等电聚焦电泳的两种方法
IEF-PAGE聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳法
【实验目的】1.掌握聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦的基本原理2.学习用等电聚焦电泳测定蛋白质等电点的操作和方法【实验原理】等电聚焦法是一种特殊的聚丙烯酰胺凝胶电泳法。
它的特点是在凝胶柱中加入两性电解质载体-Ampholine，从而使凝胶柱上产生pH梯度。
当向两性载体凝胶施加电场时，即可形成pH梯度，pH梯度的顺序是从阳极到阴极pH值逐渐增大。
蛋白质为两性电解质，其所带电荷的性质和数量随所处环境的pH而变化。
当蛋白质在等电聚焦凝胶柱中进行电泳时，带电荷的蛋白质离子即在凝胶柱上泳动：带负电荷的蛋白质分子向阳极移动，带正电荷的蛋白质分子向阴极移动。
当蛋白质样品泳动到凝胶的某一部位，这一部位的pH值正好相当于该蛋白质的等电点时，蛋白质的净电荷为零不再移动，则聚焦形成一条蛋白质区带。
这种按等电点的大小在pH梯度某一相应位置进行聚焦的方法称为等电聚焦。
利用这种方法，在蛋白质聚焦的相应位置测定凝胶的pH值，就可得知该蛋白质的等电点。
【实验材料】1.实验器材小玻璃管：内径0.5cm，长10cm 2支；小玻管架；圆盘电泳槽；注射器和长针头；移液管；pH计2.实验试剂(1) 两性电解质载体凝胶：丙烯酰胺3.5g，N-甲叉双丙烯酰胺0.1g，pH3～10的Ampholine 2.5ml，核黄素溶液（4mg/100ml）12.5ml，加水至50ml。
(2) 蛋白质溶液：纯牛血清白蛋白7mg，溶于1ml蒸馏水。
此蛋白溶液应无盐离子。
(3) 5%磷酸溶液(4) 2%氢氧化钠溶液(5) 考马斯亮蓝R-250染色液：称取考马斯亮蓝R-250 0.25g，加入50%甲醇91ml和冰醋酸9ml。
(6) 40%蔗糖溶液(7) 12%三氯醋酸溶液(8) 脱色液乙醇：冰醋酸：蒸馏水=25：10：65（v/v）。
【实验操作】1. 取4ml两性电解质载体凝胶，置于抽气瓶中，加入0.07ml蛋白质溶液，轻轻摇动混匀，抽去气泡。
2. 取干净的小玻璃管2支，垂直放置，底端塞以橡皮塞，加入40%蔗糖溶液3～4滴，然后吸取抽气瓶中的两性电解质载体-蛋白质混合液1.8ml缓缓放入玻璃管中，加入胶液后立即用注射器加上一薄层水（3～5 mm高），使混合液表面与空气隔绝。
等电聚焦电泳
在电场下利用不同pH值缓冲溶液相互扩散，在混合区间 形成pH梯度，称人工pH梯度。但这种pH梯度易受缓冲溶 液离子的迁移和扩散而变动，重复性差，已不被采用。 利用温度梯度建立pH梯度。因为温度可以影响缓冲液的 解离度，从而使pH值改变。由于每差别一个pH单位温度 约50℃，故这种方法只能建立范围很窄的pH梯度，而且 不易稳定。
如果在电泳系统中建立一个由阳极至阴极，pH由 低到高（即环境由酸到碱）的连续而稳定的pH梯度， 则处于一个系统的各种蛋白质分子，将根据各自的pI 值与所处位点的PH值的差别带上正电或负电。
IEF的分类
载体两性电解质pH梯度(carrier ampholyte pH gradient) 等电聚焦，即在电场中通过两性缓冲离子建立pH梯度。 固相pH梯度(immobilized pH gradients,IPG)等电聚焦，是 利用一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物滴定时， 在滴定终点附近形成pH梯度并参与丙烯酰胺的共价聚合， 形成固定的、不随环境电场条件变化的pH梯度，分辨率 可达0.001pH。 载体两性电解质/固相pH梯度混合技术，即在固相pH梯度 凝胶中加入载体两性电解质作为添加剂，被称为“杂交等 电聚焦”。 固相pH梯度等电聚焦与载体两性电解质等电聚焦的 区别在于前者不是两性分子，在凝胶聚合时便形成pH梯 度.后者是两性分子，在电场中两性分子迁移到自己的等 电点而形成pH梯度。
加入附加物质建立pH梯度。通过把一些有机溶剂如乙醇、 甘油等加到缓冲液中，利用附加物的介电常数的变化，改 变了缓冲液一些组分的解离常数，可以形成1.5pH单位的 pH梯度。如在硼酸盐溶液中加0~5%甘油和0~3%蔗糖， 可以形成pH为7~8.6范围的梯度，可分离血红蛋白。 在电极间放入含多种不同等电点电解质的溶液，通电后在 电极间便会形成pH梯度。这些两性电解质大多是一些多 胺基多羧酸化合物。为了防止对流对pH梯度的干扰，可 以采用加入不同浓度的中性或惰性物质形成密度梯度的方 法，也可以采用在电极间加入凝胶的方法。
等电聚焦电泳
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等电聚焦电泳的应用
IEF是一种简便、快速、高效的分离分析方法，
特别适用于氨基酸、多肽、蛋白质、酶类和抗体等 的分离分析，能够满足组分定量、杂质检出、质量 控制、临床诊断等方面的要求。目前等电聚焦电泳
主要用于两性电解质样品等电点的测定,两性电解质 样品的分析、分离和制备，在同功酶的鉴定及蛋 白质的微量分析(10~50μg)上应用尤为广泛。随着 生命科学的发展，特别是人类基因组计划(HGP)全 面完成之后所谓“后基因组”时代的来临，对复 杂生命体系的准确表征和分析就显得日益紧迫， 其中蛋白质组研究是一个极其重要的部分。
白质上专一结合（以共价键等强作用力结合，一定程度上依
赖于蛋白质的构象)的金属在电场作用下的丢失，这部分 金属大多构成蛋白质的活性中心或结构中心，比非专 一结合金属具有更重要的生物学意义。 ➢ 在样品分离方面，载体两性电解质pH梯度的重现性仍然是 难以解决的问题。选用固态pH梯度可以提高分辨率， 加大上样量，受到样品中盐的干扰小，无边缘效应， 并有很好的重现性，这对建立微量元素种态分布数据 库这样的工作是必需的．
渐消失则称为阳极漂移。
为了阐明IEF中pH值梯度不稳定的机制，出现了各种假说： 载体两性电解质向阴、阳极的等速电泳（ITP）迁移； 在阴极因CO2的吸附而引起阴极液组分和浓度的变化； 在pH梯度的中性区域生成一段纯水，水的IEF导致水在电泳管中的
聚集并向两端反流； 不同等电点载体两性电解质的选择性缺陷而引起的不稳定； 两性电解质带电配体的进行性地结合或分离引起的不稳定； 载体两性电解质相互反应的存在而引起的不稳定性；
➢ 分辨率高。等电聚焦电泳属于非变性蛋白质分离分析技术，
等电聚焦电泳方法
等电聚焦电泳方法
等电聚焦电泳方法（Isoelectric focusing，IEF）是一种高效的分离蛋白质的方法，它基于蛋白质在特定pH 值下的等电点电荷状态差异进行分离。
该方法可用于分离电荷异构体、突变体、异构蛋白质和翻译后修饰的蛋白质。
IEF 方法需要一个pH 梯度凝胶，通常使用聚丙烯酰胺凝胶。
样品被加到凝胶的一侧，然后用电场沿pH 梯度进行电泳。
当蛋白质移动到与其等效的pH 值处时，电荷变为中性，停止运动。
这种分离方法可以在同一凝胶中完成多个样品的分离，并且它可以与其他分离方法例如SDS-PAGE 结合使用，从而实现更高的分辨率。
IEF 方法已被广泛应用于生命科学中的蛋白质研究和分析，例如生物医学、生物化学和分子生物学等领域。
《中国药典》2020版— 等电聚焦电泳法
0541电泳法
第六法等电聚焦电泳法
等电聚焦（ISOELECTRIC FOCUSING，IEF）电泳法是两性电解质在电泳场中形成一个 pH 梯度，由于蛋白质为两性化合物，其所带的电荷与介质的 pH 值有关，带电的蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移，当到达其等电点(此处的 pH 值使相应的蛋白质不再带电荷)时，电流达到最小，不再移动，从而达到检测蛋白质和多肽类供试品等电点的电泳方法。
本法用于蛋白质的定性鉴别、等电点测定、限度检查以及定量测定。
方法 1：垂直板电泳法
除各论中另有规定外，按以下方法测定。
1.仪器装置
恒压或恒流电源、带有冷却装置的垂直板电泳槽和制胶模具。
2.试剂
(1)水(电阻率不低于 18.2MΩ•cm)。
(2)A 液称取丙烯酰胺29.1g、亚甲基双丙烯酰胺0.9g，加适量水溶解，并稀释至 100ml，双层滤纸滤过，避光保存。
(3)B 液10%过硫酸铵溶液，临用前配制。
(4)供试品缓冲液(4 倍浓度) 取甘油8ml、40%两性电解质(pH3〜10)溶
1。
实验操作指导书：等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点
实验三等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点一、实验目的了解等电聚焦的原理。
通过蛋白质等电点的测定，掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直管式等电聚焦电泳技术。
二、实验原理等电聚焦（Isoelectric focusing，简称IEF）是六十年代中期出现的新技术。
近年来等电聚焦技术有了新的进展，已迅速发展成为一门成熟的近代生化实验技术。
目前等电聚焦技术已可以分辨等电点（pI）只差0.001pH单位的生物分子。
由于其分辨力高，重复性好，样品容量大，操作简便迅速，在生物化学、分子生物学及临床医学研究中得到广泛的应用。
蛋白质分子是典型的两性电解质分子。
它在大于其等电点的pH环境中解离成带负电荷的阴离子，向电场的正极泳动，在小于其等电点的pH环境中解离成带正由荷的阳离子，向电场的负极泳动。
这种泳动只有在等于其等电点的pH环境中，即蛋白质所带的净电荷为零时才能停止。
如果在一个有pH梯度的环境中，对各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，则在电场作用下，不管这些蛋白质分子的原始分布如何，各种蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度中相对应的位置处进行聚焦，经过一定时间的电泳以后，不同等电点的蛋白质分子便分别聚焦于不同的位置。
这种按等电点的大小，生物分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为就称为“等电聚焦”。
等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度，使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦，从而达到分离、测定和鉴定的目的。
两性电解质载体，实际上是许多异构和同系物的混合物，它们是一系列多羧基多氨基脂肪族化合物，分子量在300~1000之间。
常用的进口两性电解质为瑞典Pharmacia-LKB公司生产的Ampholine 和Pharmalyte，价格昂贵。
国产的有中国军事医学科学院放射医学研究所和上海生化所生产的两性电解质，价格便宜，质量尚佳。
两性184电解质在直流电场的作用下，能形成一个从正极到负极的pH值逐渐升高的平滑连续的pH梯度。
等电聚焦电泳【共54张PPT】
蛋白质分子的电聚焦过程
+
+
pH=pI
-
—
a
b
pI1 pI2 pI3
pIn
c
a. 蛋白质分子在负极端 b. 蛋白质分子在正极端
c. 蛋白质样品中各组分聚焦成区带
在这个从正极到负极pH逐渐增加的 直流电场中，当蛋白质进入这个环境， 不同的蛋白质带上不同性质和数量的电 荷，向着一定方向移动，迁移到与其相 同的等电点位置上停留下来，即被聚焦 于一个狭的区带中 ，得以分离。
进行IEFE必须具备3个条件：
①有一个在电泳条件下基本稳定、重复 性良好的pH梯度
②有一个抗对流的电泳材料，使已经分 离的样品不再重新混合
③电泳后有适当的方法来鉴定分离的区 带
（一）pH梯度的建立
用多种两性电解质混合物建立稳定 良好的pH梯度
1.理想的载体两性电解质（Carrier ampholytes）应具备的特征：
等电点聚焦的分离容量受下列几个因素影响：
1、聚焦后每一区带的蛋白量取决于密度梯 度所能支持的蛋白质，提高密度可以提 高分离容量；
2、容量与区带高度的平方成正比，降低电 压可使区带变宽，提高容量，但分辨率
降低，聚焦时间长，用窄的pH梯度范围 可以使区带变宽，提高分辨率。 3、分离的容量与柱的横载面成正比，用440 毫克柱时，可加粗蛋白质5克，每一区带 可达一克。
-
a
由于载体两性电解质是一系列不同
分子的两性电解质的混合物所组成的， 设 其 中 某 一 成 分 为 A， 它 的 pI=pH’， 当 环境中的pH>pH’时，它带负电荷，朝正 极移动。(图b)
pH
ApH=pH’
+
-
b
等电聚焦电泳应用
等电聚焦电泳应用
电泳（Electrophoresis）是一种通过对溶液中的悬浮颗粒施加电场，使其在溶液中的分布形成条带状图示的实验技术。
它可以按照颗粒的形状、大小、电荷和空气的特点使其集中并形成不同的条带。
传统的电泳技术包括了静态电泳、动态电泳和聚焦电泳。
一、静态电泳
静态电泳是一种电泳技术，它特别适合对离子族中极为弱度的阴离子进行测定，这些离子可能不能通过动态电泳得到充分分离。
静态电泳通常是在含有多种不同离子族的离子混合物中添加大量离子后，再施加电场来进行分离检测。
二、动态电泳
动态电泳是一种电泳技术，它适用于检测离子族中的各种元素，并可以在参数设定内提供较快的分离速度，可以得到较高的检测灵敏度。
在动态电泳中，所有的离子族会同时被电场作用而运移，大量混合离子将会被分离，从而使得检测更加准确的进行。
三、聚焦电泳
聚焦电泳是一种电泳技术，它可以把平常化学溶剂中的离子族分离出来、测量其中的微量元素以及对溶液进行浓缩。
相较于传统的电泳技
术，聚焦电泳在分离过程中能够更加精确地把混合溶液中的离子族分开，而且分离性也更为优异。
聚焦电泳在医药、生物、石油和分子生物学领域都有广泛的应用。
等电聚焦电泳 介绍
等电聚焦电泳介绍点击次数：315 作者：佚名发表于：2008-08-07 00:00 转载请注明来自丁香园来源：互联网主要仪器试剂仪器：微型电泳系统、电源、注射器、固定和染色用容器试剂：丙稀酰胺、双－丙稀酰胺、载体两性电解质、尿素、过硫酸胺、TEMED、TritonX－100、2－巯基乙醇、溴酚蓝、磷酸、氢氧化钠、氯化钾、三氯乙酸、考马斯亮蓝、甲醇、乙酸。
储存液：1）30%（w/v）丙稀酰胺，1%（w/v）双－丙稀酰胺；2）20%Triton X100；3）10%三氯乙酸；4）1%三氯乙酸；5）1%溴酚蓝；6）考马斯亮蓝染色液；7）考马斯亮蓝脱色液；灌胶以灌制8cm×7cm×0.75mm pH4-6变性等电聚焦凝胶的配方。
其他pH范围等电聚焦可以参考表格来配置。
水：5.4ml；储存液1）：2.0 ml；载体两性电解质溶液pH3.5-10 48μl；载体两性电解质溶液pH4-6 240μl；超纯尿素 6.0 g ；10%过硫酸胺25μl； TEMED：20μl灌胶步骤：1.组装灌胶器；2.将尿素、水、溶液和载体两性电解质溶液混匀，避免剧烈摇动，轻微加热尿素溶解更快（带手套，丙稀酰胺有毒）；3.加入过硫酸胺和TEMED，轻轻混匀（开始聚合，操作要迅速）；4.将上述混匀溶液倒如灌胶器（尽量避免气泡产生）；5.插入梳子，将梳子侵入胶内（不要产生气泡）；6.聚合约1小时；7.聚合完成，小心拔去梳子；8.将凝胶同冷却装置连接后插入电泳池，蛋白样品上样前最好用阳极电极液注入上槽中确定是否有渗漏。
注意：1.上样前冲去上样空底部未聚合的丙稀酰胺，否则电泳过程中会发生聚合；2.现在有商品化的等电聚焦凝胶，但只限于水平平板电泳系统（如Pharmmacia－LKB,Hoefer）.样品制备和上样一般不同厚度的凝胶，不同的梳孔数目会有不同的上样量，例如：0.75mm厚、15孔的凝胶每孔最大上样量大约15μl。
等电聚焦电泳
等电聚焦电泳
电聚焦电泳（Electrophoretic Focusing，EF）是一种用于实现
高灵敏度、高精度分子体系和复杂生物分子分离分析的分子生物技术。
它把目标分子样品流经电泳液体，有效地将它们隔离到不同的位置，
这样就可以根据它们的大小、结构以及分子量等不同而被分开。
相比
具有选择性分离力的磁聚焦，EF分离的结果更快、更准确，可以易于
扩展和实现，并且对于体积小的细胞样品具有较强的灵敏度。
电聚焦电泳的原理是根据移动的电势差分离电荷相同的分子。
当
电荷相同的分子分离时，电荷混合物会电离，电脉冲时会产生一层聚
焦薄膜，把目标分子固定在内部，从而形成一个特定的分子群。
同时，该分子群会以均匀的速度实现空间上的分离。
电聚焦电泳的应用非常广泛，可以用于检测RNA、DNA、蛋白质、小分子微粒及细胞分子。
电聚焦电泳还能用于测定电荷的究竟引起什
么样的分布；测定环境中电荷的分布及分离度；克隆和检测RNA、DNA、蛋白质及小分子微粒等。
同时，电离力学也能够测量空气微粒中非饱
和状态的水汽分布状况以及其对应的稳定性能等。
电聚焦电泳的灵敏度可以加强样品的分离和分析效果。
近年来，
众多研究人员利用电聚焦电泳进行精确的分析和实验，从而推动该技
术的发展。
电聚焦电泳的应用不仅仅可以操作小分子，也可以为更大
分子的实验提供便利。
随着电聚焦电泳在实验领域的不断发展，它在
生物分子分离与分析方面将有着广泛的应用。
等电聚焦电泳的原理及应用
等电聚焦电泳的原理及应用等电聚焦电泳，这个听起来复杂的名词，其实就像是一场精妙的舞会。
想象一下，各种各样的蛋白质、核酸，像小伙伴一样，聚集在一个舞台上，它们各自有自己的特长，有的擅长旋转，有的则能高高跳起，真的是热闹非凡。
好啦，今天就来聊聊这个舞会的规则和乐趣。
等电聚焦电泳，简单说就是利用电场把分子按照它们的等电点来分开。
每种分子在特定的pH值下会带上正负电荷，就像小朋友们在玩捉迷藏。
想象一下，有些小朋友喜欢在阳光下，而有些则喜欢在阴凉的地方玩耍。
这个等电点，就是分子在电泳中的“家”，它们会不遗余力地朝着自己的家奔去。
当电场施加时，分子们就像是在追逐游戏中疯狂奔跑，结果就是它们各自找到了最适合自己的地方，嘿，这可是个精彩的过程哦！说到应用，这个等电聚焦电泳就像一把万用钥匙，能够打开许多实验室的大门。
比如在蛋白质的分离上，它简直是个天才！许多科学家在做生物研究时，常常需要分离出特定的蛋白质。
这就好比你要从一堆水果中挑出苹果，当然得先知道苹果的特征。
而等电聚焦电泳正是通过调节pH值，让每种蛋白质在适合自己的地方聚集，就像是让苹果聚在一起，其他水果都乖乖地站在一旁。
你知道吗？这个方法不仅仅局限于研究蛋白质哦！在医学上，等电聚焦电泳也能派上大用场。
比如说，某些疾病的诊断，医生可以通过分析血液中的特定蛋白质来判断病情。
这就像是在给身体做一次“深度体检”，从中发现潜在的健康问题，简直是一种“未雨绸缪”的智慧。
说到这里，可能有人会问，这个过程会不会很复杂？其实不然，操作起来也算不上是太难。
只需要一些专业的仪器和实验室的环境，像个小化学家一样，轻松搞定。
不过，别忘了，实验中的每一步都得谨慎，哪怕是微小的差错，都可能导致结果大相径庭，就像你在做饭时不小心加错了盐，最后可能让整道菜变得难以下咽。
不过，最让人惊讶的是，这个技术的历史也蛮有意思的。
早在上世纪，科学家们就开始尝试用电泳分离分子，经过不断的摸索，终于找到了这条等电聚焦的路子。
6第三节 等电聚焦(IEF)-生化分析汇总
浓度高的微量样品可直接用微量进样器直接加在胶面上，较稀 样品用几层擦镜纸浸透样品溶液加在胶面上，聚焦一段时间后，去
掉加样滤纸，可减少拖尾现象。
根据等电聚焦的原理，样品在聚焦过程 中电流会越来越小，当到达等电点位置时， 电流为 0 ，此时认为等电聚焦完成。在实际 电泳中，当凝胶的电流已达到最小值，不再 降低，即可认为聚焦完成。
5. 电极溶液的选择 通常强酸或强碱被作为宽pH范围的电极 液，弱酸或弱碱被作为窄pH范围的电极液。
6. 样品处理 将样品溶解在双蒸水中。样品溶液中的盐离子， 哪怕是很低浓度，也会破坏pH梯度，使蛋白条带畸 变，盐离子还会产生高电流导致烧胶，所以样品溶 液必须避免使用高盐浓度的缓冲液。在等电聚焦之 前，可以通过透析或凝胶过滤层析柱除盐。
提高疏水蛋白在水中的溶解性
1. 尿素
改善疏水蛋白接近pI时的可溶性，也可增加
多肽的溶解度。 2. 非离子去污剂和两性离子去污剂 能在不破坏蛋白质结构保持生物活性的情况 下改善蛋白的溶解度。
尿素和去污剂结合使用是提高疏水蛋白可溶性 的最好方法。
7.加样方法
根据等电聚焦的原理，样品可加在凝胶上任何合适的位置都可 得到相同的结果。
等电聚焦技术
根据建立pH梯度原理的不同，梯度又 分为载体两性电解质pH梯度和固相pH梯度。 前者是在电场中通过两性缓冲离子建立pH 梯度，后者是将缓冲基团成为凝胶的一部 分。
三、载体两性电解质 1. 载体两性电解质的合成 1961年Svensson H提出的载体两性电解质 的理论基础，1964年Vesterberg O利用多乙烯 多胺和不饱和酸合成了载体两性电解质，它 是由脂肪族多氨基多羧基的异构物和同系物 组成，它们有连续改变的氨基与羧基比。
双向电泳的原理及步骤
双向电泳的原理及步骤
双向电泳是一种分离蛋白质的方法，基于蛋白质在电场中的电荷和大小的不同进行分离。
以下是双向电泳的原理及步骤：
原理：
双向电泳是将蛋白质样品首先进行等电聚焦，然后再进行垂直于等电聚焦方向的SDS-PAGE电泳，从而获得更高的分离效率。
等电聚焦可以将蛋白质按照等电点的不同进行分离，而SDS-PAGE电泳可以将蛋白质按照分子量的大小进行分离。
通过这两个步骤的组合，可以更加准确地分离出蛋白质。
步骤：
1. 等电聚焦：将蛋白质样品加入到等电聚焦电极中，该电极包含有一系列等电点缓冲液。
在等电聚焦过程中，电极会产生一个电场，该电场会将带有不同电荷的蛋白质分子朝向不同方向移动，最终在等电点处停留。
这样可以将蛋白质按照等电点的不同进行分离。
2. SDS-PAGE电泳：在等电聚焦完成后，将电极旋转90度，使其与等电聚焦电极垂直。
然后将电极中的蛋白质样品注入到SDS-PAGE凝胶中，并进行电泳。
在SDS-PAGE电泳中，蛋白质会在电场中移动，但由于SDS的存在，蛋白质会被完全线性化。
这样可以将蛋白质按照分子量的大小进行分离。
3. 结果分析：通过电泳分离，可以得到一系列不同的蛋白质带，每个带代表一个蛋白质。
通过比对蛋白质带的大小和位置，可以鉴定蛋白质的分子量和等电点，从而确定蛋白质的特征。
等电聚焦电泳 介绍
4. 置于室温中自然干燥，完全干燥后的胶板，手感如触及玻璃板。这时，可将胶板揭下，裁去边角多余的纸，即可得一张图谱清晰的干胶板。
注意事项
（1）支持介质
在IEF-PAGE中，丙烯酰胺純度极为重要，Acr及Bis中如有丙烯酸，则引起聚焦后pH剃度漂移，一般需用重结晶法进一步纯化Acr及Bis。 最近Pharmacia公司推出Amberlite MB-6除去丙烯酸，其效果较再結晶法更佳。
操作方法
一、准备工作
配制凝胶前，应把玻璃板准备好。即将两块干净的玻璃板叠放在一起，之间夹上所需凝胶厚度的胶条进行密封。然后用文具夹将玻璃板四周固定好。注意夹子作用力点在胶条正中，以防漏胶。
二、配制凝胶
取Acr-Bis储备液2.0ml；两性电解质0.5ml；去离子水5.5ml；TEMED 8μl置于小烧杯中混匀，再加入10% 过硫酸胺50μl，用磁力搅拌器充分混匀2min。然后用注射器吸净混合液，排除气泡，缓缓注入玻璃板的夹隙内。注意勿出现气泡。
实验证实，盐离子可干扰pH梯度形成，并使区带扭曲。为了防止上述影响，进行IEF-PAGE时，样品应透析或用Sephadex G-25脱盐，也可将样品溶解在水，或是低盐缓冲液中，使其充分溶解，以免不溶小顆粒引起拖尾。但某些蛋白质在等电点附近，或水溶液及低盐溶液中，溶解度较低，則可在样品中加入两性电解质，如加入1%甘氨酸或对1%甘氨酸透析，虽然甘氨酸是两性电解质，但不影响pH梯度的形成，可利用其在溶液中的偶极距作用增加蛋白質的溶解性。此外，还可在样品及凝胶溶液中加入无离子去污剂如Tween 80, Triton X-100, Nonide P-40等或加入相同浓度的尿素(4 M)，以免氰酸盐引起蛋白质的胺甲酰化，含有尿素的样品及凝胶板只能当天使用。
等电聚焦电泳
等电聚焦的基本原理
这就是等电聚焦电泳分离蛋白质的基 本原理。可见在该方法中，等电点是蛋 白质组分的特性量度，将等电点不同的 蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质 中，在电场内经过一定时间后，各组分 将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置 上，形成分离的蛋白质区带。
相等时,此时溶液的pH就是这种氨基酸的等电点(pI).
蛋白质是由氨基酸组成的,除了有末端-NH3+和末端COO-外,参与其组成的氨基酸残基侧链上还有酸、碱
性基团,因此蛋白质是两性物质,也有等电点.
等电聚焦的基本原理
不同的蛋白质或其他两性电解质具有不同 的等电点。如果某种蛋白质处于大于其等电点 的pH环境中，则带负电，在电场中必向正极泳 动；反之，当某种蛋白质处于小于其等电点的 pH环境中，则带正电，在电场中向负极泳动。
不同品牌的载体两性电解质性质上有细 微的差别，使用不同来源的载体两性电解 质凝胶时候蛋白质分离样式略有差异，若 要获得最好的重复性一般不要更换载体两 性电解质的品牌。
电泳仪-AE6541
电泳仪-伯乐bio-rad
电泳仪--实验室
电泳槽--DYCP32型
等电聚焦电泳分离蛋白质
一、仪器与试剂
1．仪 器： JY5000电泳仪、DYCP32型电泳槽 2．试 剂：蛋白质样品、载体两性电解质、
载体两性电解质
两性电解质，是脂肪族多胺和多羧类 的同系物，他们具有相近但不同的pKa 和pI值。在外电场作用下，自然形成pH 梯度，是一种特殊的缓冲液。
介绍三种电泳
电泳的种类以及应用领域一、电泳的三种形式分析：等电聚焦电泳是将两性电解质加入盛有pH梯度缓冲液的电泳槽中，当其处在低于其本身等电点的环境中则带正电荷，向负极移动；若其处在高于其本身等电点的环境中，则带负电向正极移动。
当泳动到其自身特有的等电点时，其净电荷为零，泳动速度下降到零，具有不同等电点的物质最后聚焦在各自等电点位置，形成一个个清晰的区带，分辨率极高。
移动界面电泳是将被分离的离子（如阴离子）混合物置于电泳槽的一端（如负极），在电泳开始前，样品与载体电解质有清晰的界面。
电泳开始后，带电粒子向另一极（正极）移动，泳动速度最快的离子走在最前面，其他离子依电极速度快慢顺序排列，形成不同的区带。
只有第一个区带的界面是清晰的，达到完全分离，其中含有电泳速度最快的离子，其他大部分区带重叠。
区带电泳是在一定的支持物上，于均一的载体电解质中，将样品加在中部位置，在电场作用下，样品中带正或负电荷的离子分别向负或正极以不同速度移动，分离成一个个彼此隔开的区带。
区带电泳按支持物的物理性状不同，又可分为纸和其他纤维膜电泳、粉末电泳、凝胶电泳与丝线电泳。
二、电泳的应用范围：1、环保气溶胶也可发生电泳现象，如在水泥、冶金等工厂中，通高压电于含烟尘的气体时，可除去大量烟尘以减少空气污染，净化环境，保护人民健康。
2、刑侦在公安、政法侦审工作中，利用电泳技术检测的结果，对确定案件性质、提供侦察线索和犯罪证据等，常常起着十分重要的作用。
多年来一直用作案现场留下的污迹与嫌疑分子的血型相核对的方法，遇到了一个以上的嫌疑分子是同样的血型时，这种方法就失灵了。
然而利用电泳技术可以从人的体液和其他组织的样品中分离出代表一个人的独特基因组成的一系列谱带，从而能比较准确地鉴别罪犯。
3、医学在医院临床检验中，利用电泳技术分析血清中的酶及同工酶，可以诊断肾病的综合征、心绞痛、肝硬化、肝癌、多发生骨髓瘤、恶性肿瘤、乙型肝炎、慢性肝炎等疾病；分析血色素组份，可以判定血细胞的正常与异常；；测定体液中可能存在微生物、原虫的特异性抗原成份，在抗原成份分离的基础上，寻找所需的单克隆抗体等等。
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等电聚焦电泳（IEF）分离蛋白及测定蛋白质等电点
等电点聚焦（IEF ）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，等电聚焦是在稳定的pH 梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。
在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极间逐步建立稳定的pH 梯度，当蛋白质分子或其他两性分子存在于这样的pH 梯度中时，这种
分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终达到一个使其表面静电荷为0 的区带，这时的pH 则是该分子的pI ，聚焦在等电点的分子也会不断扩散，一旦偏离其等电点后，由于pH 环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI 迁移。
因此，这些分子总会是处于不断扩散和抗扩散的平衡中，在pI 处得以“聚焦”.
二、仪器与试剂1．材料：蛋白样品2．试剂：聚丙烯酰胺、甲乙聚丙烯酰胺、两性电解质、尿素、
NP-40、teiton-100
电极液：1M 磷酸（阳极液）、1M 氢氧化钠（阴极液）
固定液：100g三氯乙酸、10g磺基水杨酸溶于500ml，定容为1000ml
染色液：0.35g考马斯亮蓝R—150溶于300ml脱色液中，加热到60 - 70C,加入0.3g硫酸铜。
脱色液：25％乙醇、8％冰乙酸溶于水
样品缓冲液:1％Ampholine 、2％Triton X-100 、9M 尿素
三、操作步骤：
1, 样品制备：用IEF 样品缓冲液提取待分析样品，如其他缓冲液提取的样品则应透析后，冷冻干燥、再复溶于IEF 样品缓冲液。
充分溶解后，离心去除不溶杂质。
2, 制模具：
洗干净两块IEF 专用玻璃板，进行硅化和反硅化处理，两块玻璃板的硅化和反硅化面相对，放上夹条，夹子夹好。
3, 配胶：
胶液组成：6ml 胶母液（10％，19/1）
6—8 ％尿素
1ml Ampholine （pH3.5-10）
60-80ul 10%AP
5 ul TEMED
4, 灌胶：配好的胶迅速灌入模具
5, 电泳：
等胶凝固后，小心揭去上下玻璃板，将塑料垫片底部擦干，小心放于电泳槽上。
在胶面两边各放一根浸透电极缓冲液的电极条。
在胶面上任意位置上放上小擦镜纸片，在纸片上加样，盖上盖子，横功率25W电泳，约10min后，暂停电泳，取下纸片，继续电泳约30min，待电流达4mA 以下，停止电泳。
6, 表面电极测定蛋白质的pI
7, 固定：取出塑料片，放入固定液中15min
8, 染色：取出塑料片放入染色液中65C染色，直至条带出现
9, 可脱色至背景消除后干燥保存。
四、结果（略）五、注意事项
1、两性电解质是等电聚焦的关键试剂，它的含量2% -3 %较合适，能形成较好的pH梯度。
2、丙烯酰胺最好是经过重结晶的。
3、过硫酸铵一定要新配置。
4、所有水用重蒸水。
5、样品必须无离子，否则电泳时样品带可能走歪，拖带或根本不成带。
6、平板等电聚焦电泳的胶很薄，当电流稳定在8mA，电压上升到550V以上，由于阴极飘移，造成局部电流过大，胶承受不了而被烧断。
原理】
蛋白质（酶）、多肽等两性电解质，其所带电荷的数量与性质，随所处环境的pH 而变化。
环境pH 低于其等电点时，带正电荷，在电场中向阴极移动；环境pH 高于其等电点时，带负电荷，在电场中向阳极移动；环境pH 等于其等电点时，不带电荷，在电场中不移动。
据此，在电泳系统中创造一个由阳极向阴极，pH 由低到高的连续而稳定pH 梯度环境，那么处在这种系统中具有不同等电点的各种蛋白质，将根据所处环境的pH 与其自
身等电点的差异，分别带上正电荷或负电荷，并向与它们各自的等电点相当的pH 环境位
置处移动，当到达该位置时即停止移动，从而各自焦聚（聚焦），分别形成一条集中的蛋白质区带。
这种根据蛋白质等电点的不同而将它们分开的电泳方法称为等电聚焦电泳。
电泳后测定其各种蛋白质“ 聚焦”部位的pH ，即可得知它们的等电点。
在等电聚焦电泳中，造成环境由酸至碱逐步变化所用的物质是一类两性电解质。
它具有依次
递变但相差不大的等电点（PI ），在电场中可以形成逐渐递变而又连续的pH 梯度。
此类物质在等电点处具有足够的缓冲能力，以保证不致受蛋白质样品等两性物质对pH 梯度的
影响；在等电点处还具有足够高的电导，保证电流通过，而且整个体系的电导均匀，使样品迁移不受影响，达到聚焦；这类物质还具有不与分离物质反应或使之变性，自身化学性质不同于被分离物质，分子量也小，当电泳后经透析等可与被分离物质分开。
为防止电泳过程中，因为对流现象使已经聚焦的蛋白质区带再混合，需要一种能抗对流的介质作为电泳支持物。
目前常用的有蔗糖、甘油或乙二醇形成的密度梯度。
用琼脂糖、聚丙烯酰胺形成的凝胶及利用亲水惰性颗粒，如葡聚糖凝胶、淀粉、滤纸等为支持剂，以凝胶作为支持物的称为凝胶聚焦电泳，这种方法适用于分析分离。
其他支持剂适用于制备。
【试剂与器材】
1. 两性电解质Ampholine ，pH3~10 ，浓度40 ％。
2. 丙烯酰胺（Acr ）溶液：Acr 30g ，甲叉双丙烯酰胺（Bis ）l.0 g ，蒸馏水溶解后定容至
100ml ，过滤，4 o C 保存。
3. TEMED
4. l0 ％AP 溶液：临用时配制。
5. 正极缓冲液：0.2 ％（V/V ）硫酸或磷酸。
6. 负极缓冲浪：0.5 ％（V/V ）乙二胺水溶液。
7. 固定液：10% （W/V ）三氯乙酸。
8. 染色液：考马斯亮蓝R 250 2.0 g 以50 ％甲醇1000ml 溶解。
使用时取93ml ，加入7.0 ml 冰醋酸，摇匀即可使用。
9. 脱色液：按5 份甲醇、5 份水和1 份冰醋酸混合即可。
10. IgG ：制成10mg/ml 的水溶液。
11. 电泳仪：100InA ，600V 。
12. 垂直平板电泳槽
【操作步骤】
1. 凝胶制备：按下表配制7 ．5 ％凝胶。
吸取丙烯酰胺凝胶，AP 和水于50ml 的小烧杯中混匀，在真空干燥器中抽气10min （本实验将此步省略，并不影响实验结果）。
然后加入0.3ml Ampholine 、0.lml IgG 待测样品和0.lml TEMED 溶液，混匀后立即制胶（方法同SDS －PAGE 电泳），胶液加至距离顶部5mm 处，在胶面上覆盖3mm 厚的水，应注意不要让水破坏胶的表面，室温下放置20~30min 即可聚合；
为观察聚焦状况，可在样品中加入聚焦指示剂，如带红颜色的肌红蛋白（PI = 6.7 ）、细
胞色素 C （PI = 10.25 ）或甲基红染料（PI = 3.75 ）,以示聚焦的进展情况；
2. 电泳：吸去凝胶表面上的水层，于电泳槽正极缓冲液加入0 ．2 ％的硫酸（或磷酸），
负极加入0.5 %的乙二胺（或乙醇胺）。
打开电源，将电压恒定为160V，因为聚焦过程是电阻不断加大的过程，故聚焦电泳过程中，电流不断下降，降至稳定时，即表明聚焦已完成，继续电泳约30min后，停止电泳；
3. 剥胶：电泳结束后，取下肢块，分别于正负两极做上标记，切不可弄混，并测量出凝胶
的长度；
4. 固定、染色和脱色：固定液中浸泡30Inin，然后转移至脱色液中浸泡，换3次溶液，每次10min浸泡过程中不断摇动，以除去Ampholine。
量取并记录漂洗后的胶长。
再把
胶放置于染色液中，室温染色30min ,取出用蒸馏水洗后，放在脱色液中脱色，不断摇动，并更换
3~5次脱色液，待本底颜色脱去，蛋白质区带清晰时，量取并记录凝胶长度以及蛋
白质区带中心至正极端的距离；
5. pH梯度的测量：在未固定前将凝胶纵切为两部分，一部分用于进行第四步，另一部分（三条泳道即可）按从正极端向负极端的顺序切成0.5cm的区段，按次序放人有标号的、装有
lml蒸馏水的试管中，浸泡过夜，然后用精密pH试纸测出每管浸泡液的pH并记录。
有条件的实验室最好用精密pH计测定；
6. 结果测定：
（l ）pH梯度曲线的制作：以胶长（mm ）为横坐标，各区段对应的pH的平均值为纵坐标，在坐标纸上作图，可得到一条近似直线的PH梯度曲线。
由于测得的每一管的pH 是5mm长一段凝胶各点pH的平均值，因此作图时可把次pH视为5mm小段中心区的pH，于是第一小段的pH所对应的凝胶长度为 2.5mm ；第二小段的pH所对应的凝胶长
度为（5^2-2.5 ）mm ；由此类推，第n小段的pH所对应的凝胶长度为（5n-2.5 ）mm ；
（2）待测蛋白样品等电点的计算：
①按下列公式计算蛋白质聚焦部位距凝胶正极端的实际长度（Lp表示）：
Lp=lP X1 /l 2
Lp --------- 式中Lp染色后蛋白质区带中心至凝胶正极端的长度
l 1 --------- 1 1凝胶固定前的长度
l 2 --------- 1 2凝胶染色后的长度。