金属螯合亲和层析技术及其应用
金属螯合亲和层析介质用于六聚组氨酸融合蛋白的纯化研究
李淑娟等：金属萱台亲和层析介质用于六聚组氨酸融台蛋白的纯化研究度测定结果可粗略计算：２００血裂解液纯化后所得ｃＤｌ５５Ｄ１融合蛋白量约为２００旭。
２．５ｃｏ．ｃＭ．Ａｓｐ－ｓｅｐｈａｒ∞ｅ用于六聚组氨酸融合蛋白大量纯化的初步研究根据小量纯化的优化条件，将介质体积放大２５倍纯化六聚组氨酸融合蛋白ｃＤｌ５５Ｄｌ，取５０％的ｃｏ－ｃＭ．Ａ叩一ｓｅｐｈａｒ姻ｅ悬浮液１．５ｍＬ与５ｍＬ含ｃＤｌ５５Ｄｌ的细胞裂解液孵育，ｃｏ．ｃＭ．Ａ８ｐ．ｓ８ｐＩｌ哪ｓｅ悬浮液装入层析柱中，洗柱后用５ｍＬ含２００ｍｍｌ，Ｌ咪唑的ｃ液洗脱蛋白，收集洗脱液５ｍＬ。
用Ｂｍｄ州法测定蛋白浓度并计算可知蛋白质总量为４．６ｎ蜗。
２．６Ｃｏ・ＣＭ－Ａｓｐ．ｓｅｐｈａｒｏ辨与Ｎｉ・ＮＴＡ・Ａ辨ｒｏ辨的比较将ｃｏ．ｃＭ．Ａｓｐ—ｓｅｐｈ删ｓｅ与商品化Ｎｉ—Ｎ１俳Ａｇａｒｏｓｅ进行蛋白纯化的比较，取５０％的ｃｏ－ｃＭ．Ａ８ｐ．ｓｅｐｈａｌｏｓｅ悬浮液和５０％的Ｎｉ．ＮＴＡ．Ａ静ｒｏ特悬浮液各６０皿分别与２００ｆｔＬ含六聚组氨酸融合蛋白ｇｐ４ｌ（分子量３６ｋＤ）的细胞裂解液孵育，并按各自清洗溶液对介质清洗后洗脱蛋白，对纯化后的剩余液和洗脱液进行ｓＤＳ．ＰＡＧＥ，结果如图６所示。
从图６中可看出经ｃ０．ＣＭ．Ａｓｐ．ｓｅｐｈａｒｏ∞与Ｑｉａｇｅｎ公司的Ｎｉ．Ｎ１ｒＡ．Ａ∞”介质纯化后剩余液中蛋白质的组成几乎一样，洗脱得到卵４１蛋白的量相当，说明两者蛋白结合容量差别不大。
但是，以Ｎｉ．ＮＴＡ．Ａ朗ｆ０８ｅ纯化后的洗脱液电泳结果中可见有少量杂蛋白的条带，而且与ｃｏ．ｃＭ．Ａｓｐ．ｓ印ｈａｒ∞ｅ相比，Ｎｉ，ＭｒＡ．Ａｇ啪眈介质纯化后剩余液泳道中杂蛋白减少较多，说明有较多的杂蛋白非特异性结合到Ｎｉ．ＮＴＡ．Ａｇｍ”介质上，便影响了纯化后所得蛋白的纯度。
这与文献中报道含镍螯台介质可与不含六个组氨酸残端的蛋白结合，因而会表现出一定非特异性吸附的结果一致““。
而以ｃｏ－ｃＭ．Ａｓｐ．ｓｅｐｈａｒｏｓｅ纯化的洗脱液电泳条带中不存在杂蛋白，可见ｃｏ—ｃＭ．Ａｓｐ．ｓｅｐｈａｍｓｅ对融合蛋白选择性高，非特异性吸附降低，因而表现出较好的纯化效果。
金属螯合亲和层析纯化和复性重组人铜锌超氧化物歧化酶
!(,,%1% (- 3#-% 40#%$0%& ，5%6%# 7$#8%*&#/2 ，.+(9#$1 $M"$$! ，!"#$+
摘
要
将重组人铜锌超氧化物歧化酶 （ />J5， 包含体 （经纯化后纯度达 K$Z 以上） 以稀释法或透析法初步复性后， 分 UBLFVY）
然清除剂， 是一种广泛存在于动植物和微生物中的金属酶， 在医药、 化妆品、 日化及食品等方面都有广泛的应用， 尤其在 临床应用中对于治疗氧中毒、 皮肤病、 心血管病和防止缺血
［!］ 再灌流综合征及抗辐射损伤等方面具有重要的功能 。研
制开发重组人超氧化物歧化酶不仅可解决人源 +23 的材料 来源有限和因血制品污染而带来的安全性问题， 而且可避免 异源 +23 在临床应用时可能出现的免疫性过敏反应。国内 外已有不少采用 /’,’ 纯化各种不同来源 +23 包括可溶性
中图分类号
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（ />J5， V+,/,‘8/,;;2’B ’C /,1’-.2BAB9 H5-AB J5， UBLF58,/’‘23, Y2;-59A;, UBLFVY）2B : ) 0(,# /,;5(9; 2B 9>, C’/- ’C
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纯泰镍离子金属螯合亲和层析介质(Ni-NTA)使用说明书(完全版)[1]
![纯泰镍离子金属螯合亲和层析介质(Ni-NTA)使用说明书(完全版)[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/274baf4ec850ad02de8041eb.png)
mM Tris·Cl，用高浓度HCl调节pH至6.3。 z 缓冲液G： 8 M Urea，100 mM NaH2PO4，100
mM Tris·Cl，用高浓度HCl调节pH至4.5。 各种溶液配制完毕后，最好进行脱气处理，0.45 μm滤膜过滤备用。 注：也可按照可溶性蛋白的缓冲液配制与操作方式 进行，只需在缓冲液中加入8M脲或6M盐酸胍。
让介质自然沉降。
3) 从上端管口将另一垫片缓慢推至介质沉降平
面，使介质表面保持水平状态，注意避免垫片
与介质接触面滞留气泡（如对实验要求并非十
分严格，为提高流速，可不覆盖上垫片）。
4) 在使用一段时间后，如果层析柱流速减慢，可
先用小镊子沿边缘将垫片推翻，夹出垫片，倒
出介质，清洗或更换新的垫片后，按2）、3）所
层析柱中；静置30min，让介质自然沉降。
3) 从上端管口将转换杆出液端缓慢推至介质沉降
平面，使介质表面保持水平状态，注意避免转
换杆与介质接触面间滞留气泡。
4) 在使用一段时间后，如果流速减慢，可先卸下
上转换杆，将介质倒出，再取出下转换接头中
滤网，清洗或更换后重新装柱。
4. 过柱：
1) 用5~10倍介质体积的缓冲液A平衡亲和柱；
六、 实验实例
1. Ni-NTA Agarose 纯化 His-tag 蛋白 z 层析介质：纯泰®NTA 1ml；对照介质（国际领
先品牌）1ml z 样品：表达可溶性 His-tag 融合 thioredoxin 的
大肠杆菌 BL21 裂解液 z 结合缓冲液：10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，
3. 操作步骤：
金属螯合亲和层析分离蛋白质的研究
!"卷#期$%%%年&月生物工程学报!"#$%&%’()*$+,(-.#(/%0"$(,(12’()*!"+(*#,-).!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!$%%%金属螯合亲和层析分离蛋白质的研究孙旭东李红旗隋洪艳沈忠耀（清华大学化工系北京!%%%1#）摘要金属螯合亲和层析是近$%年发展起来的一项新型分离技术。
它以配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强等特点，逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一。
本文从单组分蛋白质入手，考查了23值、铵离子浓度、不同铵盐等对蛋白质洗脱的影响，并进行了分析。
还对不同的金属螯合柱和不同性质蛋白质的洗脱性能进行了研究，比较了不同金属离子与蛋白质亲和力的区别，为实际体系的分离研究打下了基础。
关键词金属螯合亲和层析，牛血清白蛋白，血红蛋白，分离中图分类号41!5文献标识码6文章编号!%%%07%"!（$%%%）%#0%#/50%5金属螯合亲和层析，又称固定化金属离子亲和层析（899(:;);<=>?=@A)8(B6C C;B;@.D E F(9A@(0 G F A2E.，简称8?6D），是近$%年发展起来的一项新型分离技术。
最早由H A F(@E等人［!，$］提出。
该方法利用蛋白质表面的一些氨基酸，例如组氨酸、色氨酸、赖氨酸等能和金属离子发生特殊的相互作用的原理，从而对蛋白质加以分离［7］。
由于它具有配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强等特点，逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一［#］。
本文主要以单组分蛋白质牛血清白蛋白（I J6）和血红蛋白为研究对象，考查了23值、铵离子浓度及阴离子等不同洗脱条件对出峰时间的影响。
对不同的金属螯合柱的性能和不同单组分蛋白质的洗脱性能进行了研究，比较了不同金属离子与蛋白质亲和力的区别，为实际生物产品的分离奠定了基础。
纯泰镍离子金属螯合亲和层析介质(Ni-NTA)使用说明书(完全版)[1]
1) 冰上融化冻存菌体，待其完全融化后按每克湿 重菌体/5ml缓冲液E的比例充分悬浮菌体。
2) 室温条件下振摇菌体15～60min，通过温和涡旋 振荡或超声处理裂解菌体，注意避免产生泡沫。 溶液变得透明表明裂解完全。
3) 4℃、13000rpm离心15min，收集上清液或用 0.45μm滤膜过滤，并用高浓度NaOH调节 pH至 8.0待上样。
按每克湿重菌体/4~5ml缓冲液A的比例充分悬
-1-
浮离心收集的菌体，400w功率下，每个循环超声3s， 冷却2s，共循环180次破碎菌体；4℃、13000rpm离 心15m，收集上清液或用0.45μm滤膜过滤，并用高 浓度NaOH调节 pH至8.0待上样。
3. 装柱：
z 聚苯乙烯层析柱
1) 将层析柱固定在铁架台或层析架上，封闭层析
2) 上样；
3) 用5~10倍介质体积缓冲液A洗去层析柱中未结
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3. 操作步骤：
1.低分子量 Marker； 2.上样液； 3.纯泰®NTA-流穿液； 4.纯泰®NTA-洗脱液； 5.对照-流穿液； 6.对照-洗脱液
2. Ni-IDA Agarose 纯化 His-tag 蛋白 z 层析介质：纯泰®IDA 1ml；纯泰®NTA 1ml z 样品：表达 His-tag 融合 thioredoxin 的大肠杆
网址：
合蛋白； 4) 用缓冲液B和缓冲液C配制的不同浓度缓冲液D
ida金属螯合亲和层析介质
ida金属螯合亲和层析介质引言：ida金属螯合亲和层析介质是一种重要的生物分离技术，广泛应用于生物医学、生物化学和生物工程等领域。
它是通过金属离子与靶分子之间的特异性配位作用，实现对靶分子的高效分离和纯化的方法。
本文将介绍ida金属螯合亲和层析介质的原理、制备方法、应用领域及发展前景。
一、ida金属螯合亲和层析介质的原理ida金属螯合亲和层析介质的原理基于金属离子与靶分子之间的特异性配位作用。
ida（亚铁二胺四乙酸）是一种广泛应用的金属螯合剂，它能够与多种金属离子形成稳定的配合物。
通过将ida固定在载体上，可以构建ida金属螯合亲和层析介质。
二、ida金属螯合亲和层析介质的制备方法制备ida金属螯合亲和层析介质的方法主要包括固定化ida的选择、载体的选择和固定化方法的选择。
固定化ida时，可以选择将ida 直接固定在载体上，也可以选择使用交联剂将ida与载体交联。
常用的载体包括琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等。
三、ida金属螯合亲和层析介质的应用领域ida金属螯合亲和层析介质在生物医学、生物化学和生物工程等领域有广泛的应用。
在生物医学领域，ida金属螯合亲和层析介质可用于药物分离纯化、疾病诊断和治疗等方面。
在生物化学领域，ida 金属螯合亲和层析介质可用于蛋白质纯化、酶分离和多肽合成等方面。
在生物工程领域，ida金属螯合亲和层析介质可用于基因工程药物的纯化和制备等方面。
四、ida金属螯合亲和层析介质的发展前景ida金属螯合亲和层析介质作为一种高效、选择性的分离技术，具有广阔的发展前景。
随着生物医学和生物工程领域的不断发展，对高纯度生物分子的需求越来越大，ida金属螯合亲和层析介质作为一种有效的分离工具将会得到更广泛的应用。
同时，随着新型材料和新型固定化方法的不断涌现，ida金属螯合亲和层析介质在分离效率和选择性上将会有更大的突破。
结论：ida金属螯合亲和层析介质是一种重要的生物分离技术，通过金属离子与靶分子之间的特异性配位作用，实现对靶分子的高效分离和纯化。
镍离子金属亲和层析柱在蛋白质纯化中的应用2
镍离子金属亲和层析柱在蛋白质纯化中的应用摘要：蛋白质纯化是进行基因工程中最重要的环节，选取纯化蛋白的工具对纯化结果影响巨大。
镍离子亲和层析柱具有特异性高、纯度高、成本低、产量大等优点，镍离子亲和层析柱的国产化将极大促进蛋白质纯化产业的发展并会产生巨大的市场效益。
关键词：镍离子亲和层析柱、蛋白质纯化、国产化亲和层析（Affinity chromatography，AC）是利用生物大分子和固定相表面的亲和配基之间可逆的特异性相互作用，进行选择性分离的一种液相层析分离方法。
常用的亲和层析方式为金属螯合亲和层析,又称固定化金属离子亲和层析( Immobilized metal lchelated affinity chromatography, IMAC)，利用金属离子(Ni2+，Cu2+等)与氨基酸表面的残基(如组氨酸的咪唑基)的配位鳌合作用，来纯化与金属离子有亲和作用的蛋白质。
由于IMAC 具有螯合介质制备简单方便，吸附容量大，选择性及通用性较好，易于再生，成本低等优点, 逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一。
镍离子亲和层析柱成为金属螯合亲和层析的代表产品。
目前，国外有3-4家镍离子亲和层析柱产品在国内销售，但价格昂贵，国内已有数家公司开展了镍离子亲和层析柱产品的销售，其中，广州精达公司采用最新的镍离子亲和层析柱的制备技术，顺利完成了该种产品的国产化。
I、镍离子亲和层析柱的制备工艺1、Ni2+吸附融合蛋白原理Ni柱中的氯化镍或者硫酸镍可以与有His（组蛋白）标签的碱性蛋白结合，组蛋白标签一般是6个组氨酸（碱性氨基酸）。
同时Ni柱中的氯化镍或者硫酸镍也可以与咪唑结合，利用咪唑梯度洗脱，从而获得纯度较高的融合蛋白。
而利用基因工程技术制备的融合蛋白常携带6个组氨酸的标签，因6个组氨酸标签因肽片段小，故对目标蛋白质的生物活性影响较小，因此被广泛用于重组蛋白的制备及纯化。
2、固相载体的选择常见的固相载体包括为普通琼脂糖颗粒及GE公司生产的Sepharose琼脂糖系列产品。
千纯 镍ni nta螯合亲和琼脂糖层析介质
千纯镍nta螯合亲和琼脂糖层析介质是一种用于蛋白质纯化的重要工具，在生物技术领域广泛应用。
本文将从其原理、特点、应用以及未来发展方向等方面进行介绍和分析。
一、原理千纯镍nta螯合亲和琼脂糖层析介质的原理主要是利用镍离子与蛋白质中的组氨酸残基结合的特性，实现对蛋白质的选择性结合和分离。
在琼脂糖基质的支持下，镍nta螯合亲和层析介质可以与目标蛋白质发生专一性结合，并通过洗脱等步骤实现对蛋白质的分离纯化。
二、特点1.高选择性：镍nta螯合亲和层析介质具有较高选择性，能够与蛋白质中的组氨酸残基结合，实现对目标蛋白质的有效分离。
2.良好的生物相容性：介质材料琼脂糖在生物体内具有良好的生物相容性，不会对生物体产生毒副作用。
3.稳定性：介质具有良好的稳定性，可以承受一定的流速和压力，适合于在不同操作条件下进行蛋白质的层析纯化。
三、应用千纯镍nta螯合亲和琼脂糖层析介质在生物制药、基因工程、生物化学等领域有着广泛的应用，主要体现在以下几个方面：1.蛋白质纯化：通过千纯镍nta螯合亲和琼脂糖层析介质可以实现对蛋白质的高效分离和纯化，为后续的生物学研究和药物开发提供优质的蛋白质样品。
2.蛋白质结构分析：可用于蛋白质的结构研究和功能分析，为了解蛋白质的结构和功能提供有效手段。
3.抗体制备：可用于从复杂混合物中纯化目标抗体，为抗体制备提供技术支持。
四、未来发展方向千纯镍nta螯合亲和琼脂糖层析介质作为一种重要的蛋白质纯化工具，其未来发展方向主要有以下几个方面：1.多功能化：将其与其他螯合亲和剂结合，开发出具有多功能性能的层析介质，实现对不同类型蛋白质的快速纯化。
2.自动化：结合自动化技术，实现对层析过程的自动控制，提高工作效率和操作便捷性。
3.高通量：发展高通量的层析介质，满足大规模蛋白质纯化的需求。
千纯镍nta螯合亲和琼脂糖层析介质作为一种重要的蛋白质纯化工具，在生物技术领域具有重要的应用价值，并且其具有良好的发展前景。
金属螯合预装柱5ml说明书-Ni-20120202
金属螯合预装柱（5ml）说明书1. 简介金属螯合亲和层析，又称固定化金属离子亲和层析（Immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC）。
该法利用蛋白质表面的某些氨基酸（如组氨酸、色氨酸、半胱氨酸等）和金属离子（Cu2+、Zn2+、Ni2+等过渡金属离子）发生特殊的相互作用的原理，从而实现蛋白质的分离。
琼脂糖金属螯合介质（Ni-IDA QZT 6FF）是将亚氨基二乙酸（IDA）键合在高流速、高强度的琼脂糖微球上，并螯合金属离子Ni2+而形成的一种亲和层析介质，广泛用于蛋白质、核酸及多肽，尤其是组氨酸标签蛋白质的分离纯化。
2. 产品概述金属螯合预装柱预装了5 ml的Ni-IDA QZT 6FF亲和介质，可直接用于组氨酸标签蛋白质等生物分子的分离纯化，具有使用方便、操作简单、分离纯化效率高的特点。
Ni-IDA QZT 6FF亲和介质具有良好的稳定性、生物相容性和溶剂相容性，这不仅有利于保持产品的生物活性和提高产品的收率，还有利于扩大层析操作条件的选择范围。
Ni-IDA QZT 6FF亲和介质的理化性质和溶剂相容性分别如表1和表2所示。
表1. Ni-IDA QZT 6FF预装柱的理化性质及特征参数参数指标基质6%交联琼脂糖凝胶配基-N(CH2COOH)2 (IDA)形状球形平均粒径90 μm (45~165)金属离子密度~40 μmol Zn2+/ml wet gel动态载量a~25-30 mg蛋白(LDH)/ml wet gel柱体积1ml或5ml柱尺寸（内径x高度）0.9*1.57 cm (1ml柱子) 0.9*1.57 cm (5ml柱子)推荐流速b1ml/min (1ml柱子)或5ml/min (5ml柱子)地址：北京市海淀区中关村北二条1号中国科学院过程工程研究所最高流速b4ml/min (1ml柱子)或20ml/min (5ml柱子) 最高耐压b0.3 MPa (3 bar)化学稳定性c 避免使用的试剂0.01M HCl、0.1 M NaOH（37 °C, 7天）；1M NaOH、70%乙酸（12 h）；30%异丙醇（30 min）；2% SDS（1 h）螯合剂，如EDTA、EGTA、柠檬酸等pH稳定性c2-14（短期，2 h）；3-12（长期，7天）储存条件20%乙醇，4-30 o C动态载量a：样品：平衡缓冲液中含1mg/ml histidine-tagged LDH（Mr 140000）；计算方法：根据10%穿透点计算介质动态载量（Q B, 10%）；柱体积：1 ml或5 ml；流速：0.5 ml/min或2.5 ml/min；平衡缓冲液：20mM PB + 0.1M NaCl + 50 mM 咪唑, pH 7.4；洗脱缓冲液：20mM PB + 0.1M NaCl + 0.5 M 咪唑, pH 7.4；注意：动态载量与蛋白种类和操作条件密切相关。
几种柱层析的特点
简述几种柱层析的特点作者：张弓【摘要】柱层析技术在近几十年得到了广泛的应用和不断地发展，已成为各行各业离不开的重要技术。
本文就其中几种常用的柱层析的特点做了综述。
【关键词】凝胶过滤柱层析离子交换柱层析疏水作用柱层析亲和柱层析金属螯合层析在过去的三十年中,分离生物大分子的各种技术和方法得到了不断的发展。
随着各种介质的完善和商品化,使以填料为核心的柱层析技术在蛋白质等粗提后的纯化中起到了重要作用。
本文总结了几种柱层析的特点：一，凝胶过滤柱层析（Gel Filtration Chromatography, GFC）GFC是以分子大小和形状为分离基础的。
具体说就是利用不同大小分子通过凝胶滞留时间的差别来分离混合物的柱层析方法。
另外一种说法是分离是以分子体积的大小为基础的,分子体积即分子溶剂化后的体积,受分子形状和相对分子质量两方面因素的影响。
有时加入变性剂（尿素、盐酸胍等）以破坏蛋白质的三、四级结构,可以使分离主要受控于相对分子质量的大小。
GFC特别适用于分离相对分子质量大于2000的高分子化合物和相对分子质量差异大的混合物及低聚物。
GFC的分离不依赖于流动相和固定相的相互作用,所以不必使用梯度洗脱。
但是由于电荷屏蔽的因素,为了降低填料与生物分子之间的相互作用,往往会适当提高盐浓度,至少高于0.05 mol/LNaCl。
由于试样在柱中的保留时间不会超出柱中溶剂的总体积(Vt) ,所以不会出现在其他液相色谱中经常出现的由于色谱峰的弥散而引起的检测极限。
GFC的容量通常由流动相效应来控制。
由于GFC的分离靠大小组分流程途径长短之差达到分离,柱要有足够的长度(75～100 cm ,)但由于微小的粒子在GFC也有扩散的效应,柱子又不可过长,上样量不可过多(< 20 % Vt)。
因为GFC 洗脱时间可粗略估计,所以再隔一定时间连续进样,提高柱的使用效率,缩短纯化周期。
除了以上特点外,GFC还有回收率较高,洗脱条件温和,不易发生副反应,使用寿命较长,同时可用作换盐等特点。
铁离子螯合亲和层析分离抗氧化活性核桃肽
Ｊ ａ ｎ ． ２ ０ １ ３
铁离 子螯合 亲和层 析分 离抗 氧化 活性核桃肽
吕 莹 刘 静 陈湘 宁
（ 农 产品有 害微生物及农残 安全检 测与控制北 京市重点 实验室 北京农学 院食品科学 与工程学院 ， 北京 摘 要 １ ０ ２ ２ ０ ６ ）
采 用铁 离子 螯合 亲和 层析 方 法分 离出具 有 不 同抗 氧化 活 性 的核桃 肽 ， 并探 讨 核桃 肽 的抗 氧 化 活
１ 材 料 与 方 法
１ ． １ 材料
１ ０ ％和 １ ３ ． ２ ２ ％ ， 具有 与金属离子螯合的可能性。 但 目前 有 关核 桃 肽抗 氧化 活性 的研究 多 集 中在核 桃
蛋 白酶解 条件 优 化 、 酶解 工 艺 的确定 上 ， 而有 关 核 桃 肽 的金 属 离子 螯 合 能力 与其 抗 氧 化 活性 的相关 性 鲜
肽 的铁 结合 能力越 强 ， 其抗 氧化 活性 越 高 。 关键 词 核桃 肽 铁 结合 能力 抗 氧化 文 献标 识码 ： Ａ 铁 离子 螯合 亲和层 析 文 章编 号 ： １ ０ ０ ３— ０ １ ７ ４ （ ２ ０ １ ３ ） ０ １— ０ ０ ６ ５— ０ ５ 中 图分类 号 ： Ｔ Ｓ ２ ５ ５
网络 出版 时 间 ： ２ ０ １ ２— ０ ８— ２ ９ １ ０： ３ ０ 网络 出版地 址 ： ｈ ｔ ｔ ｐ： ／ ／ ｗ ｗ ｗ ． ｃ ｎ ｋ ｉ ． ｎ ｅ ｔ ／ ｋ ｃ ｍ ｓ ／ ｄ ｅ ｔ ａ ｉ ｌ ／ １ １ ． ２ ８ ６ ４ ． Ｔ Ｓ ． ２ ０ １ ２ ０ ８ ２ ９ ． １ ０ ３ ０ ． ０ ０ ４ ． ｈ ｔ ｍ ｌ
２ ０ １ ３年 １月
中国粮油学报
Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ Ｃ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ Ｃ ｅ ｒ ｅ ａ ｌ ｓ ａ ｎ ｄ Ｏ ｉ ｌ ｓ Ａｓ ｓ ｏ ｃ ｉ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ
蛋白质纯化柱-ni
网址：
合蛋白； 4) 用缓冲液B和缓冲液C配制的不同浓度缓冲液D
洗脱； 9 最高纯度洗脱方案：用含0、60、100、150、
200、250mM 咪唑的缓冲液D分步洗脱，每 个梯度2~3倍介质体积洗脱； 9 最高收率洗脱方案：先用5~10倍介质体积 含20mM咪唑的缓冲液D洗脱，再用5~10倍 介质体积含250mM咪唑的缓冲液D洗脱。 注：纯化过程流速不宜过快，对于1ml介质，流速 保持在0.5ml/min为宜。 5. 介质清洗与再生： 如果使用一段时间以后，介质上有杂质沉积导 致介质颜色改变和蛋白结合能力下降，需对介质进 行清洗或再生。 z 介质清洗： 1) 用10倍介质体积0.5M NaOH过柱，适当调整流 速，或洗脱至10倍介质体积时停30min后继续洗 脱，保证介质与NaOH溶液接触时间达到30min 以上。 2) 用10倍介质体积去离子水洗去层析柱中的碱 液。 3) 用10倍介质体积缓冲液A平衡层析柱。 z 介质再生： 1) 用2~5倍介质体积脱镍缓冲液（50mM Na3PO4， 300mM NaCl，100mM EDTA，pH 8.0）过柱； 2) 用5-10倍介质体积0.5M NaOH过柱，适当调整 流速，如流速较快，则洗脱至10倍介质体积时 停30min后继续洗脱，保证介质与NaOH溶液接 触时间达到30min以上； 3) 用10倍介质体积去离子水洗柱； 4) 用3倍介质体积10mM Na3PO4，1M NaCl，pH 7.4 缓冲液平衡层析柱； 5) 用3倍介质体积20mM NiCl2或NiSO4 (溶于去离 子水)过柱； 6) 用3倍介质体积10mM Na3PO4，1M NaCl，pH 7.4 缓冲液洗柱； 7) 用5倍介质体积缓冲液A平衡层析柱。
网址：
分离His融合蛋白及能被金属离子吸附的多肽、 蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白。
金属离子螯合层析
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亲和层析的过程
1、寻找可与底物专一可逆结合的配基 2、将配基通过共价键偶联到基质，并要求偶
联后配基与配体的亲和力不变 3、配基与配体吸附并与杂质分离，将杂质洗
出 4、洗脱目标物
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亲和层析的分类
1、生物亲和层析 2、免疫亲和层析 3、金属离子亲和层析 4、有机染料亲和层析 5、拟生物亲和层析
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2、IMAC与重组技术相结合可以使带六聚组氨 酸的蛋白质固定在基质上，从而为研究蛋白 质的相互作用开辟了新的途径。
例：Celia等用Ni2+负载的金属螯合脂质定向 膜捕获组氨酸MHC分子，再通过表面等离 子体共振技术考察它们对 T细胞受体的结合。
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（三）、用于提取目的蛋白
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（二）、用于蛋白质分析鉴定
1、1）科学家通过金属离子亲和层析对糖基化 导致α一胰凝乳蛋白酶结构变化进行了研究， 证明糖基化作用产生两个截然不同的蛋白质， 他们对金属离子的亲和性完全相反。
2） 蛋白质的磷酸化和去磷酸化是生命体 代谢调控的重要机制，已发现IMAC能鉴定 磷酸化的蛋白，其中Fe3-IMAC已被用来选 择性纯化和浓缩磷酸化的蛋白和多肽。
在基因重组过程中加入聚组氨酸六肽作为 亲和标识物来分离纯化目的蛋白
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（四）、用于核苷酸的纯化
IMAC也可以应用于核苷酸的纯化，比如用 组氨酸标记的PCR产品，单链、双链核苷酸 及嘌呤等
例：从质粒DNA产物中除去被损坏的染色体 DNA
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（五）、其他应用
过渡金属亲和吸附蛋白的特性也成功应 用在生物传感器和蛋白质芯片领域。
蛋白纯化His-tag介绍、优势及原理
蛋⽩纯化His-tag介绍、优势及原理1、什么是His-tag？His-tag单抗⼜叫6*His-tag单抗，或6*His单克隆抗体，⽤⼩⿏制备，His可被镍柱吸附，⽤于纯化重组蛋⽩，⽆论表达的蛋⽩是可溶的或者包涵体都可以⽤固定⾦属离⼦亲和层析（IMAC）纯化。
⾦属螯合亲合层析，⼜称固定化⾦属离⼦亲合层析（Immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC），是近30年发展起来的⼀种新型分离技术。
最早由Paroth等⼈提出。
该⽅法利⽤蛋⽩质表⾯的⼀些氨基酸，如组氨酸、⾊氨酸、半胱氨酸等能和⾦属离⼦发⽣特殊的相互作⽤的原理，从⽽对蛋⽩质加以分离。
这些作⽤包括配价键结合、静电吸附、共价键结合，其中以配价键结合为主，⽽且这其中⼜以6组氨酸标签（His-Tag）应⽤最为⼴泛。
His-tag 是蛋⽩质重组技术中经常⽤到的⼀种标签，其序列为6个组氨酸HHHHHH，其特点是分⼦量⼩，只有不到0.84 KD，基本不改变蛋⽩质的⽣物结构，不改变蛋⽩质的溶解性，更重要的是它使蛋⽩质的纯化变得极为⽅便。
根据组氨酸上的咪唑环可以与⼆价⾦属离⼦结合的原理，His-Tag 可结合在⽬的蛋⽩的 C 末端或 N 末端，形成特殊的结构，以便于进⾏下⼀步的纯化及检测。
⼈们可以利⽤⾦属离⼦亲和层析技术纯化带有His标签的蛋⽩，即将含有⽬的蛋⽩的裂解液通过固定的⼆价⾦属离⼦（通常是⼆价Ni离⼦）填料，带有6*his-tag的蛋⽩质即与填料结合，其它蛋⽩不与填料结合，最后再⽤⾼浓度的咪唑即可将⽬的蛋⽩洗脱下来。
以实验⼩⿏为宿主制备的His-tag单抗叫His-tag⿏单抗。
其制备⽅法通常是这样的：⼈⼯合成6*His多肽，即氨基酸序列为HHHHHH的多肽，必要时在末端添加偶联载体⽤到的特殊氨基酸。
合成好此多肽后，通过化学⽅法将此多肽与载体蛋⽩偶联（如KLH、BSA、OVA等），偶联完成后，再⽤偶联好的全抗原免疫实验⼩⿏，免疫结束后杀死免疫好的⼩⿏，⽆菌条件下取脾脏，与⾻髓瘤细胞进⾏融合，⽤ELISA或者其它⼿段进⾏筛选出阳性的克隆，筛选到的细胞经过克隆化后即形成稳定的细胞株，将此细胞株进⾏体外培养或⼩⿏体内诱⽣腹⽔形成，再从培养基或者腹⽔中纯化即可得到His-tag⿏单抗，再⽤Western blot或其它⼿段进⾏鉴定即可。
铁离子螯合亲和层析分离抗氧化活性核桃肽
铁离子螯合亲和层析分离抗氧化活性核桃肽吕莹;刘静;陈湘宁【摘要】采用铁离子螯合亲和层析方法分离出具有不同抗氧化活性的核桃肽,并探讨核桃肽的抗氧化活性与铁结合能力的关系.结果表明,核桃肽在酸性条件(pH 5.5)下与铁的结合能力最强,随着pH逐渐升高,结合能力下降.磷酸氢二钠对吸附到铁亲和层析柱上核桃肽的洗脱效果最好,通过阶段洗脱,得到铁结合能力逐渐增强的核桃肽组分(F1、F2和F3).对其总还原能力和2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)自由基清除能力进行测定,发现其抗氧化能力为F3＞F2＞F1(P＜0.05).结果表明,核桃肽的铁结合能力越强,其抗氧化活性越高.%walnut is an important forestry product. The peptides hydrolyzed from walnut protein have the antioxidant activities. In this study, immobilized metal affinity chromatography (IMAC) was used to separate the walnut peptides with different antioxidant activities. The results showed that the binding abilities of walnut peptides on iron column were highest at pH 5.5. The binding amount of peptides decreased with the increasing of pH. The amount of eluted walnut peptides from column with Na2HPO4 was higher than that of other solutions. With stepwise elution, there fractions ( F1, F2, and F3) were obtained. Furthermore, the antioxidant activities of the tree fraction were evaluated with reducing power and 2,2- Azinobis - (3 - ethylbenzthiazoline - 6 - sulphonate) (ABTS) system. The peptides from F1 to F3(P<0. 05) presented improving antioxidant activity. Our results showed that the stronger iron binding ability of the walnut peptides, the higher antioxidant activities.【期刊名称】《中国粮油学报》【年(卷),期】2013(028)001【总页数】5页(P65-69)【关键词】核桃肽;铁结合能力;抗氧化;铁离子螯合亲和层析【作者】吕莹;刘静;陈湘宁【作者单位】农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室北京农学院食品科学与工程学院,北京102206;农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室北京农学院食品科学与工程学院,北京102206;农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室北京农学院食品科学与工程学院,北京102206【正文语种】中文【中图分类】TS255核桃是我国重要的林产品，目前核桃除鲜食外，深加工主要集中在生产核桃乳或核桃油。
imac固定化金属亲和层析
imac固定化金属亲和层析
固定化金属离子亲和层析（IMAC）是一种蛋白质纯化技术，其主要原理是利用蛋白质中的组氨酸、半胱氨酸和色氨酸侧链与过渡金属（如Cu2+、Ni2+、Co、Zn3+等）的相互作用，将金属离子固定在载体上，从而实现蛋白质的纯化。
I MAC技术的操作简单、纯化效果好，因此被广泛应用于蛋白质纯化实验。
在实验过程中，常用的缓冲液浓度为20-100mM，可以使用磷酸盐、Tris、硼酸盐、HEPES和乙酸盐等缓冲液。
此外，非离子型表面活性剂、尿素、盐酸胍等物质不会影响IMAC 对组氨酸的吸附作用。
IMAC技术除了用于蛋白质纯化外，还具有以下应用：
1.酶联免疫吸附实验（ELISA）：ELISA是一种诊断工具，通过固定化金属离子亲和层析技术，可以将His标记的抗原固定在微孔板表面，用于检测抗体与抗原的相互作用。
2.芯片技术：将His标记蛋白质固定在芯片表面，用于研究与其他分子的相互作用，如通过SPR技术进行蛋白质鉴定。
3.蛋白质相互作用研究：利用固定化金属离子亲和层析技术，可以研究蛋白质与其他分子的相互作用，如酶与底物的结合、蛋白质与配体的结合等。
4.生物传感器：基于IMAC技术制备的生物传感器，可用于实时监测生物分子间的相互作用。
5.药物筛选：利用固定化金属离子亲和层析技术，可以筛选与特定金属离子结合的药物分子，从而进行药物研发。
总之，固定化金属离子亲和层析（IMAC）技术在生物科学研究、药物研发和临床诊断等领域具有广泛的应用前景。
金属螯合层析
亲和层析中文名称：亲和层析英文名称：affinity chromatography定义1：利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合作用而进行分离的一种层析技术。
可以选用生物化学、免疫化学或其他结构上吻合等亲和作用而设计的各种层析分离方法。
如用寡脱氧胸苷酸-纤维素分离纯化信使核糖核酸；用DNA-纤维素分离依赖DNA的DNA聚合酶；用琼脂糖-抗体制剂分离抗原；用金属螯合柱分离带有成串组氨酸标签的重组蛋白质等。
应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）定义2：利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。
应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科）本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布百科名片亲和层析将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。
那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液，改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分离纯化蛋白质的方法称为亲和层析。
利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其它分子的层析技术。
目录亲和层析(affinity chromatography)原理载体的基本要求和选择名词解释亲和层析(affinity chromatography)在生物分子中有些分子的特定结构部位能够同其他分子相互识别并结合，如酶与底物的识别结合、受体与配体的识别结合、抗体与抗原的识别结合，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这种结合解除。
生物分子间的这种结合能力称为亲和力。
亲和层析就是根据这样的原理设计的蛋白质分离纯化方法。
原理亲和层析是一种吸附层析，抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。
实验十一 金属螯合亲和层析分离蛋白质
实验十一金属螯合亲和层析分离蛋白质【实验目的】1．学习亲和层析的原理。
2．掌握亲和层析法分离蛋白质的技术与操作。
【实验原理】亲和层析是以普通凝胶作载体，连接上金属离子制成螯合吸附剂，用于分离纯化蛋白质，这样的方法称为金属螯合亲和层析。
蛋白质对金属离子具有亲和力是这种方法的理论依据。
已知蛋白质中的组氨酸和半胱氨酸残基在接近中性的水溶液中能与镍或铜离子形成比较稳定的络合物，因此，连接上镍或铜离子的载体凝胶可以选择性地吸附含咪唑基和巯基的肽和蛋白质。
过渡金属元素镍在较低pH范围时（pH 6-8），有利于选择性地吸附带咪唑基和巯基的肽和蛋白质，在碱性pH时，使吸附更有效，但选择性降低。
金属螯合亲和层析行为在很大程度上，由被吸附的肽和蛋白质分子表面咪唑基和巯基的稠密程度所支配，吲哚基可能也很重要。
本实验室纯化的目的蛋白是用IPTG诱导表达的pGFPuv,该蛋白是和6His融和表达的，含有特定的组氨酸标记物，这种可溶性蛋白质能用金属亲和层析法进行分离，且操作简单，快速，纯化效率高。
【试剂与器材】〈一〉试剂1. 0.05mol/L EDTA—0.5mol/L ，NaCL溶液100mL2. 2mol/L NaCL 溶液50mL3. 1mol/L NaOH溶液50mL4. 0.2mol/L NiSO4溶液50mL5. 平衡缓冲液：50mmol/L Tris-HCL，500mmol/L NaCL，pH7.0 500mL6. Ni2＋Chelating Sepharose Fast Flow 5－10 mL7. 重组pGFPuv质粒大肠杆菌工程菌经诱导表达的细胞裂解蛋白样品20—50ml8. 洗涤液：50mmol/L咪唑，50mmol/L Tris-HCL，500mmol/L NaC,pH 7.09. 洗脱液：300mmol/L咪唑，50mmol/L Tris-HCL，500mmol/L NaCL.pH7.010 20%乙醇溶液50ml〈二〉器材1. 1.5cm X 50cm层析柱2. 蠕动泵3. 紫外检测仪4. 自动收集器5. 伍豪色谱工作站【操作方法】1. 样品的制备细胞的培养及荧光蛋白表达看实验十，细胞的破碎及蛋白的收集如下：收集在25 ℃用细胞培养液，8000r/min，离心5min，去上清液，菌体用平衡缓冲液洗涤一次，离心收集菌体，用三分之一（细胞培养液）体积的平衡缓冲液充分悬浮，冰浴下进行高压破菌处理。
鳌合金属镍使用说明
镍离子金属鳌合亲和层析介质（Ni-NTA）说明书一、简介金属螯合亲和层析介质，又称固定金属离子亲和色谱，其原理是利用蛋白质表面的一些氨基酸，如组氨酸能与多种过渡金属离子如Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe3+发生特殊的相互作用，能够吸附富含这类氨基酸的蛋白质，从而达到分离纯化的目的。
因此，偶联这些金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性地分离出这些含有多个组氨酸的蛋白以及对金属离子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。
半胱氨酸和色氨酸也能与固定金属离子结合，但这种结合力要远小于组氨酸残基与金属离子的结合力。
镍NTA亲和层析介质（Ni-NTA ）具有特异性好、流速快的优点，颗粒粒度均匀，粒径小，并且螯合镍更稳定，能耐受更高的还原剂，物理和化学稳定性好，批次重复性好。
本产品已经螯合好镍离子，使用更方便。
二、性能参数：三、适用范围分离带His标签的重组蛋白及能被金属离子吸附的多肽、蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白。
四、应用实例实验名称：Ni-NTA 分离带His标签的重组蛋白实验步骤：1、Ni-NTA 装柱，1.6×20cm，柱床体积为10ml；2、用缓冲液1平衡2~5个床体积，流速为2ml/min；3、将20ml细胞破碎液(50mM PBS，pH7.4，0.5M NaCl)0.45μm滤膜过滤，上样，流速为1ml/min；4、用缓冲液1再洗2~5个床体积，流速为2ml/min；5、用分别含10、20、50、100、200、300、400mM咪唑的缓冲液3进行阶段洗脱，流速为2ml/min，收集各阶段洗脱峰，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度；6、用纯水流洗5个柱床体积，再用20%的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2ml/min，柱子置于+4-8℃环境中保存。
缓冲液组成：缓冲液1：50mM pH7.4的PBS缓冲液。
配制：0.5M NaH2PO419ml，0.5M Na2HPO481ml，NaCl 29.3g,加适量水溶解后定容到1000ml。
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金属螯合亲和层析技术及其应用摘要:固定化金属螯合亲和层析是一种有效的生物分子分离纯化技术,它具有配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用强等特点。
因此,其在蛋白质纯化、复性和空间定位以及酶的固定化和金属离子清除等方面具有广泛的应用。
关键词:固定化金属螯合亲和层析;纯化;应用固定化金属螯合亲和层析(Immobilized Metal-Chelated Affinity Chromato-graphy,IMAC)是一种亲和纯化技术,它是由Porath于1975年首次提出并用于吸附牛血清蛋白[1],至今用IMAC已成功分离纯化出数百种生物大分子。
该法是基于蛋白质表面的一些氨基酸残基与固定化金属离子的亲和力不同而对蛋白质进行分离纯化。
它因配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用强等特点而被广泛应用。
随着研究的进一步深入,IMAC的新应用也不断地被发现。
1金属螯合亲和层析作用原理固定化金属螯合亲和层析基于蛋白质表面氨基酸与固定化金属离子的亲和力不同对蛋白质进行分离。
过渡态金属离子能与电子供体氮、硫、氧等原子以配位键结合,金属离子上剩余的空轨道是电子供体的配位点,在溶液中被水分子或阴离子占据。
当蛋白质表面氨基酸残基与金属离子的结合力较强时,氨基酸残基的供电原子将取代与金属离子结合的水分子或阴离子,与金属离子形成复合物,从而使蛋白质分子结合在固相介质表面。
氨基酸中的α-氨基和α-羧基,以及某些氨基酸侧链基团含有孤对电子的活性原子都能参与螯合反应,由于蛋白质表面这些氨基酸的种类、数量、位置和空间构象不同,因而与金属配基的亲和力大小不同,从而可选择性地加以分离纯化[2]。
2金属螯合亲和层析技术的应用2.1金属螯合亲和层析用于生物分离纯化IMAC在生物分子纯化方面具有很多优点:(1)结合力强,蛋白结合容量大,可用于工业生产,如采用IMAC吸附介质的扩张床吸附(EBA)技术可从哺乳动物细胞培养粗提物中一步分离纯化溶解性目标蛋白;(2)洗脱条件温和,再生后配体恢复完全,一种IMAC树脂可再生几百次而不改变其层析特性;(3)价格便宜;(4)可通过改装各种金属离子,引入目标蛋白质最适宜的金属离子进行不同蛋白质的纯化。
鉴于上述特点,IMAC不仅适用于某些蛋白质、酶、氨基酸及肽的分离纯化,也适用于可逆螯合金属离子的核苷酸、激素、抗体等物质的分离和纯化。
目前,基因工程重组蛋白纯化技术已经成熟,常通过DNA重组技术对蛋白进行标记,该方法在重组蛋白质表达过程中巧妙地将标签(常为6×His尾巴)直接连接到蛋白质的N-末端或C-末端,这种基因工程蛋白与裂解液中的其他蛋白质相比,对金属离子有更高的特异性,在分离纯化后再用化学法或酶法将尾巴切掉。
这种方法目前已经成为基因工程下游技术中对融合蛋白纯化最常用的方法。
国外公司已推出商品化试剂盒,美国Qiagen公司提供的QIAexpress系统就是较为经典的一种。
该系统利用的pQE系列载体不仅有6个His编码序列还含有强启动子和多克隆位点等组成,可将目的基因在宿主细胞中高效表达。
表达后的产物可直接用金属螯合亲和层析进行分离,有时可实现一步纯化。
金属螯合亲和层析过程既可以在常规的非变性条件下进行纯化,还可以用于变性条件下(6mol/L盐酸胍或8 mol/L尿素)纯化,这对以包涵体形式存在的重组蛋白尤为有利。
2.2金属螯合亲和层析用于蛋白质的复性在基因工程技术中,表达的重组蛋白多以包涵体形式存在,蛋白质经常会错误折叠而损失活性,这一难题长久以来都没有得到很好的解决。
高浓度的变性剂可以溶解包涵体,然后控制变性剂除去的速度,有时需要添加适当的氧化/还原试剂,蛋白质可以逐步折叠复性。
通常使用的复性方法有三种,分别是稀释复性,透析复性和层析复性。
其中稀释复性和透析复性过程中会有大量无活性蛋白质聚集体形成,而金属螯合亲和层析复性中,蛋白质能可逆吸附在固相介质上,可避免伸展的多肽分子之间形成聚集体。
在高浓度变性剂存在的情况下,组氨酸尾仍旧具有吸附在金属螯合亲和层析介质上的能力,所以可在IMAC介质上同时实现复性与纯化[3]。
蛋白质吸附在IMAC介质上后,先逐步降低变性剂的浓度,使蛋白质折叠,然后提高咪唑浓度把折叠后的蛋白质洗脱出来。
对于TNF蛋白,使用IMAC 获得了90%的复性收率[4]。
2.3金属螯合亲和层析用于蛋白质的分析金属螯合亲和层析可用于蛋白质的分析鉴定。
Jiang等通过金属螯合亲和层析结合金属离子亲和毛细管电泳技术(IMACE)对糖基化导致α-胰凝乳蛋白酶结构变化进行了研究,证明糖基化作用产生两个截然不同的蛋白质,他们对金属离子的亲和性完全相反[5]。
IMAC还可用于磷酸化蛋白分析。
蛋白质的磷酸化和去磷酸化是生命体代谢调控的重要机制,已发现IMAC能鉴定磷酸化的蛋白,尤其是Fe3-IMAC已被用来选择性纯化和浓缩磷酸化的蛋白和多肽[6]。
IMAC与重组技术相结合可以使带六聚组氨酸的蛋白质固定在基质上,从而为研究蛋白质的相互作用开辟了新的途径。
Celia等[7]用Ni2+负载的金属螯合脂质定向膜捕获组氨酸标记的MHC分子,再通过表面等离子体共振技术(Surface pasmon resonance)考察它们对T细胞受体的结合。
锚定蛋白质的NTA/组氨酸标记体系也可被用来通过原子力显微镜测量受体-配体在单分子水平上的结合力[8]。
2.4金属螯合亲和层析技术在其他领域的应用过渡态金属离子和蛋白质结合的特性也成功应用在蛋白质芯片领域。
Zhu等[9]提到了将带有6个组氨酸的蛋白质固定于镀镍的玻璃板上,得到了比常规醛处理表面更高质量的蛋白质芯片。
在酵母蛋白质组学研究中,通过克隆5800个开放阅读框,相应的蛋白质纯化后固定于镀镍板上可以筛选能与磷脂相互作用的蛋白质。
使用这种技术鉴定了许多新的可与磷脂相互作用的蛋白质。
在固定化酶研究方面,受IMAC的启发,蛋白质的某些结构域可以“位点特异”的固定在固相载体表面,比随机位点固定增加了被固定蛋白质的稳定性并较好的保持了其空间结构,比如固定化酶时可提高酶的半寿期,多次重复使用酶活力亦无明显损失[10]。
综上所述,金属螯合亲和层析是一种重要的生物大分子分离纯化技术,IMAC 的应用将不仅局限于蛋白质的分离纯化,其原理还将在蛋白质芯片、生物分子间相互作用、蛋白质结构研究、蛋白质的电化学检测等方面得到应用,从而带动相关领域研究的不断发展。
参考文献:[1]Porath J, Carlsson J, Olsson I, et al. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation [J]. Nature, 1975, 258(5536): 598-599.[2]Vijayalakshmi M A. Pseudobiospecific ligand affinity chromatography [J]. Trends in Biotechnology, 1989, 7(3): 71-76.[3]Hutchinson M H, Chase H A. Adsorptive refolding of histidine-tagged glutathione S-transferase using metal affinity chromatography. Journal of Chromatography A, 2006, 1128(1-2): 125-132.[4]Xu J, Zhou Q, Ma Z, et al. Study on construction of His6-human TNFβ fusion expression plasmid and single-step purification of its product [J]. Pharmaceutical Biotechnology, 2000, 7: 1-5.[5]Jiang K Y, Pitiot O, Anissimova M, et al. Structure-function relationship in glycosylated-chymotrypsin as probed by IMAC and IMACE [J]. Biochimica etBiophysica Acta, 1999, 1433(1-2): 198-209.[6]Stensballe A, Andersen S, Jensen O N. Characterization of phosphoproteins from electrophoretic gels by nanoscale Fe(III) affinity chromatography with off-line mass spectrometry analysis [J]. Proteomics, 2001, 1(2): 207-222.[7]Celia H, Wilson-Kubalek E, Milligan R A, et al. Structure and function of a membrane-bound murine MHC class I molecule [J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96(10): 5634-5639.[8]Schmitt L, Ludwig M, Gaub H E, et al. A metal-chelating microscopy tip as a new toolbox for Single -molecule experiments by Atomic Force Microscopy [J]. Biophysical Journal, 2000, 78(6): 3275-3285.[9]Zhu H, Bilgin M, Bangham R, et al. Global analysis of protein activities using proteome chips [J]. Science, 2001, 293(5537): 2101-2105.[10]Ordaz E, Garrido-Pertierra A, Gallego M, et al. Covalent and metal-chelate immobilization of a modified 2-haloacid dehalogenase for the enzymatic resolution of optically active chloropropionic acid [J]. Biotechnology Progress, 2000, 16(2): 287-291.。