(转化率)酶法合成头孢氨苄工艺研究

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收稿日期：2012-08-10

基金项目：国家863计划(2012AA021204)。

作者简介：王艳艳，女，生于1978年，学士，工程师，主要从事生物酶的制备和应用，E-mail: wyycspc@

文章编号：1001-8689(2013)07-0516-04

酶法合成头孢氨苄工艺研究

王艳艳 袁国强 朱科 王进贤

(石药集团中诺药业(石家庄)有限公司，河北省抗生素工程技术研究中心，石家庄 050041)

摘要：目的 酶法合成氨苄西林工艺优化并回收套用母液中的母核。方法 采用酶催化法，以7-氨基-3-去乙酰氧基头孢烷酸(7-Amino-3-methyl-3-cephem-4-carboxylic acid , 7-ADCA) 为母核，苯甘氨酸甲酯(D-phenylglycine methyl ester, PGM) 为酰基供体，在水相中用固定化青霉素酰化酶(Penicillin Gacylase, PGA)催化合成头孢氨苄(Cephalexin)；对投酶量、侧链与底物投料比、反应温度、反应pH 、反应时间及母液中7-ADCA 回收套用等条件进行优化，考察头孢氨苄摩尔收率及产品质量。结果 工艺优化后头孢氨苄摩尔收率85%以上，套用母液中回收的7-ADCA 后头孢氨苄摩尔收率91%以上，高于目前化学法的收率(89%)，产品质量合格。结论 酶法合成头孢氨苄工艺反应条件温和，收率高，排放废水中仅含有一些简单的无机盐，对环保无压力，属于绿色合成工艺。

关键词：青霉素G 酰化酶；头孢氨苄；7-ADCA 中图分类号：R978.1+1 文献标识码：A

Study on preparation of cephalexin by enzymatic method

Wang Yan-yan, Yuan Guo-qiang, Zhu Ke and Wang Jin-xian

(Shijiazhuang Pharm.Group Hebei Zhongnuo Pharmaceutical Co., LTD, Hebei Province Antibiotic Engineering

Technology Research Center, Shijiazhuang 050041)

Abstract Objective To study the process optimization of cephalexin by enzymatic synthesis and recycling the nucleus in the mother liquid. Method Using the enzymatic method, 7-amino-3-methyl-3-cephem-4-carboxylic acid as the nucleus, D-phenylglycine methyl ester as the acyl donor, in the aqueous phase with immobilized penicillin G acylase catalyzed synthesis of cephalexin; temperature, pH, side chain and substrate feed ratio, investment conditions, Such as the amount of enzyme, reaction time and recycling the nucleus in the mother liquid was optimized, examining the yield and quality of the products. Result The molar yield of cephalexin was 85% after process optimization, and the molar yield of cephalexin was 91% after mother liquor was recycled, it was higher than the chenmical method(89%), and product quality was quali fi ed. Conclusion The reaction conditions of enzymatic cephalexin was mild, the yield was higher, waste water of reaction contained only some simple inorganic salt and it decreased the environmental pressure, which belonged to the green synthesis process.

Key words Penicillin G acylase; Cephalexin; 7-ADCA

头孢氨苄是广谱抗生素，通过抑制细胞壁的合成，达到杀菌作用，是目前临床使用量较大的一个半合成头孢菌素，是头孢类抗生素中的一个主要品种。

头孢氨苄的传统合成方法是把母核和侧链经过

化学方法结合而得到头孢氨苄[1-2]，化学合成过程经过混酐、缩合、水解和结晶等工序，由于需要基团保护、工艺路线较长，工序中用到吡啶、特戊酰氯、N, N-二甲基甲酰胺(DMF)β-萘酚等毒性很大的

中国抗生素杂志2013年7月第38卷第7期

DOI:10.13461/ki.cja.005215

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化学物质，有害物质容易在药物中造成微量残留。

近年来国内外都在致力于酶法合成的研究，酶法合

成头孢氨苄有着许多化学法无可比拟的优点，它具

有反应条件温和、工艺操作简单、无需基团保护、

清洁安全等优点，酶法制备头孢菌素在工业上有很

大的潜力[3-5]，生物酶的合成方法和路线具有一定的

社会效益和经济效益。

本文报道的酶法合成工艺是以7-氨基-3-脱乙酰氧

基头孢烷酸为母核，苯甘氨酸甲酯为酰基供体，固化

青霉素酰化酶为催化剂，催化合成头孢氨苄[6-7]。本

工艺通过对反应投酶量、投料比、反应温度、pH、

反应时间及回收7-ADCA套用工艺参数的调整和控

制，7-ADCA转化率98%以上，回收的7-ADCA套用

后头孢氨苄摩尔收率91%以上。

1 实验材料和方法

1.1实验原材料

PGM由石药集团宏源化工提供、PGA由石药集

团中诺制药有限公司提供、7-ADCA由江苏九九久科

技股份有限公司(含量≥98.5%)提供。

1.2实验设备

B I O-2020生物反应器、自动电位滴定仪、

SIGMA高速离心机、BX-180循环冷冻机、高效液

相、SevenEasyPH计、真空干燥箱

1.3实验方法

1.3.1合成部分

(1) 酶催化合成

在合成反应罐中加入一定的合成酶；在溶解

罐中溶解7-ADCA，pH=7.5；将7-ADCA转移至合

成罐，PGM溶解液采用滴加方式，用浓NH

3·H

2

O

控制pH。加完后用6mol/L盐酸和3mol/L氨水控制反应pH，用循环冷冻机控制反应温度，通过检测7-ADCA的转化率判断反应终点，转化率大于98%以上终止反应。

(2) 分离

通过反应器底部筛网进行头孢氨苄和固体酶的分离，用母液循环洗涤直至母液无白色物质。

(3)重结晶

滤饼溶于母液中，用浓盐酸溶解，温度20℃；溶解液过100μm滤纸后转移至结晶罐，用3mol/L氨水调晶。一调PH=2.2~2.5 ，T=30~35℃，养晶30min；二调至PH=4.8~5.0，养晶3h。

(4) 抽滤、丙酮洗涤、45℃干燥2h后得头孢氨苄成品。

1.3.2结晶母液中过量7-ADCA回收[8]

(1) 裂解

酶法头孢氨苄重结晶母液在PGA作用下裂解，T=20℃，pH=8.0~8.3，反应90min，分离酶和回收苯甘氨酸(固体)。

(2) 裂解反应清液用分子量200的纳滤膜进行浓缩

(3)结晶：浓缩液脱碳后进行结晶，一调pH=4.5~4.7，养晶30min；二调pH=3.8~4.0，养晶2h。

(4) 抽滤，洗涤，干燥得7-ADCA粗品。

(5) 回收的7-ADCA进行下批头孢氨苄合成反应套用。

2 分析与讨论

在7-ADCA底物反应浓度一定的条件下，实验从投酶量、投料比、反应温度、反应pH及反应时间5方面考察各实验因素对头孢氨苄摩尔收率的影响，从而确定最为合适的酶法合成头孢氨苄的实验条件。7-ADCA底物浓度定在600mmol/L。

2.1投酶量对合成收率的影响

PGM：7-ADCA为1.8，温度为20℃，PH7.0的条件下，每升反应液投酶量分别为1.4、1.6、1.8、2.0和2.2KU，检测7-ADCA的转化率判断反应终点，最终检测成品收率。每个投酶量重复实验3批，取收率平均值进行比较。结果显示投酶量在1.8KU/L时，头孢氨苄平均摩尔收率最高；进一步增加投酶量会加大侧链分解程度，降低摩尔收率(图1)。

2.2 PGM和7-ADCA投料比对合成收率的影响

在投酶量1.8KU/L，温度20℃，H=6.8的条件下，PGM:7-ADCA分别为1.0、1.2、1.4、1.6、1.8，检测7-ADCA的转化率判断反应终点，最终检测成品收率。每个侧链加量重复实验3批，取收率平均值进行比较，结果显示PGM:7-ADCA=1.2:1时,头孢氨苄摩尔收率最高；若增加侧链投料比例，过多的侧链分解物抑制合成酶活力，合成反应收率反而降低(图2)。

2.3

酶催化合成反应温度合成收率的影响

图1投酶量对合成收率的影响

Fig.1 Effect of synthetic yield on amount of enzyme

酶法合成头孢氨苄工艺研究王艳艳等