可以拥有巨大基因组信息的大分子导入细胞。
本研究通过重新审视该技术，展示了使用由被电介质材料复盖的微细电极构成的核壳结构的微泡注射器(下图)，在电机械穿孔中在细胞上形成穿孔，表明可以将拥有巨大基因组信息的大分子导入细胞。
通过向电极施加脉冲电压，在电极的前端产生了微泡，现在可以同时对细胞施加电和机械刺激。
通过使用这样独创性的手法，也可以将数兆道尔顿的分子导入到一般被认为难以导入分子的成骨细胞和衣原体中。
特别是发现通过增加细胞悬液的粘度(下图b )可以提高导入效率，推测这是通过电场诱发气泡的反复膨胀收缩(振动波)实现的(下图)。
由于可以应用于各种各样的细胞，所以有望应用于新的基因工程。
本研究于2022年10月20日(日本时间)刊登在英国皇家化学会的科学期刊《Lab on a Chip》上。
研究成果简图( a )泡沫喷射器。
( b )电子机械公司的概念图。
低浓度或高浓度细胞的悬浮液同时暴露于电场和力学的刺激下。
电穿孔法转染人树突状细胞条件的优化
Ｏｐｔｍｕｍ ｎｄ ｔｏ ｆＴａ ｓ ｅ ｔｏ ｎ ｎ ｉｉ ｌ ｅ ｔ ｐｏ ａ ｉｎ ｉ Ｃｏ ｉｉｎｓ ｏ ｎ ｆ ｃ ｉ ｎ ｏ Ｄｅ ｄｒｔｃ Ｃｅ ｌ ｂｙ Ｅｌｃｒｏ ｒ ｔｏ ｓ
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第２ ２卷 第 ４期
２ｏ 年 ｏ８长 治 医学 院 报 Ｊ ＯＵＲＮＡＬ Ｏ Ｆ ＣＨＡＮＧ ＺＨＩ ＭＥＤＩ ＣＡＬ ＣＯＬ ＬＥＧ Ｅ
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基 础研 究 ・
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电穿孔法转染人树突状细胞条件的优化
电穿孔法转染人树突状细胞条件的优化(作者：___________ 单位： __________ 邮编：___________ )作者：单铁英苏安英唐军民【摘要】目的：通过电穿孔法将带有增强型绿色荧光蛋白基因(enhan ced gree n fluoresce nt protein EGFP )的真核表达载体plRES2-EGFP( IRES2 in ternal ribosome en trysite 2 内部核糖体进入位点2)质粒导入未成熟树突状细胞( Immature Den driticCell,imDC)，探讨不同电穿孔条件对imDC电转染率和存活率的影响。
方法：通过密度梯度离心法分离人外周血单核细胞，采用细胞因子体外培养诱导其成为imDC在大肠杆菌中扩增plRES2-EGFP质粒，选择不同的电压、脉冲时间、细胞浓度、DNA剂量等。
应用电穿孔仪将PIRES2-EGFP质粒导入未成熟树突状细胞，荧光显微镜下和光镜下分别计算绿色荧光阳性细胞数和总细胞数。
0.4%锥虫蓝(trypan blue) 染色，计数电转染后细胞存活率。
结果：当imDC浓度为5X 106/mL 与6卩g DNA质粒混合，设定电转染仪电压为300 V、脉冲时间为500 卩s时,其电转染率到最高，细胞存活率最高，转染后24 h明显表达，48h后表达最强。
结论：在适当的电压、脉冲时间下，选择适当的细胞浓度、DNA剂量，在转染后的一定时间范围内，电穿孔法转染imDC可使目的基因获得较高的转染率，且细胞死亡最少。
电转染提供了外源基因转染imDC的可行技术。
【关键词】电穿孔转染绿色荧光蛋白树突状细胞Abstract Objective:plRES2-EGFP was successfully tran sfactedinto immature dendritic cells by means of electroporation in order to investigate the effect of electransfection efficiency and survival rate of immature dendritic cells in different con diti ons.Methods:M ono cytes obta ined form huma n peripheral blood by density guadient centrifugation are induced into imDCs in the presenee of cytokines in vitro.plRES2-EGFP was amplified inE.coli.imDCs were tran sferred with pIRES2-EGFP by means of electroporati on with differe nt electric voltages,times of impulse,cell concen trati onsand the doses of DNA.Numbers of green fluorescence positive cells and the total cell number were coun ted respectively un der fluoresce nt microscope and visible light microscope.the cells were stained with 0.4% trypan blue,electransfection efficiency and the cell survivalrate were counted.Results:Electransfection efficiency wasin creased to the highest value whe n imDCs with theconcentration of 5X 106 cells/mL were mixed with 60 卩g-total DNA,the electric voltage of electroporation apparatus was set at 300V,and the time of impulse was 500 卩s.There wassig ni fica nt and the highest expressi on of plRES2-EGFP respectively at 24 h and at 48 h after tran sferri ng.C on clusio n:A higher tra nsfecti on efficie ncy of target genes can be obta ined by means of electroporati on with suitable electric conditions.Electric transfection provides atech ni cal possibility to make DNA into imDCs.Key words Electroporati on; Tra nsfect;Gree n fluoresce nt protein;Dendritic cell;Human树突状细胞（dendritic cell,DCs ）作为体内惟一能活化初始T细胞的抗原递呈细胞（antigen presentingcell,APC），是激发机体特异性免疫反应的关键，其在抗肿瘤免疫治疗领域中的作用受到广泛关注，以DCs为基础构建的各种类型的疫苗在多种肿瘤免疫治疗的基础和临床研究中显示了旺盛的生命力和良好的前景[1,2] 。
电穿孔转染重组杆状病毒到昆虫细胞的研究
电穿孔转染重组杆状病毒到昆虫细胞的研究陈卫东;杨靖佳;井申荣;曾韦锟;黄芬【期刊名称】《生命科学研究》【年(卷),期】2013(017)001【摘要】目前转染细胞时常用阳离子脂质体如Cellfectin,这种方法成本高,效果不稳定,而用电穿孔转染外源基因到昆虫细胞的文献报道极为少见.构建重组杆状病毒基因组GFP/BAC,用电穿孔法和脂质体法转染到昆虫细胞Sf9中,比较两种方法的转染效率.研究发现,两者转染效率分别为86.14％和86.53％.两种转染方法的子代重组杆状病毒能够继续转染Sf9细胞,荧光强度无明显差异.电穿孔转染效率与脂质体转染接近,但电穿孔法操作简便,周期较短,成本很低.%The basic ion liposome, such as Cellfectin, is usually used to transfect cell at present. The shortage of this method is expensive and instable. While the literature report that transfect exogenous gene into insects cells by electroporation is very rare. Construct the restructured baculovirus genome GFP/BAC and transfect into the insects cells Sf9 by electroporation and liposome Cellfectin, then compare the transfection efficiency of these two methods. The result show that the transfection efficiency of the two methods respectively is 86.14% and 86.53%, and the filial generation restructured baculovirus continue transfect Sf9 cell and the fluorescence intensity of these two methods was not obviously distinct. The transfection efficiency of electroporation is compared with liposome Cellfectin, while the advantages of electroporation is simple operation, short cycle and low cost.【总页数】6页(P5-10)【作者】陈卫东;杨靖佳;井申荣;曾韦锟;黄芬【作者单位】昆明理工大学生命科学与技术学院,中国云南昆明650500【正文语种】中文【中图分类】Q31【相关文献】1.重组杆状病毒表达Sf-caspase-1双链RNA对昆虫细胞凋亡的影响 [J], 欧艳梅;许晓东2.重组杆状病毒感染悬浮昆虫细胞及r重组蛋白表达策略的优化 [J], 李文丽;刘霞;刘在新;卢曾军;范朋举3.杆状病毒-昆虫细胞表达系统在复合体重组表达应用中的研究进展 [J], 万婧;相兴伟;江玲丽;周向阳4.重组杆状病毒／昆虫细胞表达体系在肿瘤研究中的应用 [J], 魏海明5.昆虫细胞中表达eGFP基因的重组杆状病毒的构建 [J], 唐晓艳;高冬妮;李梅;葛菁萍;平文祥;楼庄伟因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
electroporation method
Electroporation(电穿孔)方法一、概述电穿孔是一种生物学实验中常用的方法，它通过利用电场使细胞膜通透性增加，从而促进外部物质的进入或出去。
本文将从电穿孔的基本原理、应用领域、实验操作以及优缺点等方面展开讨论。
二、基本原理电穿孔是利用外加电场对生物体细胞膜造成的电压诱导其通透性增加，使其能够对高分子物质进行暂时性的内吞和外排的一种方法。
在电场的作用下，细胞膜受到电场的影响，出现孔道和通道，从而实现对细胞内外物质的交换。
三、应用领域1. 基因转染电穿孔方法可用于细胞内外质粒DNA、mRNA、siRNA、蛋白质等分子的转染，是目前广泛应用的基因转染方法之一。
2. 药物递送将药物通过电穿孔方法直接导入细胞内，可以提高药物的作用效果，减少药物使用量，降低药物对身体的毒副作用。
3. 细胞治疗在癌症等细胞治疗领域，电穿孔方法可用来引导抗癌药物或免疫治疗剂直接进入肿瘤细胞内，以增强治疗效果。
四、实验操作1. 细胞准备将需要进行电穿孔处理的细胞培养在培养皿中，保持其在对数生长期。
2. 电穿孔处理将细胞用PBS等缓冲液洗涤后，加入待处理的蛋白质、DNA或药物溶液，然后放入电穿孔仪器中进行处理。
3. 细胞培养将处理过的细胞重新培养在含有适当培养基的培养皿中，保持其在恒温箱内培养一段时间。
五、优缺点1. 优点（1）转染效率高：电穿孔处理后，细胞通透性增加，使得外源DNA、药物等分子能够较高效率地进入细胞内。
（2）处理快速：电穿孔处理的时间较短，一般在几十毫秒至几秒之间。
2. 缺点（1）细胞毒性：处理过程中会对细胞产生一定的损伤，影响细胞的生长和代谢。
（2）使用限制：由于电穿孔方法对细胞有一定的毒性和损伤，因此不能应用于一些对处理条件敏感的细胞系。
六、结论电穿孔方法作为一种重要的基因转染和药物递送方法，在生物学研究和临床治疗中得到广泛应用。
然而，其存在的缺点和不足也需要我们更加深入的研究和改进，以促进其在相关领域的更广泛应用。
电穿孔法转染猪胎儿成纤维细胞条件优化
电穿孔法转染猪胎儿成纤维细胞条件优化张庆晓;王慧利;孟春花;王锋;曹少先【摘要】以增强型绿色荧光蛋白为报告基因,采用L9(33)正交试验设计,对质粒浓度、电压、脉冲时间等3个因素进行优化,并比较了不同温度处理对转染效率的影响,以及电压对细胞存活率的影响.结果表明,3个因素中质粒浓度对转染效率的影响最大,质粒浓度和电压对转染效率均有显著影响,脉冲时间对转染效率的影响不显著.不同温度处理下的转染效率无显著差异,电压显著影响细胞存活率.质粒浓度40 g/mL、电压280 V、脉冲时间800 s条件下,转染效率最高,为89.8％.【期刊名称】《江苏农业科学》【年(卷),期】2012(040)012【总页数】3页(P202-204)【关键词】猪;胎儿成纤维细胞;电穿孔;转染;效率;增强型绿色荧光蛋白【作者】张庆晓;王慧利;孟春花;王锋;曹少先【作者单位】江苏省农业科学院畜牧研究所/江苏省农业科学院动物品种改良和繁育重点实验室,江苏南京210014【正文语种】中文【中图分类】S813外源基因的高效转染是动物基因功能研究与应用中比较关键的步骤。
目前将外源基因导入哺乳动物细胞的方法有很多，大体分为2大类：一类是病毒载体法[1]，主要是通过逆转录病毒载体或DNA病毒载体携带外源基因进入细胞，该方法虽然比较有效，但存在携带基因片段不能太大及安全隐患等问题；另一类是非病毒载体法，主要包括显微注射、微粒子轰击、磷酸钙共沉淀、脂质体转染[2]、精子载体[3-4]、电穿孔[5]等理化方法，其中显微注射法和微粒子轰击法操作较为复杂，磷酸钙共沉淀法转染效率较低，脂质体转染法存在较强的细胞毒性，精子载体法的转染效果不太明确，而质粒电转染法不仅适用的细胞系广泛，而且操作相对简单，更重要的是转染效率较高。
目前电穿孔技术在许多细胞系均获得了比较理想的转染效率。
徐峰等通过优化电压、电容及质粒条件，在原代大鼠肾小球系膜细胞获得了40%以上的转染效率[6]。
Mimics转染PC12细胞条件的优化
doidoi:10.3969/j.issn.1002-2481.2022.03.05山西农业科学2022，50（3）：314-318Journal of Shanxi Agricultural Sciences Mimics转染PC12细胞条件的优化任静，郝琴琴，成俊丽，李鹏飞（山西农业大学生命科学学院，山西太谷030801）摘要：PC12作为模式细胞已被广泛应用于多种疾病研究。
为探究高效、低毒的PC12的细胞转染方法，试验采用化学转染法，以带有5′-羧基荧光素（FAM）标记的NC mimics作为外源基因，分别用RFect、D-Portal、Tran‑sIntro TM EL、Lipofectamine3000和Lipofectamine2000等5种转染试剂转染PC12细胞以筛选最佳转染试剂；然后设置NC-FAM mimics浓度为50、60、70、80、90、100nmol/L，通过倒置荧光显微镜观察PC12细胞在最佳转染试剂下的荧光信号对转染效果进行评定。
结果表明，在相同的培养条件下，不同转染试剂对PC12细胞的转染效果之间存在较大差异，其中，TransIntro TM EL转染后荧光强度最高，D-Portal、Lipofectamine3000和Lipofectamine2000转染后荧光信号次之，RFect转染后荧光信号最弱；且不同处理对细胞损害无显著差异。
以TransIntro TM EL作为最佳转染试剂进一步优化NC-FAM mimics转染浓度发现，荧光强度随NC-FAM mimics浓度的增加呈现先增强后降低的趋势，且在NC-FAM mimics浓度为70nmol/L时荧光信号最强；此外不同浓度下的细胞数量无显著差异。
综上可见，以TransIntro TM EL作为转染试剂、NC-FAM mimics浓度为70nmol/L时，转染后PC12细胞荧光强度最高，转染效果最好。
关键词：PC12；化学转染法；TransIntro TM EL；NC-FAM mimics；荧光信号中图分类号：Q78文献标识码：A文章编号：1002-2481（2022）03-0314-05Optimization of Mimics Transfection Conditions in PC12CellsREN Jing，HAO Qinqin，CHENG Junli，LI Pengfei（College of Life Science，Shanxi Agricultural University，Taigu030801，China）Abstract：PC12cells has been widely used as a model for researches on many diseases.To explore transfection methods of PC12cells with high efficiency and low toxicity,in this study,using chemical transfection and taking5'-carboxyfluorescein (FAM)-labeled NC mimics as the foreign gene,five different chemical transfection reagents（RFect,D-Portal,TransIntro TM EL,Lipofectamine3000and Lipofectamine2000）were applied to transfect PC12cells for screening the optimal transfection reagent.Then,concentrations of NC-FAM mimics were set to50、60、70、80、90、100nmol/L,and transfection effects were evaluated by observing fluorescence signal of PC12cells with the optimal transfection reagent under an inverted fluorescence microscope.The results showed that transfection effects between different transfection reagents were significantly different on PC12cells under the same culture condition.The TransIntro TM EL had the highest fluorescence intensity,the group of D-Portal、Lipofectamine3000and Lipofectamine2000took the second place and the RFect had the lowest.In addition,there was no significant difference on injury of cells by different treatments.The further results showed that the trend of fluorescence intensity was first increased and then decreased with increase of the NC-FAM mimics concentration when TransIntro TM EL was taken as the optimal transfection reagent to optimize the NC-FAM mimics transfection concentration.And fluorescence signal was the strongest when the concentration of NC-FAM mimics was70nmol/L.There was also no significant difference on amounts of cells by different concentration.In summary,the PC12cells transfected with the concentraion of70nmol/L of NC-FAM mimics by Transintro TM EL as the optimal transfection reagent in this study had the highest-intensity fluorescence and the best transfection effect.Key words：PC12;chemical transfection;TransIntro TM EL;NC-FAM mimics;fluorescence signal将外源基因导入真核细胞内并使其表达的技术称为细胞转染技术，该技术是研究基因表达调控的重要手段。
电穿孔法转染人乳腺癌细胞mcf-7的条件优化研究
Vol.6 No.1Feb. 2020生物化工Biological Chemical Engineering第 6 卷 第 1 期2020 年 2 月电穿孔法转染人乳腺癌细胞MCF-7的 条件优化研究闫东科，许凤霞，吕平*，李冬（天津职业大学生物与环境工程学院，天津 300350）摘 要：通过控制电穿孔时的电压、电脉冲时长、电脉冲次数、质粒浓度和细胞状态等转染条件，将pcDNA3.1(+)-EGFP 质粒转入MCF-7细胞，于倒置荧光显微镜下观察EGFP 表达情况以检测转染效率，探讨不同电穿孔条件对人乳腺癌MCF-7细胞转染效率的影响，确定MCF-7细胞的最佳电转染条件。
结果表明：人乳腺癌细胞MCF-7在电压150 V、质粒浓度1 μg/μL 左右、脉冲数2次、脉冲时长5 ms、传代时间24 h 时可达到较高的电转染率。
关键词：电转染；人乳腺癌细胞MCF-7；转染参数；转染效率中图分类号：R737.9 文献标志码：AThe Optimal Conditions for Efficient Transfection of Human Breast Cancer MCF-7 Cells by ElectroporationYan Dong-ke, Xu Feng-xia, Lv Ping *, Li Dong(College of Biological and Environmental Engineering, Tianjin Vocational Institute, Tianjin 300350)Abstract: By controlling the transfection conditions such as voltage, pulse duration, pulse number, plasmid concentration and cell status, pcDNA3.1(+)-EGFP plasmids were transfected into MCF-7 cells by electroporationunder different conditions. Transfection efficiency was detected by inverted fluorescence microscope through observing the expression of EGFP. human breast cancer cells MCF-7 can achieve higher electroporation efficiency via 2 electric pulses at a voltage 150 V, pulse duration of 5 ms, passage time of 24 h, plasmid concentration of 1 μg/μL.Key words : Electransfection; Human breast cancer MCF-7 cells; Transfection parameter; Transfection efficiency; Condition optimization乳腺癌是世界范围内常见的一种女性癌症。
树突状细胞电穿孔法转染条件的优化
树突状细胞电穿孔法转染条件的优化
鲁世绒
【期刊名称】《生物技术世界》
【年(卷),期】2016(000)004
【摘要】目的将带有EGFP的质粒电转入树突状细胞,探讨不同电转条件对树突状细胞的电转率和存活率影响。
方法分离人外周血单核细胞加入刺激因子将其诱导为成熟DC,设置不同电转参数将质粒转入树突状细胞,荧光显微镜检测转染效率及细胞存活率。
结果电转48小时后,镜下观察在电转条件为300V,20ms时,细胞存活率及表达率最高,结论选择适当的电转参数及细胞浓度,可明显提高转染效率同时降低细胞死亡率。
【总页数】1页(P334-334)
【作者】鲁世绒
【作者单位】广西医科大学，广西南宁530021
【正文语种】中文
【中图分类】R73
【相关文献】
1.电穿孔法转染人树突状细胞条件的优化 [J], 单铁英;苏安英;唐军民
2.电穿孔法高效转染脑胶质瘤细胞U251的条件优化研究 [J], 牛丽丽;王秀娟;张传领;温建勋;姜丽丽;王忆霄;王叶庭;肖瑞
3.电穿孔法转染293T细胞条件的优化 [J], 刘晓娟;赵晓飞;曾贝妮;张萌;马正海
4.电穿孔法转染人乳腺癌细胞MCF-7的条件优化研究 [J], 闫东科; 许凤霞; 吕平;
李冬
5.电穿孔法转染人乳腺癌细胞MCF-7的条件优化研究 [J], 闫东科; 许凤霞; 吕平; 李冬
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人急性淋巴细胞白血病细胞株T细胞电转染条件的优化
人急性淋巴细胞白血病细胞株T细胞电转染条件的优化江雪;杨平;李玥n;赵少志;马用信【期刊名称】《重庆医学》【年(卷),期】2011(40)15【摘要】目的优化人急性淋巴细胞白血病细胞株细胞(Jurkat T细胞)的电转染条件.方法采用电穿孔的方法,将pEGFP-C1导入Jurkat T细胞中,通过改变电转时的电压来检测细胞存活率,调节电压、细胞密度、电转质粒数、电转缓冲液,通过流式细胞仪检测质转染效率.结果电转条件在电压140 V、细胞密度107个/毫升、质粒数30 μg、电转缓冲液为优化培养基时,电转染效率可达(79.2±3.21)%.本研究为外源基因电转染Jurkat T细胞提供了可靠的试验参数依据.结论本实验通过优化Jurkat T细胞电转染条件能够有效地提高Jurkat T细胞的电转染效率.【总页数】3页(P1463-1465)【作者】江雪;杨平;李玥n;赵少志;马用信【作者单位】四川大学华西医院医学遗传室/生物治疗国家重点实验室,成都,610041;四川大学华西医院医学遗传室/生物治疗国家重点实验室,成都,610041;成都医学院,610041;四川大学华西医院医学遗传室/生物治疗国家重点实验室,成都,610041;四川大学华西医院医学遗传室/生物治疗国家重点实验室,成都,610041;四川大学华西医院医学遗传室/生物治疗国家重点实验室,成都,610041【正文语种】中文【相关文献】1.电转液L对绵羊成纤维细胞电转染条件优化 [J], 李炜杰;杨娇;王聪慧;罗健;周平;黄威;姚建龙;何高明;皮文辉2.利用T细胞受体变异β基因谱系分析T细胞急性淋巴细胞白血病病人T细胞克隆性 [J], 李杨秋;陈少华;杨力建;祁明芳3.人永生化表皮细胞HaCaT电转染条件的优化 [J], 徐珊;杜冲;马艳民;谢宏俊;高杨;石琦;王新阳;贺大林;郭鹏4.人肝癌细胞总RNA电转染树突状细胞对T细胞的激活效应 [J], 单铁英;苏安英;唐军民5.融合蛋白基因与抗体基因电转染CHO-S细胞的条件摸索优化 [J], 邓晓芬;杨晓佳;易天红;冯英;柯潇;赖维莉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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电穿孔法转染人树突状细胞条件的优化(作者：___________ 单位： __________ 邮编：___________ )作者：单铁英苏安英唐军民【摘要】目的：通过电穿孔法将带有增强型绿色荧光蛋白基因(enhan ced gree n fluoresce nt protein EGFP )的真核表达载体plRES2-EGFP( IRES2 in ternal ribosome en trysite 2 内部核糖体进入位点2)质粒导入未成熟树突状细胞( Immature Den driticCell,imDC)，探讨不同电穿孔条件对imDC电转染率和存活率的影响。
方法：通过密度梯度离心法分离人外周血单核细胞，采用细胞因子体外培养诱导其成为imDC在大肠杆菌中扩增plRES2-EGFP质粒，选择不同的电压、脉冲时间、细胞浓度、DNA剂量等。
应用电穿孔仪将PIRES2-EGFP质粒导入未成熟树突状细胞，荧光显微镜下和光镜下分别计算绿色荧光阳性细胞数和总细胞数。
0.4%锥虫蓝(trypan blue) 染色，计数电转染后细胞存活率。
结果：当imDC浓度为5X 106/mL 与6卩g DNA质粒混合，设定电转染仪电压为300 V、脉冲时间为500 卩s时,其电转染率到最高，细胞存活率最高，转染后24 h明显表达，48h后表达最强。
结论：在适当的电压、脉冲时间下，选择适当的细胞浓度、DNA剂量，在转染后的一定时间范围内，电穿孔法转染imDC可使目的基因获得较高的转染率，且细胞死亡最少。
电转染提供了外源基因转染imDC的可行技术。
【关键词】电穿孔转染绿色荧光蛋白树突状细胞Abstract Objective:plRES2-EGFP was successfully tran sfactedinto immature dendritic cells by means of electroporation in order to investigate the effect of electransfection efficiency and survival rate of immature dendritic cells in different con diti ons.Methods:M ono cytes obta ined form huma n peripheral blood by density guadient centrifugation are induced into imDCs in the presenee of cytokines in vitro.plRES2-EGFP was amplified inE.coli.imDCs were tran sferred with pIRES2-EGFP by means of electroporati on with differe nt electric voltages,times of impulse,cell concen trati onsand the doses of DNA.Numbers of green fluorescence positive cells and the total cell number were coun ted respectively un der fluoresce nt microscope and visible light microscope.the cells were stained with 0.4% trypan blue,electransfection efficiency and the cell survivalrate were counted.Results:Electransfection efficiency wasin creased to the highest value whe n imDCs with theconcentration of 5X 106 cells/mL were mixed with 60 卩g-total DNA,the electric voltage of electroporation apparatus was set at 300V,and the time of impulse was 500 卩s.There wassig ni fica nt and the highest expressi on of plRES2-EGFP respectively at 24 h and at 48 h after tran sferri ng.C on clusio n:A higher tra nsfecti on efficie ncy of target genes can be obta ined by means of electroporati on with suitable electric conditions.Electric transfection provides atech ni cal possibility to make DNA into imDCs.Key words Electroporati on; Tra nsfect;Gree n fluoresce nt protein;Dendritic cell;Human树突状细胞（dendritic cell,DCs ）作为体内惟一能活化初始T细胞的抗原递呈细胞（antigen presentingcell,APC），是激发机体特异性免疫反应的关键，其在抗肿瘤免疫治疗领域中的作用受到广泛关注，以DCs为基础构建的各种类型的疫苗在多种肿瘤免疫治疗的基础和临床研究中显示了旺盛的生命力和良好的前景[1,2] 。
本研究应用电穿孔仪将plRES2-EGFP质粒导入未成熟树突状细胞，探索外源基因转染imDC的优化条件。
1材料与方法1.1材料与器材PIRES2-EGFP质粒（Clontech 公司）、Wizard 质粒抽提试剂盒（Promega公司）,Hinc H酶（Takara公司）。
健康人新鲜外周血，购自北京市血库。
RPMI-1640培养液，美国GIB公司产品。
淋巴细胞分离液（Ficoll ，1.077 g/mL ），上海试剂二厂产品。
胎牛血清（FCS，新生牛血清（NCS）,美国HYClone公司产品。
重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF和重组人白细胞介素 4 (rhlL-4 ),肿瘤细胞坏死因子a(TNF-a)、购自德国RD公司产品。
电转染仪BTX-830, 购自北京基因公司。
1.2质粒的制备及鉴定将plRES2-EGFf质粒转化感受态TOP1(大肠杆菌，取菌液20卩L接种到5 mL含100卩g/mL卡那霉素的LB培养基中。
在37 C摇床上剧烈震荡培养过夜。
按照Wizard质粒抽提试剂盒说明书用碱裂解法提取、纯化质粒DNA紫外分光光度测OD260nm： OD280nm=1.8,证明质粒纯。
测浓度为0.4卩g/卩L,保存于-20 C备用。
取少量质粒用Hine H 酶切，0.9%琼脂糖电泳鉴定酶切结果，验证该质粒是否确为pIRES2-EGFP1.3 imDC的获取取正常人新鲜外周血200 mL,以淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMN)在37 C和5%CO饱和湿度条件下培养2 h，取贴壁细胞即单核细胞(pDC，并测其纯度，调整细胞浓度为2X 106/mL加入RPMI-1640液、10呱台牛血清(FCS和细胞因子rhGM-CSF(1 000 U/mL); (rhIL-4)500 U/mL 于37 C和5%CO饱和湿度条件下培养。
第7 d收获的细胞为imDC用免疫细胞化学的方法显示细胞表面共刺激分子CD80 CD86及HLA-DR计数阳性细胞。
1.4电穿孔法转染树突状细胞1.4.1不同电压条件下转染imDC根据北京基因公司提供参数及操作程序将PIRES2-EGFP质粒转入imDC选择脉冲时间下400卩s，细胞浓度i x 106/mL、DNA剂量2卩g不变，电压分别为200 V、300 V、400 V条件下进行瞬间和稳定电转染。
电穿孔缓冲液为RPMI-1640培养液；电转杯体积0.8 mL，将0.4 mL细胞悬液与plRES2-EGFp质粒混合均匀进行电转染，电穿孔后30 min加入含20%胎牛血清的RPMI-1640培养液，置37 C、5%CO培养箱中培养，同时以未转染的imDC为空白对照。
1.4.2 不同脉冲时间下转染imDC选择电压为300 V，细胞浓度1X 106/mL、DNA剂量2卩g不变，脉冲时间400卩s、500卩s、600卩s条件下进行瞬间和稳定电转染。
其余操作同前。
1.4.3 不同DNA剂量下转染imDC选择电压为300 V，细胞浓度1 X 106/mL、脉冲时间500卩s不变，DNA剂量分别为4卩g、6 g、8 [1 g 条件下进行瞬间和稳定电转染。
其余操作同前。
1.4.4 不同imDC浓度下进行转染：选择电压为300 V、DNA剂量为6 i g、脉冲时间500 i s不变，细胞浓度分别为1X 106/mL、5X106/mL、8X 106/mL条件下进行瞬间和稳定电转染。
其余操作同前。
1.4.5 电转染率观察及存活率观察：电转染后，细胞涂片在荧光显微镜的可见光下固定1个视野，计数细胞总数，然后转换荧光光源，计数发出绿色荧光的细胞，计算电转染率。
电转染率=(发出绿色荧光的细胞数/可见光下总细胞数)X 100 于电穿孔后，0.4%锥虫蓝(trypan blue)染色，计数电转染后细胞存活率。
2 结果2.1 pDC纯度及imDC阳性率：pDC的纯度为90% imDC的阳性率为80%2.2免疫荧光显微镜下显示电转染后imDC细胞内GFF荧光（见图1）。
2.3用荧光显微镜观察不同的电压plRES2-EGFf质粒在imDC中的表达率及细胞存活率，见表1。
随着电压的升高，表达率增强，以300 V 时最强，超过300 V后表达率有所下降。
细胞存活率在48 h时超过70%点随着电压的升高和时间的延长，imDC死亡率升高。
表1不同电压时不同时间plRES2-EGFf质粒在imDC的表达率2.4用荧光显微镜观察不同的脉冲时间plRES2-EGFP质粒在imDC中的表达率，见表2。
随着脉冲时间的延长，表达率增强，以500 11 s 时最强，超过500 i s后表达率有所下降。
细胞存活率在48 h时超过70%点随着电压的升高和时间的延长，imDC死亡率升高。
表2不同的脉冲时间时不同时间plRES2-EGFf质粒在imDC的表达率2.5用荧光显微镜观察不同的DNA剂量plRES2-EGFP质粒在imDC中的表达率，见表3。