微生物学新技术在环境领域中应用

三、生物芯片
通过微加工技术和微电子技术将生物探针分子 （寡聚核苷酸、cDNA、基因组DNA、多肽、抗原、 抗体等）固定在硅片、玻璃片、塑料片、凝胶、 尼龙膜等固相介质表面，从而构建出一个微型 生物化学分析系统。
生物芯片可以对细胞、蛋白质、DNA以及其他生 物组分进行准确、快速和大信息量的检测。
生物芯片技术可广泛应用于疾病诊断和治疗、 基因组图谱、药物筛选、农作物选育、司法 鉴定、食品卫生监督等多个领域。在环境检 测领域，可以利用生物芯片技术快速检测微 生物或有机化合物对环境、人体、动植物的 污染和危害。
• MD1 是解链温度最低的一个解链区域，MD3 是温度最高的一个 解链区域。
不同的双链DNA 片段因为其序列组成不一样，所以其解链区 域及各解链区域的解链温度也是不一样的。
• 当它们进行DGGE时，一开始变性剂浓度比较小，不能使双链 DNA 片段最低的解链区域解链，此时DNA 片段的迁移行为和 在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一样。
举例：
油藏古细菌 V3区 DGGE 图谱 胶浓度：10% 变性剂范围：40%-60% 电压：200V 运行时间：4.5h
优点：
重现性强，可靠性高，方便快捷而且使用成本低。 能同时分析多个样品，使其非常适于分析环境样品 中微生物群落结构的变化。
缺点：
• 分辨率有限，复杂环境中（土壤或肠道），只能检测出优势菌。 • 一般只能分析500bp以下的片段。 • PCR过程产生的异源双链和单链DNA会对分析造成偏差。
第二节 微生物絮凝剂
传统的絮凝剂有无机和有机高分子两类，第三 类为微生物絮凝剂。加量为200mg/L 一、微生物絮凝剂的特点 1、来源广泛，生产周期短且效率高。 2、具很高的絮凝效果，与聚铁、聚丙烯酰胺等 絮凝剂比，絮凝速度大，沉淀易过滤。 3、对人体和动物无危害。 4、具可生化性，可防止絮凝后对环境造成的二 次污染。 5、能广泛应用于各种污水的处理。
三、微生物絮凝剂的絮凝机理
“桥联作用”机理：絮凝剂大分子借助离子键、 氢键和范德华力，同时吸附多个胶体颗粒， 在颗粒之间产生“架桥”，从而形成一种网 状的三维结构而沉淀下来。
絮凝剂的分子结构、形状、相对分子质量和 所带基团会影响其絮凝效果。
四、微生物絮凝剂的合成和应用
1、微生物絮凝剂的合成
一般认为，微生物多在其生长的中后期释放絮 凝剂形成絮体，但到了静止期后期，细胞不再 产生新的絮凝物质，甚至会由于出现解絮凝酶 而导致絮凝活性下降。
• 一旦DNA 片段迁移到一定位置，其变性剂浓度使双链DNA 片 段最低的解链区域解链，部分解链的DNA 片段在胶中的迁移 速率会急剧降低。因此，不同的DNA 片段会在胶中的不同位 置处发生部分解链导致迁移速率大大下降，从而在胶中被区分 开来。
然而，当变性剂浓度达到DNA 片段最高的解链区域温度时， DNA 片段会完全解链，此时它们又能在胶中继续迁移，这些 片段就不能被区分开来。
●层析法，吸附层析法、离子交换层析法、 分子筛过滤层析法、等电点沉淀法
三、固定化方法
固定化方法有载体结合法、交联法、包埋法 和逆胶束酶反应系统。
1、载体结合法
将酶固定在非水溶性载体上。载体有葡聚糖、活性 碳、胶原、琼脂糖、多孔玻璃珠、高岭土、硅胶、 氧化铝、羧甲基纤维素等。
2、交联法
利用双功能试剂或多功能试剂使酶与酶发生交联而 进行固定。交联剂有：戊二醛、双重氮联苯胺和六 甲撑二异氰酸酯。
• 通常根据16S rRNA 基因中比较保守的碱基序列设计通用引物， 其中一个引物的5’-端含有一段GC 夹子，用来扩增微生物群 落基因组总DNA，扩增产物用于DGGE/TGGE 分析。
• 由于DGGE/TGGE一般只能分析500 bp 以下的DNA片断，所 以一般选择扩增16S rRNA基因的V3区或V6-V8区。
（3）PCR技术的应用 ①应用PCR技术研究特定环境中微生物区系
的组成、结构，分析种群动态。
②应用PCR技术监测环境中特定的微生物。 ③量化环境系统中微生物群体的各组成成员。
二、16S rDNA序列及其同源性的分析
通过对16S rRNA基因的DNA序列分析，可以 分析细菌的种类信息，并且已经逐渐成为微 生物分类和鉴定中非常重要而且有用的指标 和手段。
固定化微生物，用制备固定化酶的方法将微 生物固定在载体上，即成固定化微生物。
固定化细胞比游离细胞稳定性高，催化效 率比离体酶高，且比固定化酶操作简便，能 完成多步酶反应。
二、酶的分离提纯
利用微生物生产酶制品可以分为菌种选育、 发酵培养、分离提取和酶制品保存四个步骤。
1纯化： ●盐析法，绝大多数情况采用（NH4）2SO4。 ●有机溶剂沉淀法， 乙醇或丙酮
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• DGGE/TGGE 技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变 性剂（尿素和甲酰胺）梯度或是温度梯度，从而能够把同样长 度但序列不同的DNA 片段区分开来。
• 一个特定的DNA 片段有其特有的序列组成，其序列组成决定 了其解链区域(melting domain, MD)和解链行为(melting behavior) 。
(3)乳化液油水分离
用广泛产碱菌（Alcaligenens latus ）培养物
易将棕榈酸从其乳化液中分离出来。
（4）活性污泥的处理
从红平红球菌 （Rhodococcus erythropolis ）
分离得到的絮凝剂可促进污泥的沉降。
第三节 分子生物技术在环境领域中的应用
一、核酸探针和PCR技术 1、核酸探针 在适当条件下，单链DNA片段能与另一段与之互 补的单链片段结合，这个过程称为核酸杂交。 利用这一特性，将最初的DNA片段进行标记，即 可做成核酸探针。 利用核酸探针技术可以检测环境中是否存在某 些特定种类的微生物，如致病菌和病毒。
3、包埋法
将酶包埋在凝胶格子（格子型）中，或由半透性 的聚合物膜组成的胶囊内（微胶囊型）的方法。
格子型的包埋材料：聚丙烯酰胺（PACAM）凝 胶、聚乙烯醇（PVA）、琼脂、硅胶等。 微胶囊型的包埋材料：尼龙、乙基纤维素和硝酸 纤维素
4、逆胶束酶反应系统
表面活性剂的两性分子在有机溶剂中自 发形成聚集体，其亲水一端连接成逆胶 束的极性核，水分子插于核中，其疏水 性的一端进入主体有机溶剂中，酶分子 溶于逆胶束中，组成逆胶束酶系统。
16s rRNA基因技术在环境科学领域中的应用
①鉴定生物降解菌； ②研究某一特定环境中微生物的区系组成，进而了 解其种群动态，研究微生物的多样性。
PCR-DGGE或PCR-TGGE分析微生物的多样性
变性梯度凝胶电泳DGGE
1979年由Fisher和Lerman最先提出的用于检测 DNA片段中的点突变的一种电泳技术。
培养基的组成、初始pH、培养温度、通气状况 等会影响絮凝剂的合成。
提取方法：凝胶色谱，有机溶剂提取和碱提取。
2、微生物絮凝剂的应用
(1)高浓度有机水废水的处理 NOC-1生物絮凝剂加Ca2+处理畜业生产产生的 废水； C-62菌株产生的絮凝剂处理？革废水。
（2）染料废水的脱色 用于造纸黑液、糖蜜废水、墨水废水的脱色。
根据变性剂梯度方向与电泳方向相同或不 同,DGGE分为：
垂直DGGE
平行DGGE
确定合适的变性剂范围
对DNA片段进行有效分离
当等长的双链 DNA
分子在含梯度变性剂
低
GC-Clamp
浓
(尿素、甲酰胺)聚丙烯
16SrDNA
度
酰胺凝胶中进行电泳时,
因其解链的速度和程度
与其序列密切相关;
部 分 解 链 的 DNA 分 子
②退火 将加热变性的单链DNA溶液的温度缓
慢下降至55 ℃后，在这过程中引物的DNA的 碱基将与单链模板DNA一端碱基配对。
③延伸 退火之后，当温度上升至72℃时，
在耐热性Taq DNA多聚酶、适当的PH和一定 的离子强度下，寡核苷酸引物（引物DNA） 碱基延伸和模板DNA结合构成双链DNA。
经过25～30次循环，扩增倍数达106，可将 2kb 的DNA由原来的1pg扩增到0.5 ～ 1μg。
2、PCR技术
PCR(Polymerase chain reaction) 称 为 DNA 多聚酶链式反应，是对特异性DNA片段在体 外进行扩增的一种非常快速而简便的方法。
（1）PCR的原理：
（2） PCR技术的操作方法：
①加热变性 将待扩增的DNA置于94~95℃的
高温中加热5min，使双链DNA解链为单链 DNA，分开的两条单链DNA作为扩增的模板。
Muyzer 等人在1993 年首次将其应用于微生物群落 结构研究 。后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶 电泳（Temperature gradient gel electrophoresis， TGGE）。
原理
双链DNA 分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决 定于其分子大小和电荷。不同长度的DNA 片段能够被区分开， 但同样长度的DNA 片段在胶中的迁移行为一样，不能被区分。
高
的迁移速度随解链程度
浓 度
增大而减小。
常规的DGGE电泳技术对于长度超过500bp的DNA片段的序列变化情况, 只能有50%的检出率。
应用“GC夹板”技术可使检出率提高到100 %。
DGGE的参数：
• 胶浓度 取决于片段大小 ，通常不宜超过500bp 6%胶浓度： 400 ～ 1000bp 8%胶浓度： 200 ～ 400bp 10%胶浓度：100 ～ 300bp
二、微生物絮凝剂的结构组成、化学本质
1、微生物絮凝剂的结构组成
具有絮凝性的微生物涉及各类微生物，有 细菌、放线菌、霉菌、酵母菌，原生动物 等（表11-1）。
微生物絮凝剂的组成和结构见表11-2。
2、微生物絮凝剂的化学本质
微生物所产生的絮凝剂主要是微生物代 谢过程中所产生的多聚糖类，有些是蛋 白质（或多肽），或者是含有蛋白质 （或多肽）。
• 在DNA 片段的一端加入一段富含GC 的DNA 片段（GC 夹子， 一般30-50 个碱基对）可以解决这个问题。
• 含有GC 夹子的DNA 片段解链温度很高，可以防止DNA 片段 在DGGE 胶中完全解链。
• 当加了GC 夹子后，DNA 片段中每个碱基处的序列差异都能被 区分开。
当用DGGE/TGGE 技术来研究微生物群落结构时，要结合 PCR（polymerase chain reaction）扩增技术，用PCR 扩增的 16S rDNA 产物来反映微生物群落结构组成。
16S rDNA的高可变区
•提取基因组后，扩增16SrDNA高可变区片段
• V3区 约170bp • V6-V8区 约350bp • 片段大小不同，携带的 信息量不同，选择不同的 区域得到DGGE图谱不同， 群落信息也有差异 • 不同的片段大小对应的 胶浓度也不同 •根据需要选择最合适的
E. coli 16S rRNA二级结构及各可变区
• 变性剂范围 不同的样品不同 • 温度 一般都用60摄氏度 • 电压 • 时间
环境样品分析的流程
DGGE在微生物分子生态学中的应用
• 对微生物群落结构进行对比、分析或者跟踪监测。 • 通过扩增功能基因来研究功能基因及功能菌群的
多样性。 • 跟踪及检测细菌的富集和分离，评价不同的培养
条件对分离菌种的影响。
• 一个几百个碱基对的DNA 片段一般有几个解链区域，每个解 链区域有一段连续的碱基对组成。当变性剂浓度逐渐增加各区 域依次发生解链。
• 显示的是一个234bp 长的DNA 片段的解链区域，横坐标是该DNA 片段的序列，依次从第一个碱基到第234 个碱基；纵坐标是解链 温度。该DNA 片段共有3 个解链区域。
对微生物细胞的固定化最适合用凝胶包 埋法。
四、固定化酶和固定化微生物在环境工程中的应用
英国采用固定化细胞反应设备处理含氰废水。
中国应用固定化细胞技术降解含直链烷基苯磺酸 钠（LAS）废水，去除率和酶活性保存率均在 90%以上。
德国将9种降解对硫磷农药的酶共价固定在多孔 玻璃珠、硅胶珠上，制成酶柱处理对硫磷废水， 获得95%以上的去除效果。