有机酚法和Chelex_100法提取不同组织微量DNA效果比较
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Comparison the effect of phenol/ chloroform method and Chelex - 100 method on micro DNA extraction using different tissues
CHEN H ui1) , LIU Yongbo1 ) , XIE Qingrui2) , LI Xiaowen1 ) , ZHANG Qingxian3 )
基因座遗传多态性研究. 洛阳医专学报, 2001, 19( 1) : 34 8 薛小琦, 莫耀南, 艾红伟. STR FGA 基因 座变异 1 例. 法 医
学杂志, 2001, 17( 2) : 121 9 刘秋玲, 任新尧, 吕德坚, 等. 亲子鉴定中 2 个 STR 基因 座
突变 1 例. 中国法医学杂志, 2001, 16( 4) : 238 ( 2004- 04- 13 收稿 责任编辑赵秋民)
l) 、血纸片或 血纱布、口腔拭 子、发 根( 5 根) 置于 500 l 去离子水中, 室温下 10 min, 12 000 r min- 1离 心 5 min, 弃上清, 重复 2 次。加入 200 l Chelex 100( 50 g/ L) , 置 56 30 min 以上, 震荡15~ 30 s。 置 100 10 min, 震荡15~ 30 s, 于12 000 r min- 1离 心 5 min, 取 5 l 用于 PCR 扩增。 1. 3 PCR 反 应体 系 在反 应管 中加 入 10 STR buffer 2. 5 l, D5S818、D12S391 左右侧引物各 1 l( 25 mol/ L) , Taq DNA 聚合酶 1. 5 U/ 管, 有机酚法提取 DNA 1. 5 l 或 Chelex 法提取 DNA 5 l, 补充水至 25
Key words micro tissue; DNA extraction; short tandem repeats ( STR) Abstract Aim: To compare the effect of phenol/ chloroform method and Chelex- 100 method on micro DNA extraction us ing different tissues. Methods: The genome DNA was extracted by phenol/ chloroform method and Chelex- 100 method from pe ripheral blood, fetal umbilical cord blood, villi, amniotic fluid, placental tissue hair, blood blot, hair, and oral secretion, re spectively. With STR D12S391and D5S818 amplification and electrophoresis on denaturation polyacrylamid gel, the extracted DNA was analyzed. Results: T he Chelex- 100 DNA extracting method was adept to the different tissues, such as peripheral blood, fe tal umbilical cord blood, villi, placental tissue, hair, and oral secretion with similar efficiency to phenol/ chloroform method. Concl usion: The Chelex- 100 DNA extracting method is efficient and quick, which is useful to forensic identification and prena tal diagnosis.
在法医鉴定和产前诊断中, 用于限制性片断长 度多 态 性 ( restriction fragment length polymorphism, RFLP) 分析和 PCR 扩增分型或 STR 研究的 DNA 样 本来源多样, 如新鲜全血、精斑、毛发、烟头、案发现 场微量血迹、绒毛、胎儿羊水细胞等, 同时取材部位、 取材量和取材时间都受到限制, 因此建立稳定、高效 而快速的 DNA 提取方法对法医鉴定和产前诊断具 有十分重要的作用。作者比较有机酚法和 Chelex 100 法提取不同检材中的 DNA, 以期寻求从微量检 材中快速提取 DNA 的简便方法, 为应用 STR 位点多 态性进行准确快速的法医鉴定以及连锁分析检出携 带者, 并对高危胎儿进行产前基因诊断奠定基 础[ 1~ 4] 。
1 材料与方法
1. 1 材料 4 例脐带血、羊水、胎盘、母血为胎儿出 生时收集样本; 4 例绒毛样本与孕母 血为孕 2 个月 左右行刮宫术收集的绒毛与宫腔出血。抽取 1 例父 子的静脉血并制成血纸片、血纱布, 同时收集其口腔 拭子、发根毛囊。静脉血样、脐带血用 1/ 10 体积 20 g/ L 的 EDTA 抗凝, - 20 保 存备用; 胎盘、绒毛用 生理盐水冲洗数次后, - 20 保存备用。 1. 2 DNA 制备 1. 2. 1 有机酚法提取 DNA: 血样、羊水、血纸片或 血纱布、口腔拭子、毛囊的 DNA 提取: 取 100 l 血 样、100 l 羊水于1. 5 ml Ependorf 管中, 血纸片或血 纱布( 血斑约 0. 5 cm) 、口腔拭子、带毛囊发根( 5 根) 置于 500 l 生理盐水中, 室温 10 min 后放入1. 5 ml Ependorf 管中, 加入等体积 2 蔗糖- Triton X- 100 溶液 ( 0. 64 mmol/ L 蔗 糖, 0. 01 mol/ L MgCl2, 0. 02 mol/ L Tris- HCl, 体积 分数为 2% 的 Triton X- 100
溶液) , 混匀后 12 000 r min- 1离心 5 min, 小心去上 清, 留底部血膜, 加入 EDTA- Na2( 75 mmol/ L NaCl, 24 mmol/ L EDTA- Na2, pH= 8. 0 ) 溶液 200 l、SDS ( 100 g/ L) 20 l、蛋白酶 K( 10 g/ L) 5 l, 混匀, 37 水浴 4 h 以上。加入等体积的酚、酚和氯仿 ( 1: 1) 、 氯仿各抽提 1 次, 加 1/ 10 体积的 3 mol/ L NaCl 和 2. 5 倍体积的冷无水乙醇混匀。12 000 r min- 1离心 5 min, 弃上清, DNA 沉淀晾干后, 溶于15~ 20 l 无菌 双蒸水中, 取 1. 5 l 用于 DNA 扩增。 胎盘、绒毛 DNA 的提取: 将胎盘、绒毛用生理盐水冲洗数次后 取约 0. 1 g 于 1. 5 ml EDTA- Na2 缓冲液中研磨匀 浆。取 50 l 匀浆液, 加入 500 l EDTA- Na2、1/ 10 体积的 SDS( 100 g/ L) 和 15 l 蛋白酶 K( 10 g/ L) , 于 37 水浴 4 h 以上。酚抽提及 DNA 沉淀同血样抽 提。 1. 2. 2 Chelex - 100 法 提取 DNA[ 5] : 将 新 鲜血 样 ( 100 l) 、羊水( 100 l ) 、胎盘或绒毛组织匀浆液( 50
* 河南省自然科学基金资助项目 0111022300
Journal of Zhengzhou University(Medical Sciences) Dec. 2004 Vol. 39 No . 6
989
1 ) Department of Cell Biology and Medical Genetics, Basic Medical College, Zhengzhou University , Zhengzhou 450052 2 ) Department of Gynecology and Obstetrics , the First People s Hospital of Luohe, Luohe 460000 3 ) Department of Histology and Embryology , Basic Medical College, Zhengzhou University , Zhengzhou 450052
988
郑州大学学报( 医学版) 2004 年 11 月 第 39 卷 第 6 期
基因 座 是 由 突 变 造 成 的, 此 时 计 算 RCP 超 过 99. 95% 可以做出认定结论。本系在实际检案中遇 到过 几例 有 1 个 基 因座 突 变的 案 例, 如 D21S11、 FGA[ 8] 等。但是在单 亲鉴定中只遇到 1 例, 经常规 检测 24 个基因座只有 D19S253 违反遗传规律, 于是 又 加 测 了 D14S608、D6S477、D4S2639、D15S659、 D16S3253 、D17S1290、D19S400、D13S796、D16S539、 D22S683、APOA - 1、D1S518、D2S1338、D18S51、 D11S554、ACTBP、FES/ EPS 17 个 基因座未发现 再有 排除的基因座, 显 然认定亲生关系 应不存在问题。 已有报道在亲子鉴定中两个 STR 基因座同时发生 突变的案例[ 9] , 目前还没有报道 3 个基因座同时发 生突变的案例。理论上计算 3 个基因座同时突变造 成误排生父的概率仅为 4 10- 9[ 6] , 因此 3 个或 3 个 以上基因座违反遗传规律, 作出排除亲生关系的结 论应该是正确的。
参考文献
mother .Transfusion, 1993, 33: 51 2 杨庆恩, 余纯应, 陈慧, 等. 同步 分型 16 个 STR 位 点及 法
医学应用研究. 刑事技术, 1999, 134( 2) : 16 3 余纯应, 杨庆恩, 朱传红, 等. 汉族人群五个 STR 基因座 的
多态性调查. 中国法医学杂志, 1997, 12( 2) : 69 4 杨庆恩. 亲子鉴 定 DNA 分型亲 权指 数的 简化 计算 方法.
中国法医学杂志, 1998Fra Baidu bibliotek 13( 2) : 90 5 杨庆恩. DNA 在法 庭科学 中的应 用. 北 京: 中国人 民公 安
大学出版社, 1994. 167 6 郭景元, 李伯龄. 中国刑事科学技术大全 法医 物证学. 北
京: 中国人民公安大学出版社, 2002. 850, 316, 864 7 莫耀 南, 薛小 琦, 艾红 伟, 等. 河南 汉 族人 群 TPOX、TH01
1 Brenner CH. A note on paternity computation in cases lacking a
有机酚法和 Chelex- 100 法提取不同组织微量 DNA 效果比较*
陈 辉1) 刘永波1) 谢庆瑞2) 李晓雯1) 张钦宪3)
1) 郑州大学基础医学院细胞生物学与医 学遗传学教研室 郑州 450052 2) 漯河市第一人民医院妇产科 漯河 460000 3) 郑州大 学基础医学院组织学与胚胎学教研室 郑州 450052
女, 36 岁 , 硕士, 讲师, 研究方向: 遗传病的基因诊断, E- mail: chenhhn@ tom. com
关键词 微量组织; DNA 提取; STR 位点 中图分类号 R394- 33 摘要 目的: 比较有机酚法和 Chelex- 100 法提取不同组织微量 DNA 的效果。方 法: 分 别用有机酚 法和 Chelex - 100 法从外周血、脐带血、绒毛、羊 水、胎盘、血斑、口腔 分泌 物、发 根毛 囊中提 取微 量基 因组 DNA, 进行 D12S391、 D5S818 基因座扩增, 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分析。结果: 外周血、脐带血、绒毛、胎盘、口腔分 泌物、发根毛囊均 适 于用 Chelex- 100 法提取 DNA, 效果与有机酚法 相似。结 论: Chelex 法是一 种高效 而快速的 微量 DNA 提取方 法, 适 用于产前诊断和法医鉴定微量组织的检测。
CHEN H ui1) , LIU Yongbo1 ) , XIE Qingrui2) , LI Xiaowen1 ) , ZHANG Qingxian3 )
基因座遗传多态性研究. 洛阳医专学报, 2001, 19( 1) : 34 8 薛小琦, 莫耀南, 艾红伟. STR FGA 基因 座变异 1 例. 法 医
学杂志, 2001, 17( 2) : 121 9 刘秋玲, 任新尧, 吕德坚, 等. 亲子鉴定中 2 个 STR 基因 座
突变 1 例. 中国法医学杂志, 2001, 16( 4) : 238 ( 2004- 04- 13 收稿 责任编辑赵秋民)
l) 、血纸片或 血纱布、口腔拭 子、发 根( 5 根) 置于 500 l 去离子水中, 室温下 10 min, 12 000 r min- 1离 心 5 min, 弃上清, 重复 2 次。加入 200 l Chelex 100( 50 g/ L) , 置 56 30 min 以上, 震荡15~ 30 s。 置 100 10 min, 震荡15~ 30 s, 于12 000 r min- 1离 心 5 min, 取 5 l 用于 PCR 扩增。 1. 3 PCR 反 应体 系 在反 应管 中加 入 10 STR buffer 2. 5 l, D5S818、D12S391 左右侧引物各 1 l( 25 mol/ L) , Taq DNA 聚合酶 1. 5 U/ 管, 有机酚法提取 DNA 1. 5 l 或 Chelex 法提取 DNA 5 l, 补充水至 25
Key words micro tissue; DNA extraction; short tandem repeats ( STR) Abstract Aim: To compare the effect of phenol/ chloroform method and Chelex- 100 method on micro DNA extraction us ing different tissues. Methods: The genome DNA was extracted by phenol/ chloroform method and Chelex- 100 method from pe ripheral blood, fetal umbilical cord blood, villi, amniotic fluid, placental tissue hair, blood blot, hair, and oral secretion, re spectively. With STR D12S391and D5S818 amplification and electrophoresis on denaturation polyacrylamid gel, the extracted DNA was analyzed. Results: T he Chelex- 100 DNA extracting method was adept to the different tissues, such as peripheral blood, fe tal umbilical cord blood, villi, placental tissue, hair, and oral secretion with similar efficiency to phenol/ chloroform method. Concl usion: The Chelex- 100 DNA extracting method is efficient and quick, which is useful to forensic identification and prena tal diagnosis.
在法医鉴定和产前诊断中, 用于限制性片断长 度多 态 性 ( restriction fragment length polymorphism, RFLP) 分析和 PCR 扩增分型或 STR 研究的 DNA 样 本来源多样, 如新鲜全血、精斑、毛发、烟头、案发现 场微量血迹、绒毛、胎儿羊水细胞等, 同时取材部位、 取材量和取材时间都受到限制, 因此建立稳定、高效 而快速的 DNA 提取方法对法医鉴定和产前诊断具 有十分重要的作用。作者比较有机酚法和 Chelex 100 法提取不同检材中的 DNA, 以期寻求从微量检 材中快速提取 DNA 的简便方法, 为应用 STR 位点多 态性进行准确快速的法医鉴定以及连锁分析检出携 带者, 并对高危胎儿进行产前基因诊断奠定基 础[ 1~ 4] 。
1 材料与方法
1. 1 材料 4 例脐带血、羊水、胎盘、母血为胎儿出 生时收集样本; 4 例绒毛样本与孕母 血为孕 2 个月 左右行刮宫术收集的绒毛与宫腔出血。抽取 1 例父 子的静脉血并制成血纸片、血纱布, 同时收集其口腔 拭子、发根毛囊。静脉血样、脐带血用 1/ 10 体积 20 g/ L 的 EDTA 抗凝, - 20 保 存备用; 胎盘、绒毛用 生理盐水冲洗数次后, - 20 保存备用。 1. 2 DNA 制备 1. 2. 1 有机酚法提取 DNA: 血样、羊水、血纸片或 血纱布、口腔拭子、毛囊的 DNA 提取: 取 100 l 血 样、100 l 羊水于1. 5 ml Ependorf 管中, 血纸片或血 纱布( 血斑约 0. 5 cm) 、口腔拭子、带毛囊发根( 5 根) 置于 500 l 生理盐水中, 室温 10 min 后放入1. 5 ml Ependorf 管中, 加入等体积 2 蔗糖- Triton X- 100 溶液 ( 0. 64 mmol/ L 蔗 糖, 0. 01 mol/ L MgCl2, 0. 02 mol/ L Tris- HCl, 体积 分数为 2% 的 Triton X- 100
溶液) , 混匀后 12 000 r min- 1离心 5 min, 小心去上 清, 留底部血膜, 加入 EDTA- Na2( 75 mmol/ L NaCl, 24 mmol/ L EDTA- Na2, pH= 8. 0 ) 溶液 200 l、SDS ( 100 g/ L) 20 l、蛋白酶 K( 10 g/ L) 5 l, 混匀, 37 水浴 4 h 以上。加入等体积的酚、酚和氯仿 ( 1: 1) 、 氯仿各抽提 1 次, 加 1/ 10 体积的 3 mol/ L NaCl 和 2. 5 倍体积的冷无水乙醇混匀。12 000 r min- 1离心 5 min, 弃上清, DNA 沉淀晾干后, 溶于15~ 20 l 无菌 双蒸水中, 取 1. 5 l 用于 DNA 扩增。 胎盘、绒毛 DNA 的提取: 将胎盘、绒毛用生理盐水冲洗数次后 取约 0. 1 g 于 1. 5 ml EDTA- Na2 缓冲液中研磨匀 浆。取 50 l 匀浆液, 加入 500 l EDTA- Na2、1/ 10 体积的 SDS( 100 g/ L) 和 15 l 蛋白酶 K( 10 g/ L) , 于 37 水浴 4 h 以上。酚抽提及 DNA 沉淀同血样抽 提。 1. 2. 2 Chelex - 100 法 提取 DNA[ 5] : 将 新 鲜血 样 ( 100 l) 、羊水( 100 l ) 、胎盘或绒毛组织匀浆液( 50
* 河南省自然科学基金资助项目 0111022300
Journal of Zhengzhou University(Medical Sciences) Dec. 2004 Vol. 39 No . 6
989
1 ) Department of Cell Biology and Medical Genetics, Basic Medical College, Zhengzhou University , Zhengzhou 450052 2 ) Department of Gynecology and Obstetrics , the First People s Hospital of Luohe, Luohe 460000 3 ) Department of Histology and Embryology , Basic Medical College, Zhengzhou University , Zhengzhou 450052
988
郑州大学学报( 医学版) 2004 年 11 月 第 39 卷 第 6 期
基因 座 是 由 突 变 造 成 的, 此 时 计 算 RCP 超 过 99. 95% 可以做出认定结论。本系在实际检案中遇 到过 几例 有 1 个 基 因座 突 变的 案 例, 如 D21S11、 FGA[ 8] 等。但是在单 亲鉴定中只遇到 1 例, 经常规 检测 24 个基因座只有 D19S253 违反遗传规律, 于是 又 加 测 了 D14S608、D6S477、D4S2639、D15S659、 D16S3253 、D17S1290、D19S400、D13S796、D16S539、 D22S683、APOA - 1、D1S518、D2S1338、D18S51、 D11S554、ACTBP、FES/ EPS 17 个 基因座未发现 再有 排除的基因座, 显 然认定亲生关系 应不存在问题。 已有报道在亲子鉴定中两个 STR 基因座同时发生 突变的案例[ 9] , 目前还没有报道 3 个基因座同时发 生突变的案例。理论上计算 3 个基因座同时突变造 成误排生父的概率仅为 4 10- 9[ 6] , 因此 3 个或 3 个 以上基因座违反遗传规律, 作出排除亲生关系的结 论应该是正确的。
参考文献
mother .Transfusion, 1993, 33: 51 2 杨庆恩, 余纯应, 陈慧, 等. 同步 分型 16 个 STR 位 点及 法
医学应用研究. 刑事技术, 1999, 134( 2) : 16 3 余纯应, 杨庆恩, 朱传红, 等. 汉族人群五个 STR 基因座 的
多态性调查. 中国法医学杂志, 1997, 12( 2) : 69 4 杨庆恩. 亲子鉴 定 DNA 分型亲 权指 数的 简化 计算 方法.
中国法医学杂志, 1998Fra Baidu bibliotek 13( 2) : 90 5 杨庆恩. DNA 在法 庭科学 中的应 用. 北 京: 中国人 民公 安
大学出版社, 1994. 167 6 郭景元, 李伯龄. 中国刑事科学技术大全 法医 物证学. 北
京: 中国人民公安大学出版社, 2002. 850, 316, 864 7 莫耀 南, 薛小 琦, 艾红 伟, 等. 河南 汉 族人 群 TPOX、TH01
1 Brenner CH. A note on paternity computation in cases lacking a
有机酚法和 Chelex- 100 法提取不同组织微量 DNA 效果比较*
陈 辉1) 刘永波1) 谢庆瑞2) 李晓雯1) 张钦宪3)
1) 郑州大学基础医学院细胞生物学与医 学遗传学教研室 郑州 450052 2) 漯河市第一人民医院妇产科 漯河 460000 3) 郑州大 学基础医学院组织学与胚胎学教研室 郑州 450052
女, 36 岁 , 硕士, 讲师, 研究方向: 遗传病的基因诊断, E- mail: chenhhn@ tom. com
关键词 微量组织; DNA 提取; STR 位点 中图分类号 R394- 33 摘要 目的: 比较有机酚法和 Chelex- 100 法提取不同组织微量 DNA 的效果。方 法: 分 别用有机酚 法和 Chelex - 100 法从外周血、脐带血、绒毛、羊 水、胎盘、血斑、口腔 分泌 物、发 根毛 囊中提 取微 量基 因组 DNA, 进行 D12S391、 D5S818 基因座扩增, 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分析。结果: 外周血、脐带血、绒毛、胎盘、口腔分 泌物、发根毛囊均 适 于用 Chelex- 100 法提取 DNA, 效果与有机酚法 相似。结 论: Chelex 法是一 种高效 而快速的 微量 DNA 提取方 法, 适 用于产前诊断和法医鉴定微量组织的检测。