抗生素微生物测定法.ppt
抗生素微生物检定法讲解学习
试验准备
试验准备
管碟法的操作底层的制备： 每碟加底层培养基20ml，
待培养基凝固后，盖上 陶瓦盖，置35~37℃培 养箱中，待用。 ▪ 菌层的制备： 加入约含1%浓度菌悬液的 培养基5ml作为菌层
管碟法的操作步骤
▪ 加钢圈 ▪ 滴加抗生素溶液
培养
▪ 温度：一般为 36~37℃
▪ 对复方制剂产品的检验，微生物检定法选 择性差，效价测定受其他成分的影响。
▪ 如：妥布霉素滴眼液，配方中含苯扎溴胺 作为防腐剂，苯扎溴胺具有抑菌作用，使 样品的抑菌圈增大，导致标准品和样品的 剂量反应曲线偏离，无法测准妥布霉素的 含量。
抗生素微生物检定法分类
▪ 1.稀释法 ▪ 2.浊度法 ▪ 3.琼脂扩散法（管碟法和打孔法） ▪ 2010版药典采用管碟法和浊度法来测定抗
测定不同浓度的抗生 素溶液在固体培养基 表面产生的抑菌圈的 大小
目的 抗生素最低抑菌浓 抗生素抑菌效力的测定 度（MIC）的测定
应用 用于新药研制及临 抗生素效力的测定方法 床药敏试验等方面
抗生素微生物检定法 包括管碟法和浊度法
▪ 管碟法：利用抗生素在摊布特定试验菌的 固体培养基内成球面形扩散，形成含一定 浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖 而呈现出透明的抑菌圈。根据抗生素在一 定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径 （面积）呈直线关系而设计，通过检测抗 生素对微生物的抑制作用，比较标准品与 供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品 的效价。
会影响抗生素效价的测定
管碟法
▪ 利用抗生素在固体培 养基中的平面扩散作 用，依据量反应平行 原理并采用交叉实验 设计方法。在相同的 试验条件下通过比较 标准品（已知效价） 和供试品两者对所接 种试验菌产生的抑菌 圈（直径或面积）的 大小来测定供试品效 价的一种方法
抗生素微生物检定法PPT课件
结果计算及判断
结果计算及判断
▪ 抑菌圈的测量以及结 果的可靠性检验及效 价测定
多功能微生物自动测量分析仪
结果可靠性分析
▪ 试品间（F1）：供试品的估计效价是 否合适。P＞0.05
▪ 回归（F2）：剂量反应关系是否成立。 P＜0.01
▪ 偏离平行（F3）：量反应直线的斜率 是否有显著差异。P＞0.05
▪ 对复方制剂产品的检验，微生物检定法选 择性差，效价测定受其他成分的影响。
▪ 如：妥布霉素滴眼液，配方中含苯扎溴胺 作为防腐剂，苯扎溴胺具有抑菌作用，使 样品的抑菌圈增大，导致标准品和样品的 剂量反应曲线偏离，无法测准妥布霉素的 含量。
抗生素微生物检定法分类
▪ 1.稀释法 ▪ 2.浊度法 ▪ 3.琼脂扩散法（管碟法和打孔法） ▪ 2010版药典采用管碟法和浊度法来测定抗
结果 ▪ 易于操作，比浊仪在线培养和测定，具有
客观、精密便于自动化操作的优点 ▪ 采用液体培养基，无扩散因素的影响，试
验的灵敏度高，结果的精密度和正确度都 较扩散法好
浊度法
▪ 缺点： ▪ 对试验仪器的性能及试验器具的要求较高，
如培养温度要求一致，比色管的清洁等 ▪ 任何影响液体培养基内微生物生长的因素都
抗生素药品的特点
▪ 纯度一般较化学药品低 ▪ 发酵类产品通常为多组分且活性组分易发
生变异 ▪ 稳定性一般较化学药品差 ▪ 结构较一般化学药品复杂
抗生素检测技术与方法
▪ 高效液相色谱法 ▪ 高效毛细管电泳法 ▪ 气相色谱法 ▪ 高分子杂质测定法 ▪ 抗生素微生物检定法 ▪ 溶出度 ▪ 不溶性微粒 ▪ 澄清度 ▪ 溶液颜色
试验准备
底层的制
备
供试品、标准品溶液的制备
抗生素微生物检定法测定酒石酸泰万菌素及其预混剂中泰万菌素的含量
抗生素微生物检定法测定酒石酸泰万菌素及其预混剂中泰万菌素的含量抗生素微生物检定法测定酒石酸泰万菌素及其预混剂中泰万菌素的含量摘要：本文通过抗生素微生物检定法，对酒石酸泰万菌素及其预混剂中泰万菌素的含量进行测定。
首先，本研究设计了样品制备方法，并建立了泰万菌素的菌种灭活曲线。
随后，利用导数法、正交设计及检定法等进行泰万菌素的含量测定，研究结果表明该方法准确可靠，适用于酒石酸泰万菌素及其预混剂中泰万菌素含量的测定。
1. 引言抗生素微生物检定法作为一种常用的检测方法，被广泛用于生物制药领域。
而泰万菌素作为其中一种抗生素，其含量测定一直是相关研究的重点。
本文旨在通过抗生素微生物检定法，准确测定酒石酸泰万菌素及其预混剂中泰万菌素的含量。
2. 实验设计与方法2.1 样品制备首先，将酒石酸泰万菌素及其预混剂中泰万菌素进行分离纯化，得到待测物样品。
随后，根据相关规定，精确称取一定重量的样品，并加入适量的溶剂，制备待测液体。
2.2 菌种灭活本研究选取泰万菌素敏感菌株XX为试验菌种，制备菌种悬浮液，并用一定浓度的待测液体进行菌种灭活，分别将变色平板培养基灌入相关培养皿中，并将待测液体逐渐滴入，观察灌装数量与变色程度的关系，制备菌种灭活曲线。
2.3 导数法检定根据变色平板培养基的颜色变化情况，逐层观察变色程度，并记录菌落数量。
通过导数法计算出菌种灭活曲线的斜率以及泰万菌素的含量。
2.4 正交设计检定选择三个因素（药物浓度、培养时间、接种菌量）进行正交设计，并按照设计方案进行操作。
通过菌种生长情况及菌落数量的变化结果，使用正交设计方法分析泰万菌素的含量。
3. 结果与讨论3.1 菌种灭活曲线通过菌种灭活实验得到菌种灭活曲线，观察发现随着待测液体浓度的增加，菌落数量呈现下降趋势；当待测液体浓度增加到一定程度时，菌落数量趋于稳定。
据此，菌种灭活曲线可以作为测定泰万菌素含量的依据。
3.2 导数法检定通过导数法计算得到的泰万菌素含量与理论值较为接近，说明导数法检定方法准确可靠。
微生物在药学中的应用幻灯片
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抗生素〔antibiotics〕
原始含义：由微生物产生的、能抑制其它微生物生长 的物质。
现指：生物〔包括微生物、植物和动物〕在其生命活 动过程中产生的〔或由其它方法获得的〕、能在卑 微浓度下有选择性地抑制或影响它种生物机能的有 机物质。
4 、发酵
〔1〕接种量10% 左右，周期4-5天；
〔2〕培养基—糖类，淀粉，花生饼粉，黄豆饼 粉，玉米浆，蛋白胨；
〔3〕补料工艺—延长抗生素分泌期，增加产量；
〔4〕前体—如Pen发酵的前体为苯乙酸或苯乙 胺等；
〔7〕通气搅拌： 机械搅拌 ；挡板防涡流 〔8〕消泡沫： 玉米油、豆油、泡敌—聚氧乙烯氧丙烯甘油
一、抗生素的效价单位 效价〔potency〕——在同一条件下比较抗生素检品和
标准品的抗菌活性，从而得出检品的效价。
单位〔unit,u〕是衡量抗生素有效成分的具体尺度。
效价＝
×100％
抗生素效价
效价 =
检品的抗菌活性 100%
标准品的抗菌活性
检品的实际单位数
=
100%
检品的标示量
抗生素效价单位
重量单位〔生物活性局部重量〕：1µg ≌ 1U
0.01-0.02% 〔9〕消毒灭菌，防止杂菌污染
菌种、空气、培养基、管道设备、防噬菌体。 〔10〕放罐时间： 菌丝浓度、形态、残糖、氨基氮、pO2 、
pH、效价。 5 、发酵液的预处理 〔1〕发酵液中含Ca 2+ 、 Mg 2+ 、 Fe 3+ 、Protein等杂质； 〔2〕Ca 2+ + 草酸 → 草酸钙↓〔还可促进蛋白质沉淀〕 〔3〕磷酸盐除Mg 2+ 〔4〕黄血盐除Fe 3+ 〔5〕ZnSO4与黄血盐形成复盐吸附蛋白质 〔6〕过滤
抗生素的测定
抗生素效价的生物测定一、目的要求学习了解抗生素效价的生物测定（管碟法）的基本原理和方法。
二、基本原理某些微生物在代谢过程中所产生的次级代谢产物能在低浓度的情况下抑制或杀死某些微生物，这种物质称为抗生素。
抗生素效价的生物测定有稀释法、比浊法、扩散法三大类。
管碟法是扩散法中的一种，本法是利用抗生素在琼脂培养基的扩散渗透作用，将已知浓度的标准溶液与未知浓度的样品溶液在含有敏感性试验菌的琼脂表面进行扩散渗透，比较两者对被试菌的抑菌作用，求出抑菌圈的大小，以测定抗生素的浓度。
在一定范围内，浓度与抑菌圈直径在双周半对数表上（浓度为对数值，抑菌圈直径为数字值）成直线函数的关系，由此绘制成标准曲线，从样品的抑菌圈大小可在标准曲线上求得其效价。
由于本法是利用抗生素抑制敏感细菌的特点，所以符合临床使用的实际情况，而且灵敏度也很高，不需特殊设备，故一般实验室及生产上多采用此法。
但此法也有缺点，即操作步骤多，手续繁杂，培养时间长、得出结果慢。
尽管如此，由于它有上述的独特优点而被世界各国所公认，成为国际通用的方法被列入各国药典法规的范围内。
本实验以龟裂链霉菌（Streptomyces rimosus）产生的土霉素效价测定为例。
三、器材黄色八叠球菌（Sarcina flava）；（土霉素效价测定用）培养基，（供培养试验菌用）培养基Ⅰ，（供摊布双碟的上、下层用）培养基Ⅱ；培养皿，牛津杯（或不锈小钢管），陶瓦圆盖，50ml、250ml、1000ml容量瓶， 0．1mol/LHCl，土霉素标准品等。
四、操作步骤1．pH6．0磷酸缓冲液的配制准确称取KH2PO40．8g和K2HPO40．2g，置100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，灭菌备用。
2．标准土霉素溶液的配制精确称取20mg土霉素标准品，每毫克含880单位（880r/mg），先用0．1mol/LHCl溶解（按称量每10mg加酸1ml），然后加入无菌蒸馏水稀释成每毫升含1000单位（1000r/ml）的溶液，此液在5℃以下保存。
链霉素PPT课件
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12
β-内酰胺类抗生素结构
O
H
H
R
N H
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
6
5S 1 2
CH3
7 N4 3
CH3
O
H
COOH
O H
R
N7
H
H S
61 2
8
5
3
N4
O
CH2R1
ROCHN O
COOH
S CH3 CH3
N (Z) COOH
COOH
6-APA
青霉素族（PC）
7-ACA
头孢菌素族（CEP）
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13
β-内酰胺类抗生素结构示例：
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3
㈡ 检查（Investigation）
1、影响产品稳定性的指标 ——结晶性、水份、酸碱度等
2、有机和无机杂质检查——澄清度与颜色、有关物质、 重金属等
3、与临床安全性密切相关的指标 ——异常毒性、热原、 降压物质等
4、其他检查——“悬浮时间与抽针试验”、其他共存组 分
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4
㈢ 含量测定或效价测定(Potency) Determination
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35
3）异构体：
相对保留时间 2-r-1标2 1准=-物-t被t RR测12 物
异构体 相对保留时间 判断
B异构体 0.85 A异构体 1.0
供试液谱图中A异构体的峰面积 与A、B异构体峰面积和之比应为0.48~0.55。
异构体 B
头孢呋辛
异构体 A
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36
示例2：头孢氨苄中有关物质的检查-反相TLC法 固定相：活化后的硅胶G板置5%（V/V）正十四烷的正己烷
酰胺
V - COOH 1600 、1410 cm -1 羧基
抗生素生物效价测定(详细参考)
实验一抗生素生物效价测定【实验目的】1. 掌握抗生素生物效价测定的原理和方法；2. 掌握管碟法测定抗生素生物效价相关的操作方法。
【实验原理】抗生素的效价常采用微生物学方法测定，它是利用抗生素对特定的微生物具有抗菌活性的原理来测定抗生素效价的方法，如管碟法。
管碟法是目前抗生素效价测定的国际通用方法，我国药典也采用此法。
管碟法是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用，比较标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测定供试品的效价。
管碟法的基本原理是在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管（内径6.0±0.l mm，外径8.0±0.l mm，高10±0. lmm），管内放人标准品和检品的溶液，经16~18小时恒温培养，当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。
因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的无菌生长的区域，常呈圆形，称为抑菌圈。
根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系，比较抗生素标准品与检品的抑菌圈大小，可计算出抗生素的效价。
常用的管碟法有：一剂量法、二剂量法、三剂量法。
后二法已经列入药典。
二剂量法系将抗生素标准品和供试品各稀释成一定浓度比例（2:1或4:1）的两种溶液，在同一平板上比较其抗药活性，再根据抗生素浓度对数和抑菌圈直径成直线关系的原理来计算供试品效价。
取含菌层的双层平板培养基，每个平板表面放置4个小钢管，管内分别放入供试品高、低剂量和标准品高、低剂量溶液。
先测量出四点的抑菌圈直径，按下列公式计算出检品的效价。
（1）求出W和V：W=（SH+UH）-（SL+UL）(式 2.10-1)V=（UH+UL）-（SH+SL）(式2.10-2)式中：UH：供试品高剂量之抑菌圈直径；UL：供试品低剂量之抑菌圈直径；SH：标准品高剂量之抑菌圈直径；SL：标准品低剂量之抑菌圈直径；（2）求出θ：θ=D·antilog（IV/W）(式2.10-3)式中：θ：供试品和标准品的效价比；D：标准品高剂量与供试品高剂量之比，一般为1；I：高低剂量之比的对数，即log2或log4。
抗生素微生物测定法
4．放置钢管 用钢管放置器，将干热灭菌的镊子或适 宜方法将钢管装于玻璃管中，放于钢管放置器上，将双碟 打开，放入双碟台上，托起双碟台，使钢管平稳落在培养 基上，注意使各个钢管下落的高度基本一致，钢管放妥后， 双碟静置5～10 min,使钢管在琼脂内稍下稳定后，再开始 加抗生素溶液。 5．滴加抗生素溶液 每批供试品取6~10个双碟，滴加 溶液可调式移液器，在滴加之前须用滴加液洗2~3次。滴 加溶液的顺序:SH→TH→SL→TL。滴加溶液至钢管口平满， 注意滴加溶液间隔不可过长，因溶液的扩散时间不同影响 测定结果。
仪器与用具 1. 操作室 2. 双碟 3. 陶瓦盖 4. 钢管 5. 钢管放置器（图4－6） 6. 恒温培养箱 7. 灭菌刻度吸管 8. 玻璃容器 9. 称量瓶
图：钢管放置器（北京先驱 威锋技术开发公司生产开发）
10.可调式移液器（1～1000μ l) 11.天平 分析天平，感量0.1mg。 12.抑菌圈(直径)测量仪。 13.超净工作台 用于菌种的接种或传代。超净工作台须置洁净 工作室或半无菌室内。
3． 双碟的制备 在半无菌室内进行，应注意微生物 及抗生素的污染，培养基应在水浴中或微波炉中融化，避 免直火加热。
底层：用灭菌大口吸管（20ml）或其他灭菌分装器，吸 取已融化的培养基20ml注入双碟内，等凝固后更换干燥的 陶瓦盖，放于35～37℃培养箱中保温，使易于摊布菌层。
菌层:取出试验用菌悬液，按已试验妥的菌量[按(2.2) 法标准品溶液的高浓度所致的抑菌圈直径在18～24mm；用 灭菌吸管吸取菌悬液加入已融化并保温在水中(一般细菌 48～50℃，芽孢可至60℃)的培养基内，摇匀作为菌层用。 用灭菌大口10ml吸管或其他分装器，吸取菌层培养基5ml， 使均匀摊布在底层培养基上，置水平台上并用陶瓦圆盖覆 盖，放置20 ～ 30min，待凝固，备用。
抗生素效价测定技术—抗生素效价微生物检定法
知识点3：浊度法
四、检定操作方法
（一）线性试验
除另有规定外，取适宜的大小厚度均匀的已灭菌试管，在各试验
管内精密加入含试验菌的液体培养基9. 0ml，再分别精密加入各浓
度的标准品溶液1.0ml，立即混匀，按随机区组分配将各管在规定
条件下培养至适宜测量的浊度值（通常约为4小时）。
知识点3：浊度法
（三）空白试验
线关系，可采用t检验。
4．测定结果的计算及可信限率估计。
5．实验计算所得效价低于估计效价的90%或高于估计效价的1 10%，则检验
结果仅作为初试，应调整供试品估计效价，予以重试。
知识点3：浊度法
6．原料药效价测定一般需双份样品，平行实验以便核对。对不符
合规定的样品应至少有2次符合规定的结果，才能发出报告。
供试品低剂量溶液
（即SH→TH→SL→TL）
6.测量抑菌圈 双碟透明度好，无破损和不透明现象；抑菌圈应圆满，无破
圈或圈不完整现象，否则应弃去该双碟。
技能点1：二剂量法操作规程
技能点1：二剂量法操作规程
技能点1：二剂量法操作规程
在恒温培养箱中培养至规定时间
技能点1：二剂量法操作规程
• 测量抑制圈
的污染，放双碟的台面应用水平仪调水平。
玻璃/塑料
平皿(d=90mm
h=16-17mm)
菌层
5ml
含菌培养基
底层
20ml
灭菌培养基
技能点1：二剂量法操作规程
制备底层
制备菌层
技能点1：二剂量法操作规程
4.放置钢管
5.滴碟、培养
毛细滴管（或滴管）滴碟
滴加顺序：按标准品高剂量溶液→供试品高剂量溶液→标准品低剂量溶液→
抗生素微生物检定法
抗生素微生物检定法抗生素微生物检定法本法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。
抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。
测定结果经计算所得的效价，如低于估计效价的90%或高于估计效价的11 0%时，应调整其估计效价，重新试验。
除另有规定外，本法的可信限率不得大于5%。
第一法：管碟法本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。
菌悬液的制备枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）悬液：取枯草芽孢杆菌［CMCC（B）63501］的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在35～37℃培养7日，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上。
用灭菌水将芽孢洗下，在65℃加热30分钟，备用。
短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）悬液：取短小芽孢杆菌［CMCC（B）63202］的营养琼脂斜面培养物，照上述方法制备。
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）悬液：取金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。
临用时，用灭菌水或0.9%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
藤黄微球菌（Micrococcus luteus）悬液：取藤黄微球菌［CMCC（B）28001］的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在26～27℃培养24小时，或采用适当方法制备的菌斜面，用培养基Ⅲ或0.9%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
大肠埃希菌（Escherichia coli）悬液：取大肠埃菌［CMCC（B）44103］的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。
临用时，用灭菌水将菌苔洗下，备用。
啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）悬液：取啤酒酵母菌（ATCC 9763）的V号培养基琼脂斜面培养物，接种于Ⅳ号培养基琼脂斜面上。