等电聚焦电泳的两种方法

等电聚焦电泳（IEF）分离蛋白及测定蛋白质等电点

等电点聚焦（IEF ）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，等电聚焦是在稳定的pH 梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极间逐步建立稳定的pH 梯度，当蛋白质分子或其他两性分子存在于这样的pH 梯度中时，这种

分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终达到一个使其表面静电荷为0 的区带，这时的pH 则是该分子的pI ，聚焦在等电点的分子也会不断扩散，一旦偏离其等电点后，由于pH 环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI 迁移。因此，这些分子总会是处于不断扩散和抗扩散的平衡中，在pI 处得以“聚焦”.

二、仪器与试剂1．材料：蛋白样品2．试剂：聚丙烯酰胺、甲乙聚丙烯酰胺、两性电解质、尿素、

NP-40、teiton-100

电极液：1M 磷酸（阳极液）、1M 氢氧化钠（阴极液）

固定液：100g三氯乙酸、10g磺基水杨酸溶于500ml，定容为1000ml

染色液：0.35g考马斯亮蓝R—150溶于300ml脱色液中，加热到60 - 70C,加入0.3g硫酸铜。

脱色液：25％乙醇、8％冰乙酸溶于水

样品缓冲液:1％Ampholine 、2％Triton X-100 、9M 尿素

三、操作步骤：

1, 样品制备：用IEF 样品缓冲液提取待分析样品，如其他缓冲液提取的样品则应透析后，冷冻干燥、再复溶于IEF 样品缓冲液。充分溶解后，离心去除不溶杂质。

2, 制模具：

洗干净两块IEF 专用玻璃板，进行硅化和反硅化处理，两块玻璃板的硅化和反硅化面相对，放上夹条，夹子夹好。

3, 配胶：

胶液组成：6ml 胶母液（10％，19/1）

6—8 ％尿素

1ml Ampholine （pH3.5-10）

60-80ul 10%AP

5 ul TEMED

4, 灌胶：配好的胶迅速灌入模具

5, 电泳：

等胶凝固后，小心揭去上下玻璃板，将塑料垫片底部擦干，小心放于电泳槽上。在胶面两边各放一根浸透电极缓冲液的电极条。在胶面上任意位置上放上小擦镜纸片，在纸片上加样，盖上盖子，横功率25W电泳，约10min后，暂停电泳，取下纸片，继续电泳约30min，待电流达4mA 以下，停止电泳。

6, 表面电极测定蛋白质的pI

7, 固定：取出塑料片，放入固定液中15min

8, 染色：取出塑料片放入染色液中65C染色，直至条带出现

9, 可脱色至背景消除后干燥保存。

四、结果（略）五、注意事项

1、两性电解质是等电聚焦的关键试剂，它的含量2% -3 %较合适，能形成较好的pH梯度。

2、丙烯酰胺最好是经过重结晶的。

3、过硫酸铵一定要新配置。

4、所有水用重蒸水。

5、样品必须无离子，否则电泳时样品带可能走歪，拖带或根本不成带。

6、平板等电聚焦电泳的胶很薄，当电流稳定在8mA，电压上升到550V以上，由于阴极飘移，造成局部电流过大，胶承受不了而被烧断。

原理】

蛋白质（酶）、多肽等两性电解质，其所带电荷的数量与性质，随所处环境的pH 而变化。环境pH 低于其等电点时，带正电荷，在电场中向阴极移动；环境pH 高于其等电点时，带负电荷，在电场中向阳极移动；环境pH 等于其等电点时，不带电荷，在电场中不移动。据此，在电泳系统中创造一个由阳极向阴极，pH 由低到高的连续而稳定pH 梯度环境，那么处在这种系统中具有不同等电点的各种蛋白质，将根据所处环境的pH 与其自

身等电点的差异，分别带上正电荷或负电荷，并向与它们各自的等电点相当的pH 环境位

置处移动，当到达该位置时即停止移动，从而各自焦聚（聚焦），分别形成一条集中的蛋白质区带。这种根据蛋白质等电点的不同而将它们分开的电泳方法称为等电聚焦电泳。电泳后测定其各种蛋白质“ 聚焦”部位的pH ，即可得知它们的等电点。在等电聚焦电泳中，造成环境由酸至碱逐步变化所用的物质是一类两性电解质。它具有依次

递变但相差不大的等电点（PI ），在电场中可以形成逐渐递变而又连续的pH 梯度。此类物质在等电点处具有足够的缓冲能力，以保证不致受蛋白质样品等两性物质对pH 梯度的

影响；在等电点处还具有足够高的电导，保证电流通过，而且整个体系的电导均匀，使样品迁移不受影响，达到聚焦；这类物质还具有不与分离物质反应或使之变性，自身化学性质不同于被分离物质，分子量也小，当电泳后经透析等可与被分离物质分开。为防止电泳过程中，因为对流现象使已经聚焦的蛋白质区带再混合，需要一种能抗对流的介质作为电泳支持物。目前常用的有蔗糖、甘油或乙二醇形成的密度梯度。用琼脂糖、聚丙烯酰胺形成的凝胶及利用亲水惰性颗粒，如葡聚糖凝胶、淀粉、滤纸等为支持剂，以凝胶作为支持物的称为凝胶聚焦电泳，这种方法适用于分析分离。其他支持剂适用于制备。【试剂与器材】

1. 两性电解质Ampholine ，pH3~10 ，浓度40 ％。

2. 丙烯酰胺（Acr ）溶液：Acr 30g ，甲叉双丙烯酰胺（Bis ）l.0 g ，蒸馏水溶解后定容至

100ml ，过滤，4 o C 保存。

3. TEMED

4. l0 ％AP 溶液：临用时配制。

5. 正极缓冲液：0.2 ％（V/V ）硫酸或磷酸。

6. 负极缓冲浪：0.5 ％（V/V ）乙二胺水溶液。

7. 固定液：10% （W/V ）三氯乙酸。

8. 染色液：考马斯亮蓝R 250 2.0 g 以50 ％甲醇1000ml 溶解。使用时取93ml ，加入7.0 ml 冰醋酸，摇匀即可使用。

9. 脱色液：按5 份甲醇、5 份水和1 份冰醋酸混合即可。

10. IgG ：制成10mg/ml 的水溶液。

11. 电泳仪：100InA ，600V 。

12. 垂直平板电泳槽

【操作步骤】

1. 凝胶制备：按下表配制7 ．5 ％凝胶。吸取丙烯酰胺凝胶，AP 和水于50ml 的小烧杯中混匀，在真空干燥器中抽气10min （本实验将此步省略，并不影响实验结果）。然后加入0.3ml Ampholine 、0.lml IgG 待测样品和0.lml TEMED 溶液，混匀后立即制胶（方法同SDS －PAGE 电泳），胶液加至距离顶部5mm 处，在胶面上覆盖3mm 厚的水，应注意不要让水破坏胶的表面，室温下放置20~30min 即可聚合；

为观察聚焦状况，可在样品中加入聚焦指示剂，如带红颜色的肌红蛋白（PI = 6.7 ）、细

胞色素 C （PI = 10.25 ）或甲基红染料（PI = 3.75 ）,以示聚焦的进展情况；

2. 电泳：吸去凝胶表面上的水层，于电泳槽正极缓冲液加入0 ．2 ％的硫酸（或磷酸），