实验1 蔗糖密度梯度离心法提取叶绿体

实验1 蔗糖密度梯度离心法提取叶绿体

实验原理2、1 概述密度梯度区带离心法（简称区带离心法）：是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。此法的优点是：①分离效果好，可一次获得较纯颗粒；②适应范围广，能像差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；③颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。

此法的缺点是：①离心时间较长；②需要制备惰性梯度介质溶液；③操作严格，不易掌握。

密度梯度区带离心法又可分为两种：

（1）差速区带离心法：当不同的颗粒间存在沉降速度差时（不需要像差速沉降离心法所要求的那样大的沉降系数差）。在一定的离心力作用下，颗粒各自以一定的速度沉降，在密度梯度介质的不同区域上形成区带的方法称为差速区带离心法。此法仅用于分离有一定沉降系数差的颗粒（20% 的沉降系数差或更少）或分子量相差3倍的蛋白质，与颗粒的密度无关，大小相同，密度不同的颗粒（如线粒体，溶酶体等）不能用此法分离。

离心管先装好密度梯度介质溶液，样品液加在梯度介质的液面上，离心时，由于离心力的作用，颗粒离开原样品层，按不同

沉降速度向管底沉降，离心一定时间后，沉降的颗粒逐渐分开，最后形成一系列界面清楚的不连续区带，沉降系数越大，往下沉降越快，所呈现的区带也越低，离心必须在沉降最快的大颗粒到达管底前结束，样品颗粒的密度要大于梯度介质的密度。梯度介质通常用蔗糖溶液，其最大密度和浓度可达1、28 kg/cm3和60％。

此离心法的关键是选择合适的离心转速和时间（2）等密度区带离心法：离心管中预先放置好梯度介质，样品加在梯度液面上，或样品预先与梯度介质溶液混合后装入离心管，通过离心从而形成梯度，这就是预形成梯度和离心形成梯度的等密度区带离心产生梯度的二种方式。

离心时，样品的不同颗粒向上浮起，一直移动到与它们的密度相等的等密度点的特定梯度位置上，形成几条不同的区带，这就是等密度离心法。体系到达平衡状态后，再延长离心时间和提高转速已无意义，处于等密度点上的样品颗粒的区带形状和位置均不再受离心时间所影响，提高转速可以缩短达到平衡的时间，离心所需时间以最小颗粒到达等密度点（即平衡点）的时间为基准，有时长达数日。

等密度离心法的分离效率取决于样品颗粒的浮力密度差，密度差越大，分离效果越好，与颗粒大小和形状无关，但大小和形状决定着达到平衡的速度、时间和区带宽度。

等密度区带离心法所用的梯度介质通常为氯化绝（CSCl），其密度可达1、7g/cm3。此法可分离核酸、亚细胞器等，也可以分离复合蛋白质，但简单蛋白质不适用。2、2 梯度溶液的制备（1）梯度材料的选择原则。作为一种理想的梯度材料应具备以下几点：①与被分离的生物材料不发生反应即完全惰性，且易与所分离的生物粒子分开。②可达到要求的密度范围，且在所要求的密度范围内，粘度低，渗透压低，离子强度和pH变化较小。③不会对离心设备发生腐蚀作用。④容易纯化，价格便宜或容易回收。⑤浓度便于测定，如具有折光率。⑥对于超速离心分析工作来说，它的物理性质、热力学性质应该是已知的。这些条件是理想条件，完全符合每种性能的梯度材料几乎是没有的。下面介绍几种基本上符合上述原则的梯度材料：①糖类：蔗糖、甘油、聚蔗糖（Ficoll）、右旋糖酐、糖原。②无机盐类：CsCl（氯化铯）、RbCl（氯化铷）、NaCl、KBr等。③有机碘化物：三碘苯甲酰葡萄糖胺（matrizamide）等。④硅溶胶：如Percoll。⑤蛋白质：如牛血清白蛋白。⑥重水。⑦非水溶性有机物：如氟代碳等。

（2）梯度材料的应用范围

⑴ 蔗糖：水溶性大，性质稳定，渗透压较高，其最高密度可达1、33g/ml，且由于价格低容易制备，是现在实验室里常用于细胞器、病毒、RNA分离的梯度材料，但由于有较大的渗透压，不宜用于细胞的分离。

⑵ 聚蔗糖：商品名Ficoll，常采用Ficoll-400也就是相对分子重量为，Ficoll渗透压低，但它的粘度却特别高，为此常与泛影葡胺混合使用以降低粘度。主要用于分离各种细胞包括血细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞等。

⑶ 氯化铯：是一种离子性介质、水溶性大，最高密度可达

1、91g/ml。由于它是重金属盐类，在离心时形成的梯度有较好的分辨率，被广泛地用于DN

A、质粒、病毒和脂蛋白的分离，但价格较贵。

⑷ 卤化盐类：KBr和NaCl可用于脂蛋白分离，KI和NaI可用于RNA分离，其分辨率高于铯盐。NaCl梯度也可用于分离脂蛋白，NaI梯度可分离天然或变性的DNA。

⑸Percoll：是商品名，它是一种SiO2胶体外面包了一层聚乙烯吡咯酮（PVP），渗透压低，它对生物材料的影响小，而且颗粒稳定，在冷却和冻融情况下还是稳定的，其粘度高，且在酸性pH和高离子强度下不稳定。它可用于细胞、细胞器和病毒的分离。2、3 密度梯度区带离心法图解图2-23 A速度沉降，B等密度沉降2、4 收集区带的方法（1）用注射器和滴管由离心管上部吸出。（2）有针刺穿离心管底部滴出。（3）用针刺穿离心管区带部份的管壁，把样品区带抽出。（4）用一根细管插入离心管底，泵入超过梯度介质最大密度的取代液，将样品和梯度介质压出，用自动部分收集器收集。三

实验材料新鲜菠菜叶。四

实验器材组织捣碎器，高速冷冻离心机，普通离心机，离心管，Corex离心管，烧杯，漏斗，纱布，载玻片，盖玻片。普通光学显微镜，剪刀，滴管，荧光显微镜。五

实验药品5、1 匀浆介质（0、25mol/L蔗糖、0、05mol/L Tris-Hcl缓冲液，pH7、4）配制方法：

称取

85、55g 蔗糖，6、05g Tris，溶解在近400ml蒸馏水中，加入约4、25ml 0、1mol/L的Hcl溶液，最后用蒸馏水定容至

500ml。5、260% 蔗糖溶液，50％蔗糖溶液，40% 蔗糖溶液，20%蔗糖溶液，15％蔗糖溶液配制方法：配制80% 的蔗糖溶液，然后按照下表进行稀释，分别配制成50%，40%，20%，15% 的蔗糖溶液。六实验步骤6、1 洗净菠菜叶，尽可能使它干燥，去除叶柄、主脉后，称取50g，剪碎。6、2 加入预冷到近0℃的匀浆介质100ml，在组织捣碎机上选高速档捣碎2min。6、3 捣碎液用双层纱布过滤到烧杯中。6、4 滤液移入普通玻璃离心管，在普通离心机上500r/min离心5min，轻轻吸取上清液。6、5 在Polyallomer离心管内依次加入50％蔗糖溶液和15％蔗糖溶液(或依次加入60%，40%，20%，15% 的蔗糖溶液)，注意要用滴管吸取15％蔗糖溶液沿离心管壁缓缓注入，不能搅动50％蔗糖液面，一般两种溶液各加12ml （如果是四个梯度则每个梯度加

6ml）。加液完成后，可见两种溶液界面处折光率稍不同，形成分层界面，这样密度梯度便制好了、6、6 在制好的密度梯度上小心