流式细胞仪分析技术

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22Baidu Nhomakorabea
前向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
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侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细胞 时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内部结 构属性。
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侧向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
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（1）液流系统
• 由样本和鞘液组成
• 待测细胞 单个细胞的悬液
荧光染料标记的单
抗对其染色 受清洁气体压力 从样品管进入流动
室形成样本流
• 鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是 包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心
位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。
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液流系统示意图
等多门高新技术的发展, 将荧光显微镜的激 发光源改为激光, 使之具有更好的单色性与 激发效率, 因而大大提高了检测灵敏度, 同时 将固定的标本台改为流动的单细胞悬液, 用 计算机进行数据处理, 从而大大提高了检测 速度与统计精确性, 而且从同一个细胞中可 以同时测得多项参数, 被誉为是细胞分析领 域的“CT”。
激素结合位点
钙离子, PH值, 膜电位 酶活性
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一、工作原理
经荧光色素染色的细胞或包裹在鞘液里的其
他生物微粒，从50－100μm的喷嘴逐个高速
喷出，通过一个聚焦的光源，进而通过各种光
敏元件测量这些细胞或微粒所发射的散射光以
及荧光，经计算机分析和处理可得到多种信息
参数。
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结构示意图
• 滤片：长通、短通、带通
• 光电倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）
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光学系统示意图
Flow Tip
SS and FL Detector
FS Detector
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Laser
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（3）数据处理系统
主要由计算机及其软件组成
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二、散射光的测定
要求
第四部分 流式细胞术在免疫学检查中
的应用
第五部分 应用举例
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第一部分 流式细胞仪的分析 及分选原理
流式细胞仪是将流体喷射技术、激光技 术、空气技术、γ射线能谱术及电子计算机 等技术与显微荧光光度计密切结合的一种非 常先进的检测仪器。
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该仪器具有高度的精密性，测定的数 据准确可靠。既可分析单个细胞，也能区 分群体细胞，检测的速度可达5000个细 胞/秒，分选纯度可高达99%以上。
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流式细胞术（FCM）以其快速、灵活、 大量、灵敏和定量的特色，广泛应用于 基础研究和临床实践各个方面，包括细 胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、 药理学、遗传学及临床检验学等，在各 学科领域发挥着重要的作用。
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第一部分 流式细胞仪的分析及分选原
理
第二部分 数据的显示与分析
第三部分 流式细胞仪免疫分析的技术
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荧光补偿
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四、细胞分选原理
通过流式细胞仪进行细胞分选主 要是在对具有某种特征的细胞需进 一步培养和研究时进行的。
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（一）分选基本原理
细胞悬液形成液流柱 压电晶体 产生机械振动
流动室振动
液流断裂成液滴
空白液滴 不充电
弃去
含细胞的液滴 充电
偏转落入收集器
鞘液
喷嘴
Fluorescence signals
Focused laser beam
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FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
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（2）光学系统
• 激光光源：气冷式氩离子激光器
• 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长 波长
• 光束成形器：两十字交叉放置的透镜
• 透镜组：形成平行光，除去室内光
流式细胞仪分析技术
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概述
流式细胞术(flow cytometry, FCM)是20世 纪70年代发展起来的一种以流式细胞仪为工 具，能快速测量细胞的物理或化学性质，如 大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、 抗原等，并可对其分类、收集的高新技术。
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流式细胞术（FCM）借鉴了荧光显微镜 技术, 同时利用计算机技术、激光技术、电 子技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学
由于该仪器的多参数性、准确性、快 速性及分选的高纯度性等特点，所以在细 胞生物学、免疫学、肿瘤学、病理学及临 床医学等领域中得到越来越广泛的应用。
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流式细胞仪常检测的细胞特性
细胞组成
细胞功能
大小
细胞表面/胞浆/核--特异性抗原
粒度
细胞活性
DNA, RNA含量
胞内细胞因子
蛋白质含量
• 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过 波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧 光信号区分开，送入不同的光电倍增管。
• 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的 多个不同特征。
• 线性放大器和对数放大器
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荧光染料的特性
•激发波长(EXCITING) •发射波长(EMISSION)
测得的FS与SS信 号通过计算机处理， 可得到FS-SS图，由 此可仅用散射光信号 对未染色的活细胞进 行分析或分选。
此为血细胞分类的 基本原理，但不能分 析表面分子。
单核细胞
中性粒细胞
淋巴细胞
光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群
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三、荧光测量
• 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激 发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。
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基本过程
已标记的单细 硅化管 胞悬液和鞘液
流动室 形成稳态 喷嘴 水平激光与之 荧光染料被
单细胞液柱
垂直相交 激发发光
荧光检测系统和
收集光信号 光电倍增管
放大 脉冲信号
散射光感受系统
计算机系统 分析结果
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1.流式细胞仪的基本结构：
（1） 液流系统 （2） 光学系统 （3） 数据处理系统
细胞在液柱中与激光束相交时 向周围360°立体角方向散射的光线 信号，它的强弱与细胞的大小、形 状、胞内颗粒折射等有关，主要分
为前向散射光和侧向散射光。
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前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光 以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细 胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。