植物源性重组人血清转铁蛋白的多功能性介绍
植物源性重组人血清转铁蛋白的多功能性
概述
人血清转铁蛋白（htf）是人血清中主要的结合铁蛋白质，在铁转运中有重要作用。另外，htf还有许多其他的作用，包括抗菌功能和对哺乳动物细胞增殖、分化中的生长因子效用。其多功能性使其在不同疗法和商业应用中有巨大价值。然而，htf的这些成功应用很大程度上取决于大量的高质量的htf的应用。本研究中，我们将植物作为获得重组htf的一种新平台。我们的研究表明转基因植物是一种获得rhtf的有效系统，最大积累量达到了全部可溶蛋白的0.25%（或高达33.5ug/g的叶子鲜重）。此外，植物源性rhtf保持了许多与天然htf相同的生物活性。尤其是rhtf在体外可逆性的结合铁作用，表明了其抑菌活性、在无血清培养基中的支持细胞增值的作用，和在体外内化进入哺乳动物细胞的性质。本研究的成功使得未来多领域应用植物源性rhtf成为可能。植物源性rhtf突出的应用就是作为特定细胞的一种新的载体或者作为蛋白质/肽段药物的口服递送以治疗人类疾病例如糖尿病。为证明此假说，我们在植物中又额外地表达了一种包含胰高血糖素样肽段-1（GLP-1）或其衍生物的htf融合蛋白。在此，我们展示植物源性htf-GLP-1融合蛋白保持了体外培养基中内化进入哺乳动物细胞的能力。
简介
转铁蛋白Tf包含了所有脊椎动物体内发现的一系列同源性的铁结合蛋白糖蛋白（Aisen and Harris, 1989），主要功能是铁的螯合和转运。Tf是一种单分子蛋白，分子量范围为76-81 kDa，取决于糖基化程度。每种TF蛋白包含两种相似的裂片，分别叫做N-末端和C-末端，每一裂片包含单一的铁结合位点（Aisen and Harris, 1989; Baker et al., 2002）。hTf是转铁蛋白Tf家族的主要成员。hTf蛋白由679个氨基酸组成，主要在肝脏合成并分泌入血（MacGillivray et al., 1983）。hTf的主要功能是络合血中的游离铁并将之转运到全身各处（MacGillivray et al., 1983）。放射示踪研究显示至少80%的络合至tHf的铁转运至骨髓并组成新生的红细胞（Finch and Huebers, 1982）。除其众所周知的铁转运功能外，hTf还有许多额外的功能，许多与其携铁能力无关。例如，研究显示HTF可促进体外无血清培养基条件下鼠粒性白细胞和巨噬细胞前体细胞的克隆生长（Iizuka and Murphy, 1986）。另外，HTF的存在对于大多数哺乳动物细胞的培养有重要作用，例如体外受精培养（Holst et al., 1990）和肝细胞群体的维护和扩展（Suzuki et al., 2006）。当增殖细胞高表达HTF受体以允许HTF包裹并可能引发和维持细胞DNA合成时，HTF常常作为一种生长因子（Gomme et al., 2005）。HTF的其他作用包括抵抗细菌、酵母菌、病毒和真菌的抗菌活性（(Artis et al., 1983; Salamah and al-Obaidi, 1995），降低细胞粘附的能力（Ardehali et al.,2002）。HTF的多功能性可以作为潜在的治疗和非治疗应用。例如，HTf已被用来治疗人类转铁蛋白缺乏症（一种以贫血、铁超载、生长迟缓和感染发生率增加为特点的状况）（Hayashi et al., 1993），局部贫血-再灌注损伤（促进氧化应激导致炎症、最终因凋亡和坏死而导致细胞死亡的一种情况）（Hayashi et al., 1993）和心血管疾病（Hayashi et al., 1993）。HTF的治疗送递也降低了放射疗法的副作用（Koterov et al., 2003），有助于为骨髓移植患者提供抗微生物活性的作用（von Bonsdorff et al., 2003）。此外，HTF已用来作为一种新的载体系统，在体内运载药物入癌细胞（Laske et al., 1997）。近来，HTF被证实作为一种高效的载体，以送服口服蛋白质和氨基酸药物入内脏以实现全身治疗效果（Widera et al.,2004; Bai et al., 2005）。HTF蛋白也有许多巨大的潜在非治疗应用。例如，许多无血清培养基以HTF作为血清代用品，支持哺乳动物细胞生长（Barnes and Sato, 1980a,b）。为了使HTF的这些商业和治疗应用具备可行性和得到实现，大量HTF的可靠、廉价的供应是很重要的，取决于一种高效、性价比合算的重组生产系统。
迄今为止，已有数种表达系统报道获得重组HTF。描述的RHTF的细菌表达，仅允许生产蛋白质的氨基末端和羧基末端领域（半分子）（Ikeda et al., 1992; Steinlein and Ikeda, 1993;
de Smit et al., 1995），随着19HTF分子内二硫键的出现，使得利用微生物主机获得这种蛋白成为了一项挑战。使用细菌获得重组ＨＴＦ的进一步限制，是其从重组蛋白到获得功能性产品过程中无法去除信号肽（MacGillivray et al., 1998）。作为一个可选择的细菌生产系统，已证实rhTf在幼仓鼠肾（ＢＨＫ）细胞的表达（Funk et al., 1990; Mason et al., 1991, 1993, 2001）。虽然成功了，但幼仓鼠肾细胞系统受限于低产量的rhTf （no more than 40 mg?L of cell culture）。为了降低生产难度，已研究了数个表达系统，包括酵母菌（仅在ＨＴＦ的Ｎ－末端领域和两个ＨＴｆ突变类型表达）（Steinlein et al., 1995;Sargent et al., 2006）、使用杆状病毒表达系统的昆虫细胞（> 20毫克?L的细胞培养）（Ali et al.,1996）和果蝇Ｓ２细胞（不超过0.35毫克?L的细胞培养）（Lim et al., 2004）。因为这些系统都是依靠昂贵的细胞培养和发酵方法，他们不适合低成本的规模化生产。此外，哺乳动物的细胞培养很容易受到细菌和病毒病原的污染，导致产品安全的担忧。
植物生物反应器已被证实作为一种有效的、有吸引力的重组哺乳动物蛋白的生产平台（Schillberg et al., 2005;
Daniell, 2006;Boehm, 2007）。作为生物反应器，植物允许无限的可扩展性，通过哺乳动物病原体消除产品污染，以及与微生物或动物相比，使用细胞培养系统降低了生产成本（Daniell,2006; Boehm, 2007; Ma et al.,
2008）。因为他们的真核特性，植物可以进行复杂的转译后修改和加工，这是许多转基因哺乳动物具有治疗作用的蛋白质的生物学和?或免疫学功能所要求的。此外，可食用的转基因植物组织提供了允许植物源性治疗蛋白质和多肽直接口服递送的可能性，消除了昂贵的下游蛋白纯化和加工。
在本研究中,我们已经证实了利用转基因植物作为生产rhTf新体系的可行性。因为天然hTf是一种分泌分
子，rhTf是针对转基因植物内膜系统以提高积累的。在此，我们证明了转基因烟草植物是一个有效的生产rhTf
表达系统，最大限度积累可达0.25%的全部可溶性蛋白质（ＴＳＰ）（或者高达33.5ｕｇ／ｇ鲜叶组织）。转
基因蛋白质的生化和功能特性表明了植物源性ＲＨＴＦ是非糖基化的，正如酶和化学去糖基化分析证实的，保
留的多项与天然hTf性能相同的性能。尤其是，植物源性rhTf在体外可逆性地络合铁，证实了抑菌活性，在无
血清培养中支持细胞生长和增殖，并保留了在体外内化进入哺乳动物细胞的能力。这些结果表明，植物源性
rhTf可能存在许多潜在应用价值。最重要的功能是，使用rhTf作为特定细胞或口服递送的蛋白质和多肽药物的新载体分子。为了验证这个假说，我们在转基因植物中额外引入了一个rhTf融合蛋白，包含抗胰高血糖素样肽1 (GLP-1)或其衍生物。已证明，当加入到体外细胞培养基，植物源性rhTf-GLP-1融合蛋白有内化进入哺乳动物细胞的能力。该研究结果具有重要的影响，其中包括开发植物源性rhTf作为一种新的靶向给药系统的可能性，以及未来开发出基于新的植物源性rhTf治疗广谱疾病方法的可能性。
结果
转基因植物的植物表达载体的构建和产生
二进制植物表达载体ｐＲＪＣ－ｈＴｆ的产生，强本构CaMV 35S促进剂促进了hTf的表达天然信号肽
如图1表明。来源于烟草蚀刻病毒（ＴＥＡ）ＲＮＡ的５＇端输出序列和３＇内质网（ＥＲ）保留信号主题Ｋ
ＤＥＬ整合入ｐＲＪＣ－ｈＴｆ以最大限度ｒｈＴｆ积累（(Ma et al., 2005; Wang et al., 2008）。即时插入上游
信号KDEL的6xHis标签整合到ｐＲＪＣ－ｈＴｆ上，以通过固定化金属亲和层析促进下游ｒｈＴｆ的纯化
（ＩＭＡＣ）。
低生物碱烟草变种８１Ｖ９（Menassa et al., 2001）是利用含有pRJC-hTF的根癌农杆菌转变的。所产生的20多
个独立的转基因烟草株，与所有转基因植物，表现出了正常的生长和发育，与非转变烟草cv. 81V9相比没有表
型方差。hTf整合入核基因组，且其在转录水平的表达，分别经聚合酶链反应（ＰＣＲ）和逆转录聚合酶链反
应（ＲＴ－ＰＣＲ）而得到证实（数据未显示）。
转基因植物的rhTf蛋白质积累
rhTf在转基因植物的积累，通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及其后的使用市面可得的抗hTf抗体的免疫蛋白印迹得到印证。总蛋白萃取物时从植物获得的，通过ＲＴ－ＰＣＲ获得rhTf阳性表达。如图２ａ，抗ｈＴｆ抗体检测到一个明显的分子质量76ｋＤａ的单一蛋白，与ｈＴｆ标准等同尺寸（Sigma-Aldrich）。不出所料，在相同的条件下的野生植物叶子提取物中没有检测到蛋白质带。烟叶提取物中rhTf的相对积累量的测定，采用间接的抗hTf 抗体ELISA法与一个hTf标准比较。rhTf的积累水平，发现在独立主要转基因植物(T0plants)，范围从0.07%到0.25%ＴＳＰ（或6至33.5ｇ／ｇ鲜叶重）。此外，转基因烟草植物的rhTf有明显的空间分布的差异，最上面的叶子表现出最高水平转基因蛋白质积累（数据未显示）。
植物源性ｒｈＴｆ是非糖基化的
为了研究植物源性rhTf的醣化作用，重组蛋白进行了酶、化学去糖基化。对酶的去糖基化，总蛋白提取物以及通过His-purification得到的植物源性rhTf的部分纯化样品，用PNGase F处理并通过使用抗hTf抗体的免疫印迹法分析。在PNGase F处理之前，纯化rhTf的完整性，通过Coomassie bule stainong考马斯亮蓝染色在SDS - PAGE 上确认。hTf蛋白包含两个可能的糖基化位点羧基末端区域（Asn413 and Asn611）（Spik et al., 1975）。用PNGase F对糖基化hTf标准（Sigma-Aldrich）的消化作为阳性对照。PNGase F能够去除高甘露醇和复杂类型N-聚糖，除了含有a-(1,3)-linked的核心海藻糖，一般在植物糖蛋白中发现（Lerouge et al.,1998）。如图3示：与未经处理的对照样品相比，在经PNGase F处理的总蛋白提取物或部分净化的rhTf样品中没有看到可察觉到的漂移带。相反，在相同条件下，商业糖化hTf标准和PNGaseF的消化，降低了其分子量至大约73kDa的单带，这正是期待的hTf的非糖基化成分。与酶去糖基化得到的结果一致，使用三氟甲磺酸His-purified的植物源性rhTF的化学去糖基化，这非特定地移除所有伴随蛋白质的碳水化合物，导致rhTf的移动性没有变化（图3b）。加在一起，这些结果表明植物源性rhTf是非糖基化的。非糖基化的植物源性rhTf分子量比去糖基化hTf标准的分子量稍大（图3a）。最可能的原因是增加了6xHis标签（900 Da）和增加到植物源性rhTf的C末端的内质网ER保留的信号主题KDEL（600 Da）。此外，以前的观察表明酶裂解了两个碳水化合物链的天然hTf的分子量，如SDS-PAGE 证明的那样，小于计算出的hTf的理论分子量（Riebe and Thorn, 1991）。然而，植物源性rhTf分子量的提高不可能是因为植物源性rhTf的信号肽序列的不完全处理。我们先前已证实动物蛋白的天然信号肽在植物细胞内是正确加工处理的（Ma et al., 2005; Wang et al., 2008），这也进一步被其他人证实（Menassa et al., 2001; Bortesi et al., 2009）。
植物源性rhTf保持其体外可逆地结合铁的能力
因为hTf的主要功能包括裹铁和随后的运输，植物源性rhTf以体外隔离铁的能力为特征。His-purified的植物源性rhTf样本经过体外处理以获得蛋白的或者分离形式apo form（游离铁）或者整体形式holo form（结合铁）（具体细节见试验程序）。然而，分离的hTf和整体的hTf都具有生物活性，每一种都在465-280nm存在典型的吸光率，而整体的hTf有0.045-0.054的A465/A280率（Huebers et al.,1981）。因此，A465/A280率处理可以用来评估植物源性rhTf的铁饱和度的程度。有铁存在时，His-purified的植物源性rhTf存在0.052的A465/A280率，与整体的hTf标准相似，但是与卵清蛋白（OV A）相比有显著不同（P<0.05）（表格1）。因此，铁存在时吸光度值下降，PH下降（表格1）。非相关的卵清蛋白显示，在有或没有铁时A465/A280率没有变化。放在一起，这些结果表明植物源性rhTf保持了其体外高亲和力的裹铁能力。
植物源性rhTf抑制细菌生长
植物源性rhTf的生物活性通过其抑制细菌的生长而评估。假单胞菌（ATCC 27853），一种革兰氏阴性菌，广泛用于评估抗菌药物的一种参考菌株（Fass and Barnishan, 1979; Giacomettiet al., 1999）。为了检验其抑菌效果，His-purified的植物源性rhTf（分离形式）或商业的分离式hTf标准加入到接种了铜绿假单胞菌的培养基，在不同潜伏期通过测量600nm（OD600）时的光密度，按时间尺度上检测细菌生长。正如图4示，包含100ug/mL植物源性rhTf（分离型rhTf）或分离型hTf标准的培养基中，与单独培养基或添加来自野生型81V9的植物蛋白的控制培养基相比，不能完全抑制铜绿假单胞菌的生长，但是能够显著地推迟9-19h接种（P<0.05）。在有或没有植物源性分离型rhTf、商业性分离型hTf或控制性TSP时，细菌生长至相同的细胞密度需25h。添加了低浓度（50ug/mL）的植物源性分离型rhTf、商业性分离型hTf也表现出了对铜绿假单胞菌生长的抑制作用，但与控制组相比没有达到统计性差异（数据未显示）。植物源性rhTf对铜绿假单胞菌生长的抑制程度，即使不好，也与使用商业分离型hTf标准观察到的相似（图4）。
植物源性rhTf刺激哺乳动物细胞生长
研究证实转铁蛋白对体外细胞增殖有深远影响（Barnes and Sato, 1980a,b; Ozawa,1989）。此外，hTf是无血清培养基中大多数动物细胞的长期生存必需的（Barnes and Sato, 1980a,b）。为了证明植物源性rhTf在体外是否能刺激哺乳动物细胞增长，His-purified的植物源性rhTf与商业性hTf在刺激希拉HeLa细胞和鼠肾脏肾小管上皮细胞生长方面做了比较。加了浓度20ug/mL的His-purified的植物源性整体型rhTf的无血清SFF12培养基明显地在体外刺激了HeLa细胞的生长（图5）。第4天时，添加了整体型rhTf的培养基中的活细胞总数与初始细胞数目相比增加了15多倍（图5a）。活细胞数目的增加率，与使用了商业性整体型hTf标准的培养基中观察到的相比，即使不好，也是相似的。果如所料，在未添加任何形式hTf的无血清SFF12培养基中活细胞数目，在接种4天后下降。座位正控制组，添加了10%（v/v）胎牛血清FBS的SFF12培养基获得了最高的活细胞计数，在培养第4天
后活细胞数目增加了20多倍。相同浓度下，植物源性分离型rhTf或商业性分离型hTf也引发了显著地希拉细胞生长（在植物性分离型rhTf或分离型hTf标准存在时，培养第4天后，活细胞数目超过或大约增长了10倍），虽然与整体型的相比影响并不显著（图5a）。更低浓度（2ug/mL）的植物源性rhTf，如商业性hTf，在刺激HeLa 细胞生长中仍表现出显著影响效果，整体型比分离型表现出更好的刺激效应（图5b）。
同样研究了植物源性rhTf对鼠肾脏肾小管上皮细胞（细胞株NG1.1）生长的刺激效应。通过测量[3H]胸腺嘧啶提取物来评估发生于NG1.1细胞系中DNA的合成量级，来评估植物源性rhTf的刺激效应。浓度10ug/mL的植物整体型rhTf或商业性整体型hTf显著增加[3H]胸腺嘧啶提取物（P<0.05），虽然最高的[3H]胸腺嘧啶结合率发生在添加了浓度10%（v/v）FBS的K1培养基的正控制组中的细胞生长（图6）。没有转铁蛋白的无血清K1培养基中细胞生长没有或很少[3H]胸腺嘧啶提取物。添加了植物源性分离型rhTf或商业性分离型hTf的细胞培养基，也显著地增加了[3H]胸腺嘧啶提取物，但是与添加整体型的NG1.1细胞系中观察到的相比，[3H]胸腺嘧啶结合率降低了（图6）。低浓度（2ug/mL）的植物源性rhTf或商业性hTf，各自对[3H]胸腺嘧啶细胞提取物出现轻微影响（数据未显示），表明了剂量依赖性反应。
植物源性rhTf保持了其内化进入哺乳动物细胞的能力
内化进入哺乳动物细胞，是hTf的一种重要特性（Ashida et al., 2004）。为了进一步描述植物源性rhTf的生物活性，用希拉细胞系，在体外分析了植物源性rhTf内化进入活体哺乳动物活体细胞的能力。hTf内化进入哺乳动物细胞，涉及两步骤，包含结合hTf至细胞表面特定受体，然后hTf内化入细胞（Hopkins, 1983）。内化的hTf与细胞表面hTf，可以通过细胞裂解之前使用乙酸/生理盐水溶液初步处理细胞而辨别（Haigler et al., 1980; Karin and Mintz, 1981）。为了验证植物源性rhTf是否内化入哺乳动物细胞，His-purified的植物源性rhTf孵育的希拉细胞，经过乙酸/生理盐水溶液处理以去除细胞表面植物源性rhTf。细胞裂解后，内化的植物源性rhTf释放，可通过ELISA定量检测。如图7a示，在离心分离植物源性rhTf刺激的希拉细胞并移除细胞裂片之后，rhTf可以很容易地在上层裂解液中发现。植物rhTf中的细胞浓度与商业hTf刺激的希拉细胞来源的裂解上清液中得到的相似。此外，内化的hTf量与添加入希拉细胞培养基中的hTf量很相关。希拉细胞裂解物中，没有可检测水平的内源性hTf蛋白。与分离型相比，整体型植物源性rhTf或商业性hTf更容易被体外希拉细胞吸收（图7a）。内化的植物源性rhTf的可视性可以通过免疫印迹分析同样的裂解物而确定。图7b表明抗rhTf抗体对预期大小的hTf的蛋白带有特别反应，表明植物源性rhTf在希拉细胞中仍保持相当稳定。
植物源性rhTf可作为治疗药物的载体
我们的一个长期目标是开发植物源性rhTf作为特定靶细胞的新的载体分子或送递口服多肽和蛋白治疗药物。为达到此目的，我们在植物中另外产生了两个融合蛋白——rhTf-GLP-1和rhTf-GLP-1x10——并首先探究是否植物源性rhTf融合蛋白能内化进入哺乳动物细胞中，如体外希拉细胞。GLP-1（7-36）是一种小的抗糖尿病肽激素，由30个氨基酸组成，分子量大约3.3kDa（Holst, 2007），然而，GLP-1x10是一种合成肽段，包含着10个GLP-1序列的重复拷贝单元，分子量大约33kDa（Brandsma et al., 2009）。植物源性rhTf-GLP-1和rhTf-GLP-1x10分子量分别大约为79和110kDa（图2b）。内化的植物源性rhTf融合蛋白通过ELISA定量检测。如图8a示，His-purified的植物源性rhTf-GLP-1或rhTf-GLP-1x10（分离型）孵育的希拉细胞裂解物上清液中包含的融合蛋白，与植物源性分离型rhTf或商业性分离型rhTf控制组孵育的希拉细胞裂解物上清液中包含的融合蛋白相比，水平略微升高或近似，这表明融合蛋白不干扰hTf内化进入细胞的能力。正如所料，单纯无血清F12培养基孵育的希拉细胞裂解物上清液或单纯GLP-1肽段或GLP-1控制组孵育的希拉细胞裂解物上清液包含不可察觉水平的hTf。利用抗hTf抗体对相同裂解物上清液进行免疫蛋白印迹分析证明了预期大小融合蛋白的存在（图8b）。
讨论
人类血清Tf，尽管被认为是一种裹铁蛋白，是一种具有多种生物活性的多功能蛋白（Gomme et al., 2005）。hTf 的多功能性，使其在多种不同的应用中相当有用，尤其是在作为治疗人类转铁蛋白缺乏症、IR损伤、感染转移和心血管疾病的药物，也可作为一种新功能——有效的特种癌细胞药物送递或靶向口腔给药的载体系统（Hayashi et al., 1993; Laske et al., 1997; de Vries et al., 2004; Widera et al., 2004; Bai et al., 2005）。为然而，使这些治疗或应用更适合大规模患者群体，需要有大量高质量rhTf的可负担得起的来源。近来制取rhTf的方法证明是困难和效率地下的。本研究中，转基因植物经测试证明是一种新的生产rhTf系统。为达到此目标，生产出携带本构体CaMV 35S启动子控制下的hTf基因的转基因低生物碱、无尼古丁烟草。利用抗hTf抗体而行的免疫蛋白印迹法证明了rhTf的积累（图2）。直接ELISA显示，rhTf蛋白积累量达到TSP的0.25%（或高达33.5/g鲜叶重）。
相关的植物源性rhTf的高水平积累可能是由于几种有协同作用的因素，包括蛋白质本身稳定特性，使用强力的CaMV 35S启动子外加5'-UTL序列，使用内质网目标信号KDEL使rhTf进入内质网ER腔的目标。人血清Tf是指一种单一多肽链蛋白，包含19个有助于其长期稳定的分子内双硫键（Mazurier et al., 1983）。此外，C末端KDEL的结合有助于内质网定位，促进蛋白质的高水平积累（Ma et al., 2005;Wang et al., 2008）。人血清Tf是在其羧基末端区Asn413和Asn611包含两个潜在N链接糖基化位点的一种糖蛋白，碳水化合物构成了其大约5%的分子量（Spik et al., 1975; MacGillivray et al., 1998）。去糖基化分析的结果显示植物源性rhTf是非糖基化的（图3）。许多因素可以影响重组蛋白占据的糖基化位点，例如多肽和蛋白质结构、主要种类的类型、压力和生长情况（Yet and Wold,1990）。在真核细胞，N链的糖基化常共翻译地出现。因此，可能存在空间竞争和暂时的翻译、糖基化和折叠。因为蛋白质折叠常通过二硫化键形成而完成，形成的双硫键有效窗口影响了特定蛋白N链糖基化的效能。当潜在糖基化位点通过折叠过程而被掩饰，糖基化即被阻止。因为hTf包含多达19种分子内双硫键，双硫键形成的优势性过程可使得植物源性rhTf上形成N链糖基化的时间大大缩短。Allen et al.（1995）证明低浓度的二硫苏糖醇（DTT）还原剂阻止了内质网ER中的二硫键形成，且导致细胞培养中的重组组织型纤溶酶原激活物（t-PA）的完全糖基化，而这常要经过变量醣化作用。Miletich和Broze（1990）证实占据蛋白C 非标准Asn-X-Cys序列的部分糖基化位点可能是通过二硫键形成而导致位点阻塞。然而，不管这是否正确，糖基化在hTf的功能中有重要作用。Mason et al.（1993）比较了幼仓鼠肾细胞源性糖基化rhTf和非糖基化突变型rhTf的受体结合力，得出结论：结合在希拉S3细胞的非糖基化突变型rhTf的结合方式与其他三种有相同活性的hTf对照试样和与程度相同的糖基
化rhTf相同。Sargent et al.（2006）报道，酵母菌来源的rhTf缺乏糖基化，与酵母菌来源的非糖基化rhTf与天然糖基化rhTf相比，在其结合铁的能力和在细菌培养基中作为生长因子的效能上，没有表现出差异。我们的研究表明进一步表明，糖类在hTf的生物活性上没有起到多大作用。
植物源性rhTf的生物活性使用铜绿假单胞菌菌株而评估。植物源性rhTf表现出了剂量依赖性的抑菌效能，与商业性分离型hTf标准类似。存在100ug/mL的His-purified的植物源性rhTf或标准分离型hTf时，铜绿假单胞菌的生长率在接种后9-19h明显下降（图4；P<0.05），虽然经过处理的细胞最后还是达到了与其后的控制组细胞相同的密度。长期抑制细菌生长性能的缺乏，可能反映了培养基中有铁存在时，植物源性分离型rhTf或标准分离型hTf的可能的饱和度。铁是几乎所有微生物生长增殖的一个重要营养元素。通过在培养基中隔绝铁，hTf使微生物得不到铁。缺乏铁将会延缓生长和繁殖，而不是杀死细菌。近来研究发现铁饱和度完全破坏了转铁蛋白和乳铁蛋白的抑制作用，使得许多微生物能再生（Lankford, 1973; Bullen and Armstrong, 1979; Finkelstein et al., 1983）。乳铁蛋白是结合铁蛋白的转铁蛋白家族的一员，有高度相似的序列（61.4%相同），与hTf结构相似，因其更大的结合铁亲和力而表现出比hTf更大的抗菌活性（MacGillivray et al., 1983; Wally and Buchanan, 2007）。
发展和常规使用无血清培养基（SFM），从工业和科学的观点——其传统血清成分使研究复杂化——对哺乳动物细胞而言是高度优先的（Salis et al., 2002）。从工业角度而言，SFM在减少或消除动物源性成分的使用上非常重要的（Castle and Robertson, 1999），因此避免细菌、病毒、支原体污染。因其是确定成分培养基，与含血清培养基相比，有最低限度的批量（bitch-to-bitch）变异，因此提高了目标产物的稳定的质量和可重复性（Chu and Robinson, 2001）。向基础培养基中加入最普通的非血清成分有生长因子，如转铁蛋白、胰岛素（Barnes, 1987; Fitzsimmons et al., 2004）。然而，重组胰岛素普遍用作SFM培养基的添加物，用于SFM的转铁蛋白一般是动物源性的，导致与动物源性成分相关的安全忧虑。此外，缺乏商业可用的hTf，高hTf费用的挑战。近来，DeltaFerrin TM，一种酵母菌源性的不含动物成分的rhTf已由Dwltw Biotechnology Ltd.研发（Nottingham,U.K.），在哺乳动物培养基SFM中用做铁螯合剂。Keenan et al.（2006）证明，通过短期分析和长期的继代培养（MDCK,
BHK-21, PPI-C16 and Vero-PPI）的验证，DeltaFerrin TM与天然整体型hTf在支持数种哺乳动物细胞株生长方面作用等同。虽然结果令人振奋，但是酵母菌源性rhTf可能受生产量和费用的限制。植物可以作为具成本效益的替代物。我们的数据显示植物源性rhTf能够刺激以剂量依赖方式培养在SFM培养基中的HeLa细胞或鼠肾小管上皮细胞的能力，即使不比商业hTf好，也是令人鼓舞人心的等同作用（图5a、b，图6）。这些结果显示，植物源性rhTf有在细胞培养中替代人源性或牛源性转铁蛋白的潜力，取消了动物源性成分的使用。与分离型相比，整体型植物源性rhTf或者商业性rhTf标准有更有效的生长刺激效果，表明细胞生长中铁的重要性和hTf在转运铁进入细胞的作用。这些结果与以前的研究结果是一致的，即：在添加了激素的SFM培养基中作为支持细胞生长
的因素，整体型hTf好于分离型hTf（Kan and Yamane,1984; Alvarez-Hernandez et al., 1998）。添加了FBS的SFM培养基比添加hTf的SFM培养基，在HeLa细胞或鼠肾小管上皮细胞表现出了更好的生长（图5）。这可能是由于血清中仍然存在细胞生长需要的多种不同生长因素的原因（Barnes, 1987）。
转铁蛋白是一种转运铁的蛋白，经由受体介导的内吞作用结合并转运铁进入细胞。这个过程涉及了两个截然不同的步骤，包含hTf结合至细胞表面受体和随后的hTf内化。近期工作中，我们检验了植物源性rhTf内化入哺乳动物细胞——例如人类希拉细胞——的能力，将开发特定转运肽或蛋白质药物入靶细胞或经由口腔途径转运的植物源性低成本hTf融合系统，作为我们的一个长期研究目标。作为药物送递系统的hTf，提供了几个独特的优势，包括hTf结合蛋白质药物的高效率转运进入靶细胞，例如癌细胞，和延长血清半衰期和提高结合蛋白的治疗疗效。O'Keefe和Draper（1985）报道hTf结合蛋白白喉毒素对于培养的胸苷激酶缺乏的鼠L（LMTK）细胞是高细胞毒性的，与单纯的白喉毒素相比敏感性改了大约10000倍。此外，hTf抵抗肠胃消化，结合和内化到人类肠道上皮细胞，越来越多的证明其作为潜在的具有治疗作用的蛋白质口服递送系统（Widera et al., 2004; Bai
et al., 2005）。我们的ELISA数据显示植物源性rhTf的内化进入希拉细胞是剂量依赖式的，效能与商业性hTf相似（图7）。植物源性整体型rhTf或商业性整体型hTf的内化效能比分离型的要高。这可能反映了两类hTf对于存在于希拉细胞上的hTf受体的亲和力的差异。整体型hTf在生理PH下比分离型hTf有更高的hTf受体亲和力。当细胞内化过程主要取决于受体调节时，在受体亲和力上的差异将决定hTf内化入细胞的效率（Li and Qian, 2002）。ELISA法证明，植物源性rhTf-GLP-1或rhTf-GLP-1x10孵育的希拉细胞裂解物上清液，与相同浓度的植物源性rhTf或商业性分离型hTf标准孵育的希拉细胞裂解上清液中的内化蛋白相比，含有相似或更高水平的内化重组融合蛋白（图8）。这个结果有重要的影响。一个是融合蛋白并不影响植物源性rhTf内化进入哺乳动物细胞的能力。成功使用植物rhTf作为载体靶向送递多肽和蛋白类药物是非常关键。另一意义是内化的hTf融合蛋白可能减少了反向循环至细胞表面的率，与通过融合伴侣引起的结构改变所导致的未改性hTf相比，因此，融合蛋白可能潜在内化后的一长段时间内保留在细胞内。这或许有助于最大限度地发挥Tf结合蛋白药物的治疗效果。虽然有用，但内化后Tf回到细胞表面的快速再循环可能显著阻碍它作为药物载体的效能。例如，K562细胞（人红白血病源性细胞株）上进行
的hTf转运研究显示，整个hTf周期仅维持4 - 5分钟，在观察到对细胞的毒性作用之前，需要30次这样的Tf毒性结合转运逐次循环（Klausner et al.,1983; Johnson et al., 1988）。免疫蛋白印迹分析显示，植物源性rhTf融合蛋白在体外哺乳动物细胞内是稳定的（图8b）。总起来说，在转基因植物中，没有报告有hTf的产生。在此，我们报告了在转基因植物中生产出rhTf，并证明植物源性rhTf保留了许多与天然蛋白质相同的
功能。虽然hTf有许多潜在应用价值，但它尤其在医学应用领域有巨大的意义，例如在人类转铁蛋白缺乏症的治疗、IR伤害、心血管疾病和其作为药物送递系统的有效性；当前使用传统表达系统的rhTf的小量生产率制约了其广泛应用。植物会通过提供大量、高质量、低成本的rhTf来提供解决办法。此外，当前的工作表明植物源性rhTf有潜力成为一个引人注目的特定细胞或口腔送递多种治疗分子的新送递系统，允许其为未来的广谱疾病开发新的治疗药物的可能性。
实验步骤
构建植物表达载体
OriGene获得了cDNA克隆编码的hTf（Rockville,MD, USA）。hTf的cDNA序列可以通过应用设计的正向（5'-ATGATATCATGAGGCTCGCCGTGGGAGC-3'）和反向（5'-AATCTAGATTAAAGCTCATCCTTATGATGATGATGATGATGAGGTCTACGGAAAGTGCAGGC-3'）启动子pCMV6质粒聚合酶链反应（PCR）得到扩增。正向引物结合了一个EcoRV位点（下划线）立即从起始密码子（粗体）的上游开始。反向密码子包含了一个改良的6组氨酸片段（下划线），后面是内质网ER保留信号KDEL（斜体），终止码（双下划线）和Xbal位点。按以下参数进行PCR扩增：94℃下45s变性，55℃下45s退火，72℃下2min延长，共35循环，最后72℃下10min延长。得到的PCR产品平齐末端结扎至pUC19的Hincll位点，以产生DNA测序证实的完整pUC19-hTf质粒序列（Sequencing Facility; Robarts Research Institute, London, ON,Canada）。hTf开放读框架，作为EcoRV/Xbal片段解除pUC19-hTf，并结扎至pBlueUTL在Xbal/Smal以产生PUTL-hTf。pBlueUTL质粒来源于pBluescript II SK(-)，包含一个克隆的5'UTL序列从pRTL-GUS解除的TEV（Carrington and Freed, 1990）作为EcoRI/Ncol片段，Ncol位点移除绿豆核酸，处理并在EcoRI和Smal位点之间插入pBluescript II SK(-)。UTL-hTf 序列作为Xhol/Xbal片段从PUTL-hTf解除并结扎至pRTL-GUS，通过替换UTL-GUS以产生pRTL-hTf质粒。
pRTL-GUS质粒包括增强的花椰菜花叶病毒（CaMV）的双35S（e35S）启动子和胭脂氨酸合酶（NOS）终止子序列。pRTL-hTf中hTf的3'Xbal位点由Xbal消化破坏，克莱治疗（Klenow treatment）和其后的平齐末端结扎。完整表达卡座作为Sphl片段，从pRTL-hTf上移除，克莱处理并在Smal插入pBluescript II SK(-)以产生pBlue35S-hTf。完整表达卡座从pBlue35S-hTf上移除，作为Sall/Xbal片段为其后克隆转化成二元植物转移菌pBIN 19（Bevan, 1984）生成最终植物转化菌pRJC-hTf。
质粒pRJC-hTf用于构建新质粒，表达了一种由hTf和30氨基酸肽类激素——胰高血糖素样肽-1（GLP-1）（hTf-GLP-1）或其衍生物（hTf-GLP-1x10）——组成的融合蛋白。通过熔断合成的DNA序列——编码GLP-1或GLP-1的10串联重复（hTf-GLP-1x10）（Brandsma et al., 2009）——到hTf编码序列的3'末端来做到这一点。6xHis标签和KDEL序列放置到融合蛋白的3'末端以促进在内质网的纯化和保留。
生成转基因植物
所有的植物转化菌转入土壤杆菌LBA4404，通过三亲交配（Ma et al., 2005）然后按Horsch等（１９８５）的方法引入低生物碱烟草cv. 81V9。主要转基因植物通过包含１００ｍｇ／Ｌ卡那霉素的ＭＳ培养基筛选。随着再生植物的成熟，它们就被转移到温室内并培养以便进一步分析。
通过ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ筛选理想的转基因植物
利用苯酚/氯仿技术萃取总基因组ＤＮＡ（Ma et al., 2005）。通过使用特定的引物，总基因组DNA经过PCR以确认转基因整合进入植物核基因组。
对于RT-PCR分析，按照制造商的说明利用Trizol试剂提取工具（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）萃取总植物RNA。为引发最初的综合反应，大约0.5 ug的低聚糖（dT）12-18引物退火为5ug的纯化RNA，12uL的总反应体积、70℃10min。cDNA的生成是在加了20USuperScript TM II核糖核酸酶H逆转录酶（Invitrogen），经过42℃、50min孵育后再经过70℃、15min的孵育。利用特定引物对，在100uL的总反应体积中，大约有150ng首批合成的cDNA作为模板以行PCR扩增。
rhTf在转基因植物中的积累
通过PCR证实插入植物基因组的转基因有正面效应RT-PCR证实转基因表达的转基因植物，通过转基因蛋白的积累经SDS-PAGE和免疫印迹法进行了分析。简言之，转基因烟草植物的最上面的叶子组织，经过液氮混匀且经冷的缓冲萃取液中重悬浮[25 m M Tris(pH 7.0), 50 m M NaCl, 2 m M b-mercaptoethanol, 1 m M phenylmethylsulfonylfluoride, 2 l g ?mL pepstain A and 2 l g ?mL leupeptin]。经过4℃、13000g、10min的离心分离获得上清液。可溶性蛋白质总浓度由Bradford方法决定，使用Bio-Rad蛋白染色分析剂和以BSA作为蛋白标准。蛋白样本在样本缓冲液中煮沸10min，在12.5%（w/v）的SDS-PAGE凝胶中分离并利用半干传输法用聚二氟乙烯（PVDF）薄膜标记。在37℃的含5%脱脂牛奶的TBS-T[20 m M Tris, 150 m M NaCl, 0.02% (v ?v) Tween 20, adjusted to pH 7.6]中封闭1h，薄膜在1:500(V/V)稀释浓度的山羊抗hTf单克隆抗体中孵育2h，然后在兔抗山羊二抗结合辣根过氧化物酶中孵育（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA）。根据制造商的说明，通过增强化学发光反应组件，每个位点上检测到的蛋白带。
植物源性rhTf的定量检测
转基因植物中积累的rhTf数量，采用间接酶联免疫吸附测定（ELISA）而量化，与作为蛋白标准的已知量的hTf参考蛋白对比。简言之，在碳酸氢钠（pH9.6）重悬过的总蛋白样品在96孔板中4℃孵育过夜。每孔用PBS-T洗三次[phosphate buffered saline containing 0.05% (v ?v) Tween-20]，室温下在加了3%（V/V）BSA的PBS-T中培养2h。PBS-T洗后，添加稀释至1:5000(v/v)的羊抗hTF单克隆抗体并4℃过夜。三次PBS-T洗后，添加辣根过氧化物酶结合猪抗羊IgG抗体，室温下孵育1h。根据厂商说明添加四甲基联苯胺酶底物，黑暗环境下室温孵育30min。通过每孔添加100uL终止液来终止底物反应。微板块读取器在450nm测量光密度值(OD)，通过标准参考hTF蛋白构建的ELISA参考标准曲线，转换成总提取蛋白质的百分比。
植物源性rhTf的His-purification
按照厂商说明，利用HiTrap螯合HP柱体通过组氨酸亲和层析，通过转基因烟叶提取物纯化获得植物源性rhTf。简言之，在温室生长6周的烟草植物最上面完全展开的叶子(5克)的样本，在前述的1:4(v?v)的样本和缓冲液比例的蛋白质提取缓冲液中混匀。匀浆在4℃下13000g离心15min。收集上清液，4℃、13000g再次离心10min。总共收集大约5毫升上清液，加入HiTrap螯合HP柱体，缓冲液洗[10 m M imidazole, 20 m M Na2HPO4, 500 m M NaCl]，用于去除非特异性内源性烟草蛋白质。通过洗脱缓冲液[500 m M imidazole,20 m M Na2HPO4, 500 m M NaCl]，植物源性rhTf通过柱
体，1mL留作后续研究分析。洗脱的rhTf部分，用大量PBS析出，通过4℃真空凝聚。
植物源性rhTf的酶与化学去糖基化
植物源性rhTf地位的糖基化状态，通过两酶和化学去糖基化方法得到证明。对于酶去糖基化，按照厂商说明，用缩氨酸-N糖苷酶F（PNGases F）消化植物源性总蛋白提取液和His-purified的rhTf。商购得去糖基化hTf作为阳性对照组。在酶处理之前，样品在变性缓冲液中煮沸10分钟而变性。对于化学去糖基化，His-purified的rhTf 按照前述的变性，并按照厂商说明经GlycoPro化学去糖基化试剂处理。所有经处理的样本通过12.5%SDS-PAGE分析，然后用抗hTf抗体做免疫蛋白印迹检测。
体外铁结合检验
植物源性rhTf络合铁的能力，通过微小改良Lim等所描述的分光光度法而测定(2004)。简单地说,大约5毫克的His-purified 的植物源性rhTf，添加到1毫升含过量铁的溶液[FeNH4(SO4)2 dissolved in 0.1 M NaHCO3 to make1 ?10)3M Fe3+].]。溶液在室温条件下1 h，稀释10倍后在465和280nm的吸光度测量。铁饱和人类转铁蛋白(holo-hTf) 有一个已描述吸收比0.045 - -0.054(A465?A280)，而人类无铁apo转铁蛋白(apo-hTf)有一个大约0.02的A465?A280比。商业性人类apo-hTf和holo-hTf作为阳性控制组，而无关蛋白OV A被作为阴性对照组。
植物源性整体型rhTF的制备
从A465?A280 OD比判断，His-purified 植物源性rhTf不含铁(例如，分离型的生产)。为了制备其整体型的，His-purified的植物源性rhTf在结合铁缓冲液中，冰上30分钟孵育[[280 l M FeNH4(SO4)2。6H2O titrated with 1 M NaHCO3]，然后进行广泛的PBS透析。透析后，浓缩样本，经处理样品的铁饱和度水平通过阅读A465?A280确定，以商业holohTf作为标准。
植物源性rhTf体外抗菌活性的评价
通过植物源性rhTf抑制铜绿假单胞菌的生长能力评估其抗菌活性。简言之，铜绿假单胞菌杆菌在TB液体培养基中过夜生长[胰蛋白胨12 g?L、酵母提取物24 g?L、甘油4毫升、pH值7.4] 在600nm(OD600)光学密度约0.7。隔夜培养基稀释1:500 (v?v)至新鲜TB液体培养基，包含His-purified的植物源性rhTf、商业apo-hTf标准，或者从HiTrap结合HP柱体洗脱的洗脱液，对照组81V9烟叶的TSP提取物，并以最初的OD600作为0时间取值。每3小时取一次OD600的读值，直到观察到增长高峰。铜绿假单胞菌在37℃、250r.p.m.的50-mL的Falcon锥形管中培养。
植物rhTF对Hela细胞生长的影响
植物源性rhTf对哺乳动物细胞生长和分化的影响，通过哺乳动物HeLa细胞增殖得到证实。人上皮细胞株HeLa 229培养在添加了10%(v?v)ＦＢＳ，100Ｕ?毫升青霉素、0.1毫克?毫升链霉素和2毫米谷酰胺的RPMI1640培养基中，３７℃、５％ＣＯ２和９５％空气。胰蛋白酶- EDTA溶液获取培养的Hela细胞，离心１３０００ｇ、５ｍｉｎ，含大豆胰蛋白酶抑制剂的无血清Ham'S（SFF12）培养液清洗。细胞通过离心成团块儿、在SFF12培养基中重悬，
用标准血细胞计数器计数。细胞铺在60x15-mm的培养皿里，在完全RPMI1640培养基，密度为每皿5x104个细胞，培养24h。长满之后，用无血清培养基SFF12洗两次板子，孵育在37℃的SFF12无血清培养基中10min，使这些细胞处于血清饥饿状态。添加了不同形式(holo或apo)不同浓度的His-purified植物源性rhTf或商业hTf标准，板子孵化时期不同(1 - 4天)。孵育后，细胞通过悬浮在胰蛋白酶-EDTA收集并计数。控制组细胞培养于单纯SFF12培养基或含10%(v?v)FBS的SFF12培养基中。每个实验值代表了三个皿中细胞的平均数量。实验重复两次。
植物rhTf对小鼠肾脏肾小管上皮细胞生长的影响
我们增加了植物源性rhTf鼠肾上皮细胞生长和增殖的影响。肾上皮细胞系NG1.1(NG)培养于添加了10%(v?v)FBS和激素混合物（5 u g?mL胰岛素、34pg/mL三碘甲状腺氨酸、5ug/mL毫升转铁蛋白、1.73ng?毫升亚硒酸钠、8 ng氢化可的松和25ng?毫升表皮生长因子)的K1培养基(50 : 50 DMEM a nd Ham’s F12;Invitrogen)，100U?毫升青霉素和0.1毫克?毫升链霉素。胰蛋白酶- EDTA溶液获取培养的NG细胞，离心(13 000g、5分钟)，无血清培养液洗两次，不含转铁蛋白的K1培养基，用同样的无血清培养基重悬并计数。然后将细胞接种于含完全K1培养基的三块96孔培养板中，细胞浓度为1x104/孔，37℃过夜以使细胞贴壁。无血清培养液清、无转铁蛋白K1培养基洗细胞，在同一无血清培养基中使细胞饥饿3小时。添加了不同形式的植物源性rhTf 或hTf标准后，在添加[3 H]-thymidine 之前，培养板在37℃孵育48h。继续孵化16-18-h,，收获细胞到玻璃纤维过滤器、[3 H]-
thymidine结合物用测试板计数器以每分钟测量计数(cpm)。生长在完全K1培养基的NG1.1细胞作为阳性控制组。
内化的植物源性rhTf的检测
利用体外HeLa细胞检测内化的植物源性rhTf。培养于新鲜10% (v?v)FBS-RPMI 1640培养基中的Hela细胞(0.5x106)，接种到60x15毫米的皮氏培养皿中，37℃生长24h。接种之后，移除培养基，无血清SFF12培养液清洗细胞两次。然后将板子接种于无血清培养基SFF12中，37℃、1h，使细胞处于血清饥饿状态。然后添加植物源性rhTf或商业性hTf，37℃继续孵育60min。通过将板子转移到冰上使反应停止，冷PBS清洗以清除多余的或为结合的rhTf。为了去除细胞膜结合的植物源性rhTf，在冰上用增酸剂处理[[500 m M NaCl, 200 m M acetic acid, pH4.5]5分钟，然后按照Karin和Mintz描述的那样用冷PBS清洗。随后用裂解缓冲液裂解细胞[1% (v ?v) TritonX-100, 50 m M Tris–HCl,150 m M NaCl, 2 m M EDTA, 10 m M NaF, 1 m M vanadate, 1 : 100(v ?v) phosphatase inhibitor cocktail, pH 7.4]。细胞裂解物在4℃、10000g下离心10min以去除细胞碎屑。收集上清液（含有细胞质和核蛋白），其蛋白质含量通过利用Bio-Rad试剂盒和BSA作为标准的布拉德福法测定。内化的植物源性rhTf通过利用抗hTf抗体和可视化12.5%(w?v) sds - page凝胶的ELISA法进行量化，然后通过利用抗hTf单克隆抗体的免疫蛋白印迹法测量。
内化植物源性rhTf融合蛋白的检测
包含rhTf和抗糖尿病肽段胰高血糖素样肽-1(GLP-1)(hTf-GLP-1) 或倍增的GLP-1肽(10 GLP-1串联重复) (hTf-GLP-1x10)的植物源性rhTf融合蛋白，是植物额外产生的以测试植物源性rhTf作为一种新的载体系统以送递治疗药物进入特定细胞的潜在性能。使用前述的同样的方法利用HeLa细胞评估细胞摄入植物源性rhTf融合蛋白。
统计分析
除另有规定，本文中阐述的所有实验包含统计分析完全是独立完成的，一式三份。用配对T检验来确定样本之间的差别是否显著。规定P < 0.05是有意义。
鸣谢
Martin Brandsma获得了NSERC(自然科学和工程研究委员会)的研究生奖学金。本研究的一部分是NSERC支持的。