改良的苯酚_硫酸法测定多糖和寡糖含量的研究

高温迅速水解, 产生单糖, 单糖在这种强酸条件 二 糖 ( cellobiose ) 、乳 糖 ( lact ose, 4-O-B-D-
下与苯酚反应生成橙色衍生物。该衍生物在波 galact opyranosyl-D-gl ucopyrannose) 和蜜二糖
长 490 nm 处和一定浓度 范围内, 吸收值与糖 ( melibiose, 6-O-A-galact opyranosyl-D-gl u-
糖 6～36 Lg) 置于 10 ml 试管中, 加入 50 g/ L 苯酚溶液 0. 4 ml 混合后, 迅速加入 2 ml 浓硫 酸, 混合均匀后, 室温放置 30 min, 在波长 490 nm 测定吸光度, 空白对照以蒸馏水代替糖溶
样品
称量重量 测定量(Lg)
( A, Lg)
(B)
麦芽糖
酸的含量, 用对照品加入量计算回收率, 平均回 收率 99. 7% , RSD 为 1. 8% 。 2. 2. 4 精 密度 实 验: 取不 同 浓 度 8, 12, 18 mg/ 10 ml 的标准溶液, 各进样 10 次, 测得日内 RS D。取不同浓度 8, 12, 18 mg/ 10 ml 的标准溶 液, 样品每天测定 1 次, 进样 10 Ll, 连续 5 d, 求 得日间 RS D。结果见表 1。
寡 糖 和多 糖 含 量的 测 定 至今 大 多采 用
Dubois 等提出的苯酚-硫酸比色法[ 1, 2] 。该方法 的原理是[ 3] : 多糖或寡粉被浓硫酸水合产生的
( + ) -葡萄 糖, D ( + ) -甘露 糖为 F luka 产品; L ( - ) -阿拉伯糖, L( - ) -木糖, D ( + ) -半乳糖和 L ( - ) -鼠李糖均为 Merck 产品; 麦芽糖, 纤维
4 周海钧, 申蕴如主编. 生物检定统计方法. 第 2 版. 北京: 人 民卫生出版社, 1983∶9.
( 收稿: 1995- 08- 02)
改良的苯酚-硫酸法测定多糖和寡糖含量的研究
董群 郑丽伊 方积年( 上海 200031 中国科学院上海药物研究所)
摘要 目的: 建立以葡萄糖为参比测定多糖或寡糖含量的方法。方法: 对苯酚-硫酸法的 测定条件进行了改进, 测定
= 2. 81%
符合可信限率< 10% , 即认为该方法重复
性好。因此, 该方法精密度高, 重现性好, 是定量
测定甘草制剂中甘草酸的好方法。
3. 4 从样品测定结果来看( 表 2) , 不同甘草复
方制剂的不同剂型中甘草酸的含量完全不同,
生产厂应在产品质量上进行定量控制。本文所
建立的一套完整的定量测定方法, 为有关制剂
的标准曲线, 并由此计算杂多糖和寡糖的含量。 1. 2 方法: 标准溶液的配制: 精确称取已经干
1 材料和方法
燥的各种单糖各 20 mg, 分别溶于 100 ml 重蒸
1. 1 材料: 苯酚( 分析纯) , 重蒸后配成 50 g/ L 水溶液; 浓硫酸( 分析纯, d = 1. 84 g/ cm- 3) ; D
浓度呈线性关系, 从而可用比色法测定其含量。 copyranose) 为 Sigma 产品。可溶性淀粉( 中国
对于匀多糖, 可直接以其组成糖作标准曲 线[ 4] 。但对于由不同糖残基构成的杂多糖, 情况
医药公司) , 经 Sephadex G-200 凝胶过滤柱层 析进一步纯化。香菇多糖( lent inan) 、酵母甘露
计算如下:
sx- =
s = 1. 97= 0. 881
n
5
查 t 值表: f = 3, t( 3) 0. 05 = 3. 18 可信限为= x- ±t ·sx- = 99. 7±3. 18×0. 881
= 99. 7±2. 802
可信限率t·x- sx- ×100% = 29.98.072×100%
Modif ied phenol -sulfuric acid met hod for determination of the content of oligo- and polysacchar id es
Dong Qun ( Dong Q ) , Zheng Liyi( Zheng LY ) , Fang Jinian ( F ang JN ) ( S ha ngha i I nstitute of Ma ter ia
RSD (% )
0. 8 0. 6 1. 3 1. 2 1. 1 0. 9 0. 7
3 结果与讨论 3. 1 甘草制剂是一种多组分的复合制剂, 在本 文实验条件下, 其它组分不干扰甘草酸的分离 与测定。 3. 2 甘草酸有效成分的提取是利用甘草酸的 溶解性, 即甘草酸易溶解于热醇、热水溶液, 加 之利用超声波而提取。处理方法简单, 测定迅
Medica , Aca demia Sinica, S hang ha i 200031)
ABSTRACT OBJ ECTIVE: T o esta blish a method for det er minat ion of t he content of oligo and polysacchar ides, using only glucose as the st andar d. M ETHOD: The absorbance corr ection coefficent s of several monosaccharides were deter mined with the m odified phenol-sulfuric acid method and then used in the calculation of the content of sacchar ides. RESULTS: T he modified method wa s used for deter mination of the sacchar ide content of four oligosacchar ide and four polysacchride samples, and was shown to be excellent in accur acy and r epr oducibility, with relative err or less t han 4% . T he linear r ange of sacchar ide content was 0～ 30 Lg. CONCLUSI ON: The corr ection coefficients deter mined with the modified phenol-sulfuric acid can be successfully used for deter mination of t he content of oligo-and polysaccharides with only glucose as the standard. KEY WORDS polysa cchar ide, oligosaccharide, quantita tive deter mination, modified phenol-sulf ur ic acid method
Dubois 法, 采用高浓度的苯酚 800 g/ L 易产生 及元素分析鉴定为均一多糖组成。
较大的误差而影响结果的准确性。本文报道的
吸光度用 721 型分光光度计测定, 使用光
苯酚-硫酸法改良后的条件, 使测定过程更方便 径 10 mm 石英比色皿。用 Opt ifix 定量加液器
可行, 结果更可靠, 此外还测定了各种常见单糖 吸加 50 g/ L 苯酚及浓硫酸。
均聚糖和异聚糖) 的含量用改进的方法进行了测定, 该方法的相对误差小于 4% , 具有良好的重复性, 线性范围含糖 量 0～30 Lg。结论: 利用在改进的测定条件下测得的各种单糖的校正系数, 可以以葡萄糖为标准品对组成己知的寡 糖或多糖的含量进行测定。 关键词 多糖; 寡糖; 定量测定; 改进的硫酸-苯酚法
水中。 标准液分别稀释成浓度为 30, 60, 90, 120,
中国药学杂志 1996 年 9 月第 31 卷第 9 期 Chi n P harm J , 1996 Sep t ember , Vol. 31 N o. 9 ·551·
150, 190 Lg/ ml 的溶液, 取该溶液各 0. 2 ml ( 含 表 2 寡糖及多糖 含量测定的结果
表 2 甘草制剂中甘草酸含量测定结果(n= 5)
样品名称
牛黄解毒片 牛黄解毒丸 强力银翘解毒片 银翘解毒丸 霍香正气丸 参芩白术散 川穹茶调散
样品批号
无 93 01 11
无 93 01 18 93 12 14 94 10 15
无
含量(mg/ 片)
1. 03 1. 00 1. 35 1. 42 1. 62 1. 90 1. 40
中甘草酸的含量控制提供了基础。
参考文献
1 朱维华, 俞如英. 太阳神 口服液中甘草酸的 HPLC 测定. 药 物分析杂志, 1994, 14( 4) ∶47.
2 曾 路, 楼 之岑, 张如 意. 国产 甘草 的质 量评价. 药学 学报, 1991, 26( 10) ∶788.
3 陈发奎, 郭允珍, 孟宪纡. 牛黄解毒片的三维 HPLC 法鉴定 和指标成分的定量. 药学学报, 1993, 28( 1) ∶57.
了几种单糖对葡萄糖的吸光度校正系数 k′i, 并用它们计算寡糖或多糖的 含量。结 果: 对 4 种寡糖和 4 种多糖 ( 包括
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Chin P harm J , 1996 Sep tember , Vol . 31 No. 9 中国药学杂志 1996 年 9 月第 31 卷第 9 期
速, 用于甘草酸的定量研究更为准确, 有较高准
确度及精密度, 能准确地反映制剂中甘草酸的
含量, 可用于质量控制。 3. 3 实验结果表明: x- 为 99. 7% , s 为1. 97% ,
RSD 为 1. 8% , 实验精密度 高, 符合统计 学原
理。
同时, 根据药品质量及生物测定的要求, 在
概率( P = 0. 95) [ 4] 下, 可信度及可 信限率分别
表 1 日内、日间 R SD 测定结果( % )
浓度(mg/ 10 ml)
日内(n= 10)
日间( n= 5)
8 12 18
1. 5
2. 2
1. 8
2. 4
1. 2
Fra Baidu bibliotek
3. 0
精密度实验表明, 日内、日间实验 RSD 都 较小, 重复性好。 2. 2. 5 测定结果: 精密称取供试品( 约 1 日量, 即 1 份) , 操作方法同供试品溶液的制备方法, 精密进样 10 Ll, 按回归方程计算出其中甘草酸 的含量, 结果见表 2。
20. 5 20. 5
21. 3 21. 2
纤维二糖
20. 1 20. 1
20. 0 19. 8
测定误差 平均相对误差 (B- A) ( ûB- Aû/ A, % )
0. 8 0. 7
3. 9
- 0. 1 - 0. 3
1. 0
液。 多糖及寡糖样品在同样条件下测定, 糖含
量控制在 6～30 Lg 之间( 本文中糖含量均指所 加的 0. 2 ml 标准液或样液中含糖的微克数) 。 2 结果与讨论 2. 1 各种单糖的标准曲线在糖含量 0～30 Lg 范围内, 吸光度和糖含量呈良好的线性关系。对 应的线性方程分别为: Glc: Y= 1. 10×10- 2X; Man: Y= 1. 38× 10- 2 X ; Gal: Y= 0. 83× 10- 2 X; Xyl : Y= 1. 05×10- 2X ; Ara: Y= 1. 01×10- 2 X; R ha: Y= 0. 90×10- 2 X。
则较为复杂, 因为不同单糖的标准曲线的斜率 聚糖( mannan) 和荚竹桃多 糖 NIA-1( 组成 为:
不同, 所以应采用与杂多糖组成相同的混合单 L -Ar a ∶ D -Gal ∶ D-Glc = 13 ∶ 9 ∶ 70,
糖 制 作 标 准 曲 线。另 外, 目 前 通 常 使 用 的 mol/ mol) 均为本实验室制备, 经高效液相色谱