蛋白质的研究方法

在部分情况下，当去污剂被透析掉后，蛋白质可 以复性并恢复生物活性。
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SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSpolyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）：
就是利用SDS的这种结合在整个蛋白分子上，并 使蛋白完全变性的特性。
这样经过SDS变性的蛋白质在电场中完全按大小 分离开。
有的去污剂不能解离，所以分子中缺少带电基团， 如：
Triton X-100， 辛基葡萄糖苷( octylglucoside）
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临界微团浓度（critical micelle concentration，CMC)： 每一种去污剂都具有一特征性的CMC。
CMC值与其分子中疏水部分与亲水部分的结构有 关。
一般选择非离子去污剂来保持膜蛋白生物活性 22
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四、蛋白分子的稳定
防止蛋白质分子可能被同时释放的蛋白质水解酶降 解、Pr空间结构可能被温度或化学试剂等环境因素 破坏而丧失生物学活性等。
处理：需要在缓冲液中加入蛋白酶抑制剂； 在低温下操作； 加入稳定剂(如甘油等）．
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五、细胞碎片的去除——离心( centrifugation)
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膜蛋白的处理：复杂
细胞膜的结构
按其所在位置大体可分为：
两种类型 外周蛋白（通过次级键和外膜脂质的
极性头螯合在一起）
固有蛋白
外周蛋白---选择适当离子强度及PH的含有EDTA的
缓冲液抽提（高盐溶液）
固有蛋白---嵌合在膜双层中，它通过疏水作用与
膜内部脂质层的疏水性尾部相结合，
具有α螺旋结构。
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原理：悬浮在溶液中的两个或多个不同质量或密度 的颗粒（如细胞、细胞器、大分子复合体、或分子 等）沉降到试管的底部的速度是不一样的，质 量越大、或密度越高沉降的速度越快。
法） 3.应用层析法或电泳法使它们各自分开； 4.蛋白质结晶； 5.蛋白质纯度鉴定和含量测定。
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根据基因组测序获得的信息 （1）可以获得所要研究的特定蛋白质的AA序列。
先根据推出的AA序列合成对象蛋白中的一段肽，用它 去获 得有关的抗体，然后用抗体去探测蛋白质的存在， 甚至可以用抗体通过亲和层析纯化对象蛋白
2. 通常都在低温条件下操作。 3. 尽可能使样品中蛋白质的浓度维持在较高
水平。
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二、细胞的破碎
少数蛋白质---存在于细胞外面（如血液和体液中） 大多数蛋白质---都存在于细胞的里面。
一般固形生物材料首先都必须加以破碎，以释放出细
胞内的蛋白质组分。
生物材料 必须新鲜
要求：
1. 材料 -80℃
2. 或者制成干粉（丙酮）
从模式生物基因组测序结果来看，每一种生物有机体 内都还有大量的蛋白质（50％左右）从来没有被研究 过。
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获取蛋白样品的方法： 直接从生物组织中提纯蛋白—为主 根据基因组测序获得的信息
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应用各种分辨效果好的化学及物理化学 方法
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直接从生物组织中提纯蛋白—— 蛋白质的分离纯化包括以下过程：
1.破碎生物组织，并用适当的缓冲液将蛋白质抽提出来； 2.将有关的蛋白质分级沉淀下来; （盐析法或有机溶剂
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非离子去污剂：
相对温和，一般不会使蛋白质变性。只是将蛋白质 分子从膜上溶解下来而已。
➢当[去污剂]＜其CMC值的时候，去污剂分子与膜蛋 白表面的疏水区域结合，使蛋白质在水溶液中溶解 而不聚集。 ➢当[去污剂]≧其CMC值的时候，去污剂分子将与膜 磷脂一起形成混合微团，膜蛋白以整合在微团中的 形式存在。
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3.交替冻融法：
生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀 而使细胞胀破。
4.超声波法：
利用超声波震荡，使细胞膜上所受张力不均而解 体。
5.酶消化法：
利用蛋白酶、溶菌酶、蜗牛复合酶等对 细胞膜或细胞壁的分解作用，使它们解体
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三、去污剂处理溶解膜蛋白
膜蛋白的提取与细胞质蛋白，核蛋白提取不同之 处在于它是嵌在膜中的，水溶性不好，基本方法 就是用不同的离心速度去掉胞质蛋白等，最后用 去污剂把蛋白从膜中释放出来。膜蛋白分离纯化 的重要步骤是选择适当的增溶用表面活性剂
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（2）去获得有关基因的cDNA全序列，然 后通过重组DNA技术去表达重组蛋白。
有偏差，甚至完全是假象。 即使推测得到的蛋白质编码信息是对的，在细胞 内还存在转录后的RNA加工，翻译后的蛋白质的 修饰和加工等基因序列上目前还无法反映的信息。
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制备过程中注意事项：
要求自始至终保持在天然状态
1. 避免一切过激因素--如过酸或过碱，高温， 重金属等的影响。
3. 低温存放
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破碎的方法：
1. 机械破碎法：
利用机械力的搅切作用，使细胞研碎
高速搅切器、玻璃匀浆器、家用搅肉器、研钵、
玻璃珠高速匀浆器以及静压器（高压破碎）。
2.渗透破碎法：
利用低渗条件，使细胞溶胀破碎。
红血球放于水中，便发生自溶。
*抽提作用：
生物材料在破碎的过程中，通常被浸在 适当的缓冲液中，使细胞中的蛋白质等内容 物释放到这种溶液中去。
当[去污剂]低于此值的时候，去污剂分子在水溶液中 将不形成微团，达到此值的时候，微团开始形成。
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离子化去污剂（SDS）：
其“疏水尾巴”破坏蛋白质分子的疏水性部分的 结构，其带电的“头部”破坏蛋白质分子中的氢 键和离子键。
作用的结果是： 使任何蛋白（不管是膜蛋白还是水溶性蛋白）
都发生完全变性，并溶解在水溶液中，同时失去 生物活性。
去污剂：
一类具有 亲水性头部 疏性尾巴 的双亲性（amphipathic）脂类分
子
作用： 既可以破坏细胞的磷脂双层结构，又可以与具有疏
水性表面的膜蛋白结合，从而阻止释放出来的膜蛋白 通过疏水相互作用形成大的、可沉淀的聚集体。
有的去污剂的亲水性头部可离子化（即含有一带电 基团） 如：
脱氧胆酸钠（sodium deoxycholate） 十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate，SDS）
蛋白质对象的选择和样品的 获取
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一、研究对象的选择
无论何种来源的生物材料一般都含有成千上万种不同 的蛋白质分子； 在一种生物组织中，同时又存在着多种蛋白质组分。 虽然它们都具有肽链结构，但在分子大小、极性以 及电荷上会有所差异。
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选择研究蛋白的原则：
➢ 在组织中含量比较高
➢ 相对比较稳定的蛋白质（如血液中的Hb；肌肉中的 肌球蛋白和肌动蛋白等）