(转化率)酶法合成头孢氨苄工艺研究

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收稿日期：2012-08-10
基金项目：国家863计划(2012AA021204)。

作者简介：王艳艳，女，生于1978年，学士，工程师，主要从事生物酶的制备和应用，E-mail: wyycspc@
文章编号：1001-8689(2013)07-0516-04
酶法合成头孢氨苄工艺研究
王艳艳 袁国强 朱科 王进贤
(石药集团中诺药业(石家庄)有限公司，河北省抗生素工程技术研究中心，石家庄 050041)
摘要：目的 酶法合成氨苄西林工艺优化并回收套用母液中的母核。

方法 采用酶催化法，以7-氨基-3-去乙酰氧基头孢烷酸(7-Amino-3-methyl-3-cephem-4-carboxylic acid , 7-ADCA) 为母核，苯甘氨酸甲酯(D-phenylglycine methyl ester, PGM) 为酰基供体，在水相中用固定化青霉素酰化酶(Penicillin Gacylase, PGA)催化合成头孢氨苄(Cephalexin)；对投酶量、侧链与底物投料比、反应温度、反应pH 、反应时间及母液中7-ADCA 回收套用等条件进行优化，考察头孢氨苄摩尔收率及产品质量。

结果 工艺优化后头孢氨苄摩尔收率85%以上，套用母液中回收的7-ADCA 后头孢氨苄摩尔收率91%以上，高于目前化学法的收率(89%)，产品质量合格。

结论 酶法合成头孢氨苄工艺反应条件温和，收率高，排放废水中仅含有一些简单的无机盐，对环保无压力，属于绿色合成工艺。

关键词：青霉素G 酰化酶；头孢氨苄；7-ADCA 中图分类号：R978.1+1 文献标识码：A
Study on preparation of cephalexin by enzymatic method
Wang Yan-yan, Yuan Guo-qiang, Zhu Ke and Wang Jin-xian
(Shijiazhuang Pharm.Group Hebei Zhongnuo Pharmaceutical Co., LTD, Hebei Province Antibiotic Engineering
Technology Research Center, Shijiazhuang 050041)
Abstract Objective To study the process optimization of cephalexin by enzymatic synthesis and recycling the nucleus in the mother liquid. Method Using the enzymatic method, 7-amino-3-methyl-3-cephem-4-carboxylic acid as the nucleus, D-phenylglycine methyl ester as the acyl donor, in the aqueous phase with immobilized penicillin G acylase catalyzed synthesis of cephalexin; temperature, pH, side chain and substrate feed ratio, investment conditions, Such as the amount of enzyme, reaction time and recycling the nucleus in the mother liquid was optimized, examining the yield and quality of the products. Result The molar yield of cephalexin was 85% after process optimization, and the molar yield of cephalexin was 91% after mother liquor was recycled, it was higher than the chenmical method(89%), and product quality was quali fi ed. Conclusion The reaction conditions of enzymatic cephalexin was mild, the yield was higher, waste water of reaction contained only some simple inorganic salt and it decreased the environmental pressure, which belonged to the green synthesis process.
Key words Penicillin G acylase; Cephalexin; 7-ADCA
头孢氨苄是广谱抗生素，通过抑制细胞壁的合成，达到杀菌作用，是目前临床使用量较大的一个半合成头孢菌素，是头孢类抗生素中的一个主要品种。

头孢氨苄的传统合成方法是把母核和侧链经过
化学方法结合而得到头孢氨苄[1-2]，化学合成过程经过混酐、缩合、水解和结晶等工序，由于需要基团保护、工艺路线较长，工序中用到吡啶、特戊酰氯、N, N-二甲基甲酰胺(DMF)β-萘酚等毒性很大的
中国抗生素杂志2013年7月第38卷第7期
DOI:10.13461/ki.cja.005215
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化学物质，有害物质容易在药物中造成微量残留。

近年来国内外都在致力于酶法合成的研究，酶法合
成头孢氨苄有着许多化学法无可比拟的优点，它具
有反应条件温和、工艺操作简单、无需基团保护、
清洁安全等优点，酶法制备头孢菌素在工业上有很
大的潜力[3-5]，生物酶的合成方法和路线具有一定的
社会效益和经济效益。

本文报道的酶法合成工艺是以7-氨基-3-脱乙酰氧
基头孢烷酸为母核，苯甘氨酸甲酯为酰基供体，固化
青霉素酰化酶为催化剂，催化合成头孢氨苄[6-7]。

本
工艺通过对反应投酶量、投料比、反应温度、pH、
反应时间及回收7-ADCA套用工艺参数的调整和控
制，7-ADCA转化率98%以上，回收的7-ADCA套用
后头孢氨苄摩尔收率91%以上。

1 实验材料和方法
1.1实验原材料
PGM由石药集团宏源化工提供、PGA由石药集
团中诺制药有限公司提供、7-ADCA由江苏九九久科
技股份有限公司(含量≥98.5%)提供。

1.2实验设备
B I O-2020生物反应器、自动电位滴定仪、
SIGMA高速离心机、BX-180循环冷冻机、高效液
相、SevenEasyPH计、真空干燥箱
1.3实验方法
1.3.1合成部分
(1) 酶催化合成
在合成反应罐中加入一定的合成酶；在溶解
罐中溶解7-ADCA，pH=7.5；将7-ADCA转移至合
成罐，PGM溶解液采用滴加方式，用浓NH
3·H
2
O
控制pH。

加完后用6mol/L盐酸和3mol/L氨水控制反应pH，用循环冷冻机控制反应温度，通过检测7-ADCA的转化率判断反应终点，转化率大于98%以上终止反应。

(2) 分离
通过反应器底部筛网进行头孢氨苄和固体酶的分离，用母液循环洗涤直至母液无白色物质。

(3)重结晶
滤饼溶于母液中，用浓盐酸溶解，温度20℃；溶解液过100μm滤纸后转移至结晶罐，用3mol/L氨水调晶。

一调PH=2.2~2.5 ，T=30~35℃，养晶30min；二调至PH=4.8~5.0，养晶3h。

(4) 抽滤、丙酮洗涤、45℃干燥2h后得头孢氨苄成品。

1.3.2结晶母液中过量7-ADCA回收[8]
(1) 裂解
酶法头孢氨苄重结晶母液在PGA作用下裂解，T=20℃，pH=8.0~8.3，反应90min，分离酶和回收苯甘氨酸(固体)。

(2) 裂解反应清液用分子量200的纳滤膜进行浓缩
(3)结晶：浓缩液脱碳后进行结晶，一调pH=4.5~4.7，养晶30min；二调pH=3.8~4.0，养晶2h。

(4) 抽滤，洗涤，干燥得7-ADCA粗品。

(5) 回收的7-ADCA进行下批头孢氨苄合成反应套用。

2 分析与讨论
在7-ADCA底物反应浓度一定的条件下，实验从投酶量、投料比、反应温度、反应pH及反应时间5方面考察各实验因素对头孢氨苄摩尔收率的影响，从而确定最为合适的酶法合成头孢氨苄的实验条件。

7-ADCA底物浓度定在600mmol/L。

2.1投酶量对合成收率的影响
PGM：7-ADCA为1.8，温度为20℃，PH7.0的条件下，每升反应液投酶量分别为1.4、1.6、1.8、2.0和2.2KU，检测7-ADCA的转化率判断反应终点，最终检测成品收率。

每个投酶量重复实验3批，取收率平均值进行比较。

结果显示投酶量在1.8KU/L时，头孢氨苄平均摩尔收率最高；进一步增加投酶量会加大侧链分解程度，降低摩尔收率(图1)。

2.2 PGM和7-ADCA投料比对合成收率的影响
在投酶量1.8KU/L，温度20℃，H=6.8的条件下，PGM:7-ADCA分别为1.0、1.2、1.4、1.6、1.8，检测7-ADCA的转化率判断反应终点，最终检测成品收率。

每个侧链加量重复实验3批，取收率平均值进行比较，结果显示PGM:7-ADCA=1.2:1时,头孢氨苄摩尔收率最高；若增加侧链投料比例，过多的侧链分解物抑制合成酶活力，合成反应收率反而降低(图2)。

2.3
酶催化合成反应温度合成收率的影响
图1投酶量对合成收率的影响
Fig.1 Effect of synthetic yield on amount of enzyme
酶法合成头孢氨苄工艺研究王艳艳等
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在投酶量1.8KU/L ，PGM:7-ADCA=1.2:1，pH6.8的条件下，合成反应温度分别为12、14、16、18和20℃ ，检测7-ADCA 的转化率判断反应终点，最终检测成品收率。

每个温度条件重复实验3批，取收率平均值进行比较，结果显示反应温度16℃，头孢氨苄摩尔收率最高；温度过低合成反应进行缓慢，底物转化慢；温度过高，侧链加速分解，影响合成酶活力及合成收率(图3)。

2.4 酶催化合成反应pH 对合成收率的影响
在投酶量1.8KU/L ，PGM:7-ADCA=1.2:1，T=16℃的条件下，合成反应pH 分别为6.2、6.5、6.8、7.0、7.2，检测7-ADCA 的转化率判断反应终点，最终检测成品收率。

每个pH 控制点重复实验3批，取收率平均值进行比较，结果显示反应pH 在6.2~6.5，头孢氨苄摩尔收率相对较高；合成酶的适宜PH 范围在6.0~7.0，在此合成反应中，反应PH 在6.5以上会加速侧链的分解速度，导致合成收率随pH 上升而下降(图4)。

2.5 酶催化合成反应时间合成收率的影响
在投酶量1.8KU/L 、PGM:7-ADCA=1.2:1、T=16℃、pH=6.2-6.5的条件下，合成反应时间分别为2.0、2.5、3.0、3.5和4.0h ，检测7-ADCA 的转化率判断反应终点，最终检测成品收率。

每个反应时间
控制点重复实验3批，取收率平均值进行比较，结果显示反应时间2.5h ，头孢氨苄摩尔收率最高；合成酶的反应达到平衡点后，随着反应时间的延长，头孢氨苄会在合成酶的水解作用下分解生成苯甘氨酸和7-ADCA ，合成收率下降(图5)。

2.6 摩尔收率稳定性实验
根据以上5个实验条件的实验结果进行筛选，确定合成反应条件为：反应底物浓度600mmol/L ，投酶量1.8KU/L ， PGM:7-ADCA=1.2:1，反应温度T=16℃，反应pH=6.2~6.5，反应时间2.5h 。

规定反应体积1L ，每批实验7-ADCA 投料量为128.55g ，PGM 投料量为145.2g 进行摩尔收率稳定性实验5批(表1)。

按照已经确定的工艺进行重复性实验，酶法头孢氨苄的摩尔收率均在85%以上，平均收率能达到85.9%。

图2 侧链：底物投料比对合成收率的影响Fig. 2 Effect of synthetic yield on side chain and
substrate feed ratio
图3 反应温度对合成收率的影响
Fig. 3 Effect of synthetic yield on temperature
图4 反应pH 对合成收率的影响Fig. 4
Effect of synthetic yield on pH
图5 反应时间对合成收率的影响
Fig. 5 Effect of synthetic yield on reaction time 表1 头孢氨苄摩尔收率实验数据结果
Tab. 1 The results of the experiment data of cephalexin
molar yield
实验批次
7-ADCA 转化率/%
氨苄质量/g 摩尔收率/%
199.1187.6785.6298.7186.5785.1399.5189.2086.3499.7190.7487.0599.0187.2385.4平均值
99.1
188.28
85.9
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2.7母液回收的7-ADCA套用对头孢氨苄摩尔收率的影响
反应条件：反应底物浓度600mmol/L，投酶量1.8KU/L， PGM:7-ADCA=1.2:1，反应温度T=16℃，反应pH=6.2~6.5，反应时间2.5h，反应体积1L，每批7-ADCA总投料量为128.55g。

用上批母液回收的7-ADCA进行套用，7-ADCA套用比例大约为10%。

计算摩尔收率时的7-ADCA的量以7-ADCA的总投料量和回收7-ADCA投料量的差值计算，酶法头孢氨苄的摩尔收率在91%以上(表2)。

7-ADCA回收套用后，头孢氨苄的摩尔收率能达到91%以上，平均收率91.8%。

3 结论
综合以上实验因素：酶法合成头孢氨苄的实验条件为投酶量1.8KU/L ，PGM:7-ADCA=1.2:1，反应温度T=16℃，反应pH=6.2~6.5，反应时间2.5h，头孢氨苄摩尔收率最高。

经PGA裂解母液回收7-ADCA，与用β-萘酚回收7-ADCA的回收率相当，回收率可达85%，回收的7-ADCA按一定比例投入酶催化合成反应，酶法头孢氨苄的摩尔收率可达91%以上，该收率远高于目前国内化学法生产的收率(89%)，成品含量≥98.5%，各项检验指标符合标准。

表2从母液中回收套用7-ADCA的实验数据结果
Tab. 2 The results of the experiment data of 7-ADCA from mother liquor was recycled
实验批次回收7-ADCA投料量/g纯7-ADCA投料量/g氨苄质量/g摩尔收率/% 111.84116.71181.7391.3 212.02116.53183.0492.1 311.78116.77182.1391.5 412.18116.37182.5391.8 512.01116.54183.8592.5
平均值11.98116.58182.6691.8
酶法合成头孢氨苄方法在辅料和工艺上均区别于传统的化学合成方法，反应过程中避免使用吡啶、特戊酰氯、N, N二甲基甲酰胺(DMF)等有毒有害物质，且工艺路线简单，反应条件温和；母液回收过程中使用酶法裂解回收7-ADCA工艺替代头孢氨苄和β-萘酚形成复盐后的分离工艺，避免了β-萘酚和二氯甲烷的回收；回收套用后头孢氨苄摩尔收率比化学法工艺提高2%，新的酶法合成工艺既降低了生产成本也降低了环保压力，属于绿色环保工艺。

酶法合成头孢氨苄代替化学法合成工艺也将会对酶法合成抗生素的发展产生深远影响[9] 。

目前，酶法合成头孢氨苄工艺中，有3个重要因素对酶法合成头孢氨苄的摩尔收率有很大影响，第一，合成酶的S/H比有待进一步提高，目前，合成酶的S/H比值在5:1，若能进一步提高合成酶的合成活力同时降低水解活力，合成过程中侧链分解就会减少，就可以进一步降低侧链投料比例；第二，在进行固体酶和头孢氨苄粗品的分离时，由于料液本身发粘，用筛网分离时间较长，在分离过程中，部分粗品头孢氨苄又分解为苯甘氨酸和7-ADCA，若能缩短分离时间，也能降低头孢氨苄粗品损失率；第三：7-ADCA回收过程中需要进一步考察纳滤浓缩实验条件，以提高侧链的回收率，提高7-ADCA回收套用后的摩尔收率。

若以上3个影响因素能得到提高，酶法合成头孢氨苄的摩尔收率将会有新的突破。

参 考 文 献
[1] Biocarft Laboratories, Inc. Process for preparing cephalexin
monohydrate[P]. WO: 9117166, 1999-11-14.
[2] Diago J, Ludescher J. Beta lactam production[P].
US:5719276, 1998-02-17.
[3] 武田药品: 公开特许公报1 昭532107484.
[4] Maladkar N K. Enzymatic production of cephalexin[J].
Enzyme Microb Technol, 1994, 16 (8):715.
[5] Rhee D K, Lee S B, Rhee J S, et al. Enzymatic biosynthesis
of cephalexin[J]. Biotechnol Bioeng, 1980, 22 (6) : 1237. [6] Boesten W H J, Moody H M. Process for the enzymatic
preparation of a beta lactam derivative[P] . WO: 9503420, 1995-02-02.
[7] Boesten W H J, Roos E C ,Van Den Tweel W J J. Process for
the recovery of cephalexin[P]. WO: 9623796, 1996-08-08. [8] Zenoni M. Process for the enzymatic synthesis of beta
lactam antibiotics in the presence of an enzyme inhibitor[P].
EP: 0730036A, 1996-04-09.
[9] 郭丰文. 环境保护呼唤绿色化学制药工业(下)[J]. 中国制
药信息, 1999, 15(9) 3-13.
酶法合成头孢氨苄工艺研究王艳艳等。