免疫分析方法的最新研究进展培训课件
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免疫学检测方法培训课件
疫组织化学技术和荧光测定技术。荧光抗体
技术属于前者，它是利用某些荧光素通过化
学方法与特异性抗体结合，形成的免疫复合
物在一定波长光的激发下可产生荧光，因此
借助荧光显微镜检测或定位被检抗原。其又
可分为直接荧光抗体法、间接荧光抗体法和
补体荧光抗体法免疫。学检测方法
20
荧光色素
异硫氰酸荧光素（FITC） 四乙基罗丹明（RB200） 四甲基异硫氰酸罗丹明（TMRITC)
免疫学检测方法
21
1、荧光抗体染色方法
直接法
间接法
2、荧光抗体技术的应用 在细菌学诊断中的应用 在病毒感染诊断中的应用 其它方面的应用
免疫学检测方法
22
间接荧光抗体法（IFAT）操作步骤如下：
（1）单层血细胞滴片，室温晾干，放入丙酮中固定10min。
室温晾干。
（2）以小白鼠抗血清（或杂交瘤细胞上清液）为第一抗体
应用：（1）基因组DNA分析； （2）遗传物质的鉴定； （3）遗传病的诊断。
缺点：（1）需靶DNA序列的信息； （2）产物短小，DNA复制不精确。
免疫学检测方法
61
原位杂交技术
是一种能够从形态学上证明特异性的DNA和 RNA存在于制备的个别细胞，组织部分，单 细胞或染色体中的技术。
原理是含有互补序列（探针）的被标记的单 链DNA或RNA片段在适当的条件下与细胞 的DNA或RNA杂交形成稳定的杂交体。
免疫学检测方法
48
免疫金标层析法的应用与研究进展
免疫金层析法快速诊断试纸条是20世纪90年代以来在单克隆抗体技术、胶 体金免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来的一项新型体外诊断技术
医学：乙肝表面抗原、心肌肌钙蛋白T 、 HCG
免疫分析教学课件ppt
xx年xx月xx日
免疫分析教学课件ppt
目录
contents
免疫分析概述免疫分析的基本原理免疫分析在医学中的应用免疫分析的新技术与新发展免疫分析的局限性及解决方案研究展望与未来趋势
01
免疫分析概述
免疫分析定义
指利用抗原-抗体特异性反应的生物分析方法
免疫分析分类
根据所用抗体的来源和性质不同分为体内和体外免疫分析
03
免疫分析在医学中的应用
1
感染性疾病的诊断与分型
2
3
感染性疾病是临床常见疾病之一，其诊断与分型对于治疗方案的选择和预后判断至关重要。
免疫分析技术通过检测病原体特异性抗原、抗体或细胞因子等，为感染性疾病的诊断与分型提供重要依据。
例如，免疫荧光、ELISA和化学发光等免疫分析方法可应用于流感病毒、结核分枝杆菌等感染的诊断与分型。
抗原抗体的概念
抗原是指能够刺激机体产生免疫应答的物质，而抗体则是机体在抗原的刺激下产生的免疫应答产物。抗原和抗体结合时会产生一系列的反应，这些反应被称为抗原-抗体反应。
抗原-抗体反应
抗原抗体的特异性
抗原和抗体的结合具有高度的特异性，这是因为抗体只能与相应的抗原结合。抗原抗体的特异性决定了免疫分析的灵敏度和特异性。
抗原抗体的结合力
抗原和抗体结合的力主要是静电引力、范德华力和疏水相互作用等。这些力的相互作用使得抗原和抗体能够紧密结合。
信号放大
免疫分析通常使用信号放大的方法以提高检测的灵敏度。常见的信号放大方法包括酶联免疫分析、化学发光免疫分析和荧光免疫分析等。
检测方法
免疫分析的检测方法包括肉眼观察、仪器测量和放射自显影等。不同的检测方法适用于不同的免疫分析类型和检测范围。
最新免疫检测技术PPT课件
双向免疫扩散试验是在琼脂板上按一定距离 打数个小孔，在相邻的两孔内分别放入抗原 和抗体材料。当抗原和抗体向四周凝胶中扩 散，在两孔间可出现2～3条沉淀线，本法常 用于抗原或抗体的定性或定量检测，或用于 两种抗原材料的抗原相关性分析。
3.免疫电泳技术
免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物。 这种技术有两大优点：一是加快了沉淀反应的速度， 二是将某些蛋白组分利用其带电荷的不同而将其分 开，再分别与抗体反应，以此作更细微的分析。
酶联免疫吸附试验（ELISA）：
是在固相载体（通常为聚苯乙烯反应板）表面进行 的抗原抗体反应。 实验中常用的酶是辣根过氧化物酶（HRP），底物 为二苯基联苯胺。
ELISA试验三个必要的试剂
(1)固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） (2)酶标记的抗原或抗体（标记物） (3)酶作用的底物（显色剂）
最常用的方法为：
①单向琼脂扩散试验
②双向琼脂扩散试验
单向琼脂扩散试验
原 理：
将适当浓度的抗体混入琼脂凝胶中，琼脂 凝固后，打成小孔，加入待测的抗原物质， 使抗原在凝胶中由小孔自由向周围扩散，并 在小孔周围合适的位置与抗体结合形成沉 淀环，沉淀环的大小与抗原浓度呈正相关。
单向免疫扩散试验示意图
双向免疫扩散试验
ABS-ELISA法
①：固相支持物； ②：样品； ③：特异性IgG； ④：生物素化抗小鼠IgG （Biotin）； ⑤：辣根过氧化物酶HRP-酶标链亲和素（Avidin）； ⑥：DAB显色液； ⑦：显色；
物理基础主要包括：
1.气体定律 2.物态变化 3.流体运动
第一节 气体定律
一.理想气体的状态方程
应用：主要用于抗原的定性试验。用已知抗体来检测未知抗原。 （诊断炭疽的Ascoli实验、细菌分型、血迹鉴定）。
3.免疫电泳技术
免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物。 这种技术有两大优点：一是加快了沉淀反应的速度， 二是将某些蛋白组分利用其带电荷的不同而将其分 开，再分别与抗体反应，以此作更细微的分析。
酶联免疫吸附试验（ELISA）：
是在固相载体（通常为聚苯乙烯反应板）表面进行 的抗原抗体反应。 实验中常用的酶是辣根过氧化物酶（HRP），底物 为二苯基联苯胺。
ELISA试验三个必要的试剂
(1)固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） (2)酶标记的抗原或抗体（标记物） (3)酶作用的底物（显色剂）
最常用的方法为：
①单向琼脂扩散试验
②双向琼脂扩散试验
单向琼脂扩散试验
原 理：
将适当浓度的抗体混入琼脂凝胶中，琼脂 凝固后，打成小孔，加入待测的抗原物质， 使抗原在凝胶中由小孔自由向周围扩散，并 在小孔周围合适的位置与抗体结合形成沉 淀环，沉淀环的大小与抗原浓度呈正相关。
单向免疫扩散试验示意图
双向免疫扩散试验
ABS-ELISA法
①：固相支持物； ②：样品； ③：特异性IgG； ④：生物素化抗小鼠IgG （Biotin）； ⑤：辣根过氧化物酶HRP-酶标链亲和素（Avidin）； ⑥：DAB显色液； ⑦：显色；
物理基础主要包括：
1.气体定律 2.物态变化 3.流体运动
第一节 气体定律
一.理想气体的状态方程
应用：主要用于抗原的定性试验。用已知抗体来检测未知抗原。 （诊断炭疽的Ascoli实验、细菌分型、血迹鉴定）。
免疫分析教学课件ppt
免疫分析教学课件PPT
xx年xx月xx日
CATALOGUE
目录
免疫分析概述免疫分析的实验技术免疫分析的生物化学基础免疫分析的质量控制免疫分析的未来发展趋势免疫分析实例解析
01
免疫分析概述
免疫分析是一种利用抗原-抗体特异性反应原理，对样本中的抗原或抗体进行定性或定量检测的方法。
免疫分析基于抗原-抗体之间的特异性结合反应，通过检测反应产物来对样本中的抗原或抗体进行定性或定量检测。
在自动化免疫分析仪器的基础上，对整个免疫分析流程进行优化，实现全流程自动化，包括样本处理、加样、孵育、洗涤、检测等环节，减少人为操作误差。
免疫分析的自动化
高灵敏度检测试剂的研发
通过提高检测试剂的灵敏度，能够更早地检测出疾病标志物，提高疾病的早期诊断率。
信号放大技术的运用
采用信号放大技术，如量子点、纳米线等纳米材料的应用，能够将信号放大，提高检测灵敏度和准确性。
常见肿瘤标志物的免疫分析
肿瘤标志物的免疫分析
THANKS
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免疫荧光技术的应用
免疫荧光技术被广泛应用于细胞和组织的免疫标记研究。
01
02
03
免疫印迹技术的原理
免疫印迹技术是一种利用特异性抗体识别蛋白质条带，并通过显色反应显示蛋白质存在的方法。
免疫印迹技术的实验步骤
免疫印迹技术通常包括样品处理、电泳分离、转膜、特异性抗体孵育、显色反应等步骤。
免疫印迹技术的应用
抗原结合部位
抗体分子上发挥效应功能的部位，如补体激活、调理吞噬等。
效应功能部位
抗体的结构与功能
04
免疫分析的质量控制
实验计划的制定
制定详细的实验计划，包括实验目的、实验步骤、实验时间、预期结果等，以便于实验的顺利进行。
免疫实验免疫学和免疫检测技术试验培训课件
免疫实验免疫学和免疫检测技术试
6
验
本次实验检测血清IgG，应用的是双抗体夹心法。
免疫实验免疫学和免疫检测技术试
7
验
二、实验方法：
1、包被抗体： 包被抗体浓度为：用包被液稀释（包被聚苯乙烯要
在偏碱性条件下进行，所以该包被液用pH9.6的碳酸盐 缓冲溶液）抗体至10或20ug/ml，每孔加100ul。加18孔
•标准抗原1-5的浓度分别为： 50，100，200，300，500ng/ml (都从500ng/ml加，分别加10，20，40，60，100ul至各 孔，再分别补加90，80，60，40，0ul保温液即可)
•荧光各孔：阴性对照：Ab-Ag-FITC-Ab，阳性对照用 200ng/ml，500ng/ml
4、洗涤：同样营免养疫实液验免洗疫涤学和2免次疫检，测洗技术去试 淋巴细胞分离
2
液，离心： 500g 10min 验
5、检查细胞存活率： （1）将1滴细胞悬液和1滴台盼兰混匀，静置5-10分钟。 （2）上述混合液滴入细胞计数板，在显微镜下观察细 胞，计数活细胞数和死细胞数。
三、注意事项：
1。血液制品
免疫实验免疫学和免疫检测技术试
15
验
三、注意事项：
1．斑点大小控制。 2．勿用力戳破膜。 3．给第一抗体和封闭蛋白（BSA）一定吸附时间。 4．把你的实验结果粘贴于实验报告上，报告测定结果， 指出阳性点和阴性点。
免疫实验免疫学和免疫检测技术试
16
验
实验四、免疫荧光检测技术
一、基本原理：
荧光双抗夹心法定位与定量抗原
免疫实验免疫学和免疫检 测技术试验
2、加于淋巴细胞分离液上层，离心：500g 20min
免疫分析法PPT课件
全抗原： 指同时具有免疫原性和抗原特异性的
物质。 作为全抗原的物质其分子量必须足够
大（分子量>1000），且要求化学结构较 复杂，如蛋白质、多肽等。
半抗原（Hapten）：指只能与特异抗体作用
但不引起机体免疫应答的物质。
人工抗原 ：药物(半抗原) 本身不具免疫原性，
只有当它们与某些大分子的载体物质(如蛋白质 或多肽)共价结合后，才具有免疫原性。这种小 分子半抗原和大分子载体物质结合后所形成的全 抗原。人工抗原直接免疫动物可产生特异抗体。
2. 可逆性
抗原与抗体的特异性结合是由于两者 的分子结构及立体构型相互吻合，它仅发 生在分子的表面，并依靠抗原-抗体分子 间的静电力作用、疏水作用、氢键作用及 范德华引力等而存在。这种结合具有相对 稳定性，但仍为可逆反应。
3. 最适比例性
抗原抗体的结合反 应具有一定的量比关 系。只有当抗原抗体 两者的分子比例合适 时，才能发生最强的 结合反应。
抗体： (antibody ， Ab)
机体是在抗原物质的刺激下形成的一类能与 抗原特异性结合的活性球蛋白，又称免疫球蛋白 (immunoglobin ， Ig) ，由细胞合成并分泌。抗体 是机体对抗原物质产生免疫应答的重要产物，具 有各种免疫功能，主要存在于动物的血清、淋巴 液、组织液及其它外分泌液中。
免疫分析基于抗体与药物结合时所具有的 专一性和可饱和性，利用被测药物同标记药物 之间竞争抗体结合原理，建立药物浓度和响应 值（如RIA中的放射性强度）之间的函数关系， 用于体内药物分析。
抗体（Ab）、标记抗原（标记药物， Ag*）和非标记抗原（非标记药物，Ag） 三种试剂是所有免疫分析必需的基本试 剂，也是任何免疫分析试剂盒应提供的 试剂。
临床免疫学技术培训PPT免疫检测与诊断方法
利用免疫学原理和技术，对疾病进行早期、快速、准确的诊断。
通过调节或增强机体的免疫功能，达到治疗疾病的目的。
03
02
01
以凝集试验、沉淀试验等为基础，操作简便但灵敏度较低。
早期免疫检测
利用酶标记抗体或抗原，提高检测灵敏度和特异性。
酶联免疫吸附试验（ELISA）
通过荧光标记抗体，实现对病原体的快速、直观检测。
肿瘤免疫治疗概述
简要介绍肿瘤免疫治疗的概念、原理及主要策略，如免疫检查点抑制剂、过继性细胞免疫治疗等。
肿瘤免疫治疗药物及临床试验进展
列举目前处于临床试验阶段的肿瘤免疫治疗药物，并介绍其研究进展和最新成果。
肿瘤免疫治疗的效果评估
探讨如何评估肿瘤免疫治疗的效果，包括生存率、生活质量、无进展生存期等指标的改善情况，以及生物标志物的变化等。
01
简要介绍肿瘤标志物的概念、分类及其在肿瘤诊断、治疗和预后评估中的意义。
常见肿瘤标志物及其检测方法
02
列举常见的肿瘤标志物，如CEA、AFP、CA19-9等，并介绍其相应的检测方法，如酶联免疫吸附试验（ELISA）、化学发光法等。
肿瘤标志物检测的临床应用
03
探讨肿瘤标志物检测在肿瘤早期筛查、诊断、治疗监测和预后评估中的应用价值。
临床免疫学技术培训PPT免疫检测与诊断方法
：
2023-12-30
免疫检测与诊断方法概述抗原抗体反应及检测技术免疫细胞功能检测技术自身免疫性疾病相关检测技术免疫学技术在感染性疾病中应用肿瘤免疫学相关检测技术
免疫检测与诊断方法概述
01
通过免疫学技术制备疫苗，预防传染病的发生。
预防接种
免疫诊断
免疫治疗
肿瘤免疫学相关检测技术
免疫实验结果分析培训ppt课件
谓之假阴性。其原因与组织处理不当，组 织细胞抗原丢失或试剂错误(如漏加、错 加、失效、变质等),操作失误等有关。
免疫实验结果分析
35
对照结果判断：
阳性对照 1 ( －) 2 ( ＋) 3 ( ＋) 4 ( －) 5 ( ＋) 6 ( ＋) 7 ( ＋)
阴性对照 ( －) ( ＋) ( ＋)
( －) ( －) ( －) ( －)
⑶ 吸收试验 是指用事先经过量抗原吸收的
第一抗体上清液取代第一抗体，其他步骤不
变的免疫染色试剂对照。结果应是阴性或阳
性着色明显减弱 (吸收不全时) 。
免疫实验结果分析
15
⑷抑制试验 是指用标记抗体和未标记抗 体 (可以是一抗，也可以是二抗或桥抗
体) 两者的混合物作试剂，其他步骤不 变的免疫组化染色试剂对照，结果其阳 性着色应成比例的减弱 (等量或1：9) 。 此试剂对照多用于直接法。
免疫实验结果分析
第一节 免疫组化结果的判断原则
免疫组化结果的判断原则概括起来有 以下几点：
免疫实验结果分析
2
⒈ 必须同时设对照染色 。没有对照染 色的免疫组化染色结果是不可信的。
⒉抗原表达必须在特定部位。如LCA应 定位在细胞膜上；CK应定位在细胞浆内； PCNA及p53蛋白应定位在细胞核内；EMA应 定位在细胞膜上，等等。不在抗原所在部
替代对照 检测结果
结果判断
( －) ( ＋)
( －) ( ＋)
抗体失活，操作有误 非特异性染色
( －) ( －) ( ＋)
(＋)(－) ( ＋)
( ＋)
阴性对照内含定位抗原 阳性对照不含定位抗原 非特异染色
( －)
( －)
检测标本不含抗体结合可靠
第二章：免疫分析法ppt课件
55
超抗原的种类： ① 外源性超抗原(细菌性) ：金黄色葡萄球
菌A～E---肠毒素；
② 内源性超抗原(病毒性) ：小鼠乳腺肿瘤
病毒蛋白；(HIV)---人类的病毒性超抗 原等。
56
超抗原可能参与引起机体的生理和病理效 应。超抗原可与食物中毒反应、某些自身 免疫病、AIDS和一些肿瘤发病有关。
57
2．根据抗原刺激B细胞产生抗体是否需要Th细 胞(helper T cell，辅助性T细胞）辅助：
胸腺依赖性抗原(thymus-dependent antigen,TD-Ag)：如多数蛋白质抗原
胸腺非依赖性抗原(thymus-independent antigen, TI- Ag)：如细菌脂多糖，聚 合鞭毛素
淋巴细胞，简称B细胞。人类的B细胞，是在骨髓 中分化的。
47
载体-半抗原概念极其重要，它可解释
为什么低分子量化合物与体内载体蛋白 质分子结合诱发超敏性反应产生的药物 过敏症。
如苯胺类染料、镇静剂司眠脲、退热剂 阿司匹林、氨基比林以及多种抗生素分 解产物等是诱发药物过敏症的原因。
48
（三）抗原的特异性
抗原的特异性，是指某一抗原分子只能诱 导相应淋巴细胞发生免疫应答的专一性， 以及某一抗原分子只能与相应抗体或致敏 淋巴细胞特异性结合的专一性。
49
（四）共同抗原和交叉反应
一个抗原分子上可能只有一种表位，称为单 纯抗原；但是天然情况下很少发现单纯抗原， 多数抗原分子上都存在多种表位。
一般地说，不同的抗原物质具不同的表位， 故各具特异性；
22
3）免疫方式
包括抗原进入的途径、剂量、次数和间隔 时间以及免疫佐剂的使用等因素也可影响 免疫应答。
23
A、免疫原的剂量及进入途径： 剂量： ①剂量不足或过多均不引起免疫应答。 ②重复进入，引起强免疫应答。
超抗原的种类： ① 外源性超抗原(细菌性) ：金黄色葡萄球
菌A～E---肠毒素；
② 内源性超抗原(病毒性) ：小鼠乳腺肿瘤
病毒蛋白；(HIV)---人类的病毒性超抗 原等。
56
超抗原可能参与引起机体的生理和病理效 应。超抗原可与食物中毒反应、某些自身 免疫病、AIDS和一些肿瘤发病有关。
57
2．根据抗原刺激B细胞产生抗体是否需要Th细 胞(helper T cell，辅助性T细胞）辅助：
胸腺依赖性抗原(thymus-dependent antigen,TD-Ag)：如多数蛋白质抗原
胸腺非依赖性抗原(thymus-independent antigen, TI- Ag)：如细菌脂多糖，聚 合鞭毛素
淋巴细胞，简称B细胞。人类的B细胞，是在骨髓 中分化的。
47
载体-半抗原概念极其重要，它可解释
为什么低分子量化合物与体内载体蛋白 质分子结合诱发超敏性反应产生的药物 过敏症。
如苯胺类染料、镇静剂司眠脲、退热剂 阿司匹林、氨基比林以及多种抗生素分 解产物等是诱发药物过敏症的原因。
48
（三）抗原的特异性
抗原的特异性，是指某一抗原分子只能诱 导相应淋巴细胞发生免疫应答的专一性， 以及某一抗原分子只能与相应抗体或致敏 淋巴细胞特异性结合的专一性。
49
（四）共同抗原和交叉反应
一个抗原分子上可能只有一种表位，称为单 纯抗原；但是天然情况下很少发现单纯抗原， 多数抗原分子上都存在多种表位。
一般地说，不同的抗原物质具不同的表位， 故各具特异性；
22
3）免疫方式
包括抗原进入的途径、剂量、次数和间隔 时间以及免疫佐剂的使用等因素也可影响 免疫应答。
23
A、免疫原的剂量及进入途径： 剂量： ①剂量不足或过多均不引起免疫应答。 ②重复进入，引起强免疫应答。
ELISA及相关免疫分析技术ppt课件
固相
包被 抗原
待测 抗体
酶标记特 异抗体
底物
ELISA原理
&竞争中和法 以测抗体为例，包被抗体、待测
抗体竞争结合加入的恒定量的中和抗原，酶标记抗 抗体（抗人IgG），待测抗体量越多包被抗体结合 越少，显色越浅。
&捕获法 一般用于检测IgM抗体，包被抗人μ链，
捕获血清中的所有IgM抗体，加入定量特异抗原与 捕获的特异抗体结合，酶标记特异抗体（或抗抗体） 显色。
整理ppt
17
16.07.2021
整理ppt
18
16.07.2021
整理ppt
保存参考品的国际机构或组织
• 英国国立生物学标准及控制品研究院（NIBSC）：
免疫血清学 IU/ML
• 德国鲍尔-艾立希研究院（PEI）：
病毒学、免疫血清学等，传染病标志物最全。PEI/ML
• 法国国家中心实验室（LNS）、法国输血协会 （SFTS）：病毒性肝炎、艾滋等血清盘。NG/ML
05 M A R 97 110076
01 A P R 97 807004
17 JA N 97 190583-01 30 SEP 97
1557319
03 M A R 97 6L107U
15 A UG 97 72276
Me m be r I.D. #
PRB941-01 PRB941-02 PRB941-03 PRB941-04 PRB941-05 PRB941-06
&灵敏度：有二层含义，1）为试剂检出被检物质的最低量
的能力；2）为试剂对人群或大量样品中阳性检出的能力 （假阴性越少越好），取决于包被物的全面性。
&特异性：指试剂正确检定不存在的被检物质的能力 （无假阳性），取决于包被抗原（体）及标记抗原 （体）的纯度及特异性。
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• 至2007年，应用于免疫分析检测 中的各种标记技术:放射物标记、 酶标记、发光标记、荧光标记、金 标记和超顺磁粒子标记等
酶免疫分析方法
• 酶免疫分析是一种非放射性标记免疫 分析技术,以酶标记抗原或抗体作为示 踪物, 由高活性的酶催化底物显色或发 光, 达到定量分析的目的。
• 到目前为止, 酶标记法所用的酶大多是 辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、酸性 磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。酶通过与 自己的特殊作用底物反应, 而产生典型 的有色沉淀物。
免疫分析方法的最新研究进展
10
灵敏度(mol/L)
方法
优点
缺点
10-18
放10射-15免疫
试剂成本低，灵敏度较 高
操作复杂，放射性污染， 有效期短
酶10联-12免疫
试剂成本低，线操性范作围 简单
灵敏度低，适用于定性和 半定量测定
10-9
操作简单，成本较低，
化学发光 灵敏度较高1，05试剂较 工作曲线随时间漂移
时产生能量，多余的能量即为发射光子， 从而产生发光现象。发光强度可以利用发 光信号测量仪器进行检测、分析接收光量 子的产量，根据化学发光标记物与发光强 度的关系,可利用标准曲线计算出被测物的 含量。
免疫分析方法的最新研究进展
12
常见的发光体系
• 鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物类：
免疫分析方法的最新研究进展
免疫电泳
疫
技
分术
析
﹛方
法
胶体金免疫技术
标
发光免疫技术(CLIA)
记
铁蛋白免疫技术
免 疫
﹛分
荧光免疫技术(FIA) 放射免疫分析（RIA ）
析
酶免疫分析（EIA）
技
术 免疫分析方法的最新研究进展
4
免疫分析标记技术
• 免疫分析标记技术是指以抗原抗体 间的特异性反应为基础,研究标记 以各种标记物(定量信号)来对某种 物质进行定性或定量检测的研究。
酶标
放免 稳荧定光104 发光
时间分辨
灵敏度较高，1试03剂较稳 定 102
操作复杂，发光时间短， 试剂成本高，仪器维护 费用较高
电化学发 光
灵敏度较高，试剂较稳
定
酶标
操作复杂，试剂成本高， 仪器维护费用较高，有 荧光 本放底免干扰发光
免疫分析方法的最新研究进展
11
化学发光免疫分析含有免疫分析和化学发 光分析2个系统。免疫分析系统是将化学发 光物质或酶作为标记物,直接标记在抗原或 抗体上,经过抗原与抗体反应形成抗原-抗体 免疫复合物。化学发光分析系统是在免疫 反应结束后,加入氧化剂或酶的发光底物,化 学发光物质在碱性介质中经氧化剂的氧化 时释放大量自由能, 产生激发态的中间体， 该激发态的中间体由最低振动能级回到稳 定的基态， 各个振动能级时产生辐射，同
免疫分析方法的最新研究进展
7
优点：避免对人体的放射性伤害,环 境的污染 酶标记物较稳定,半衰期可 超过1年. 酶免疫反应通常不需要温 育，不需将与抗体结合的标记药物 同游离的标记药物分开,. 产生的信号 用普通的可见一紫外分光光度计就 可测定,不需昂贵的仪器没备。
缺点：标记酶不像同位素标记物,荧 光标记物那样能直接产生信号,而必 须要何其它试剂,如酶底物,辅酶的参 与,才能完成酶反应,引起吸收光谱等 变化后方可进行测定.
免疫分析方法的最新研究进展
2
• 免疫分析法通过对半抗原或抗体 进行标记，利用标记物的生物或 物理或化学放大作用来进行工作， 它集测定的高灵敏性和抗体反应 的强特异性于一体。
• 优点：操作简单、快速、灵敏度 高、特异性强、价廉、样品所需 量少
免疫分析方法的最新研究进展
3
非
分 析
λmax为470 nm的蓝光。生物发光体系
的特点是发光效率、灵敏度、选择性 均非常高。
免疫分析方法的最新研究进展
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其他无机氧化剂的化学发光体系
• 近年来，一些科学家就一些无机氧化 剂直接氧化一些物质产生化学发光的 化学发光新体系,如高锰酸钾、铈(Ⅳ)、 过氧化氢、高碘酸钾、次氯酸盐和铁
氰化钾等在药物分析方面的应用展开 了研究，并取得了一定的成果。
免疫分析方法的最新研究进展
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化学发光免疫分析法
• 化学发光免疫分析是将高灵敏度的化 学发光测定技术与高特异性的免疫反 应相结合, 借以检测抗原或抗体的分析 技术。它兼有发光分析的高灵敏度和 免疫反应的特异性。
• 优点：灵明度高，线性范围宽，光信 号持续时间长，分析方法简便快速， 结果稳定、误差小，安全性好，使用 周期长。
免疫分析方法的最新研究进展
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荧光免疫分析法
• 荧光免疫分析法是以荧光物质标记 抗原或抗体, 形成的标记物发生免 疫反应后, 引起荧光强度发生变化, 从而达到定量分析的目的。
• 目前为止认为比较满意标记物的有: 异硫氰酸荧光素( FITC )、二氯三 嗪氨基荧光素( DTAP)、四乙基罗 丹明( RB200)和四甲基异硫氰酸罗 丹明( TMR ITC ) 。
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• 吖啶类化合物：
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（金刚烷）-1,2-二氧乙烷及其衍生物
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电化学发光体
免疫分析方法的最新研究进展
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生物发光体系
• 北美荧火虫体内的荧光素/荧光素酶是 著名的生物化学发光体系,它由虫荧光 素酶、虫荧光素[D-(-)-2-6’-羧基-2’苯 并噻唑-△2-噻唑啉-4-羧酸]、ATP、 Mg2+及O2所组成。虫荧光素酶在催 化时,首先与虫荧光素酰腺苷酸(由 Mg2+-ATP与虫荧光素复合而成)生成 复合物,然后该复合物放出质子,酶变 构导致虫荧光素氧化脱羧并发射光子。 另一生物发光体系是水母发光蛋白,它 不需要加入荧光素酶,只需加入Ca2+ 或Se2+便能通过分子内反应而发出
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总结与展望
• 总之, 免疫学分析技术的发展也就是 标记学的发展。目前, 多种免疫分析 标记方法并存, 相互竞争, 相互补充, 如将EIA 与荧光技术或化学发光技术 结合, 形成荧光酶免疫分析( FEIA) 及 化学发光酶免疫分析( CLEIA ) , 从而 大大提高灵敏度, 增大检测范围。但 不管怎样, 目前还没有一种免疫分析 标记技术是完美无缺的。因此, 各种 标记技术还需要不断发展和完善, 并 且人们还在不断研究, 以开发出更新、 更理想的免疫分析标记技术。
免疫分析方法的最新研究 进展
免疫分析法起始于本世纪50 年 代, 首先应用于体液大分子物质的分 析, 1960 美国学者Yalow 和Berso n 等将放射性同位素示技术和免疫反
应结合起来测定糖尿病人血浆胰岛 素浓度, 开创了放射免疫分析方法的 先河。同年,Oliv er 将地高辛同牛血 清白蛋白结合, 使之成为人工抗原, 免疫动物后成功获得了抗地高辛抗 体, 从而开辟了用免疫分析法测定小 分子药物的新领域。
酶免疫分析方法
• 酶免疫分析是一种非放射性标记免疫 分析技术,以酶标记抗原或抗体作为示 踪物, 由高活性的酶催化底物显色或发 光, 达到定量分析的目的。
• 到目前为止, 酶标记法所用的酶大多是 辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、酸性 磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。酶通过与 自己的特殊作用底物反应, 而产生典型 的有色沉淀物。
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灵敏度(mol/L)
方法
优点
缺点
10-18
放10射-15免疫
试剂成本低，灵敏度较 高
操作复杂，放射性污染， 有效期短
酶10联-12免疫
试剂成本低，线操性范作围 简单
灵敏度低，适用于定性和 半定量测定
10-9
操作简单，成本较低，
化学发光 灵敏度较高1，05试剂较 工作曲线随时间漂移
时产生能量，多余的能量即为发射光子， 从而产生发光现象。发光强度可以利用发 光信号测量仪器进行检测、分析接收光量 子的产量，根据化学发光标记物与发光强 度的关系,可利用标准曲线计算出被测物的 含量。
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常见的发光体系
• 鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物类：
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免疫电泳
疫
技
分术
析
﹛方
法
胶体金免疫技术
标
发光免疫技术(CLIA)
记
铁蛋白免疫技术
免 疫
﹛分
荧光免疫技术(FIA) 放射免疫分析（RIA ）
析
酶免疫分析（EIA）
技
术 免疫分析方法的最新研究进展
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免疫分析标记技术
• 免疫分析标记技术是指以抗原抗体 间的特异性反应为基础,研究标记 以各种标记物(定量信号)来对某种 物质进行定性或定量检测的研究。
酶标
放免 稳荧定光104 发光
时间分辨
灵敏度较高，1试03剂较稳 定 102
操作复杂，发光时间短， 试剂成本高，仪器维护 费用较高
电化学发 光
灵敏度较高，试剂较稳
定
酶标
操作复杂，试剂成本高， 仪器维护费用较高，有 荧光 本放底免干扰发光
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化学发光免疫分析含有免疫分析和化学发 光分析2个系统。免疫分析系统是将化学发 光物质或酶作为标记物,直接标记在抗原或 抗体上,经过抗原与抗体反应形成抗原-抗体 免疫复合物。化学发光分析系统是在免疫 反应结束后,加入氧化剂或酶的发光底物,化 学发光物质在碱性介质中经氧化剂的氧化 时释放大量自由能, 产生激发态的中间体， 该激发态的中间体由最低振动能级回到稳 定的基态， 各个振动能级时产生辐射，同
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优点：避免对人体的放射性伤害,环 境的污染 酶标记物较稳定,半衰期可 超过1年. 酶免疫反应通常不需要温 育，不需将与抗体结合的标记药物 同游离的标记药物分开,. 产生的信号 用普通的可见一紫外分光光度计就 可测定,不需昂贵的仪器没备。
缺点：标记酶不像同位素标记物,荧 光标记物那样能直接产生信号,而必 须要何其它试剂,如酶底物,辅酶的参 与,才能完成酶反应,引起吸收光谱等 变化后方可进行测定.
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• 免疫分析法通过对半抗原或抗体 进行标记，利用标记物的生物或 物理或化学放大作用来进行工作， 它集测定的高灵敏性和抗体反应 的强特异性于一体。
• 优点：操作简单、快速、灵敏度 高、特异性强、价廉、样品所需 量少
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非
分 析
λmax为470 nm的蓝光。生物发光体系
的特点是发光效率、灵敏度、选择性 均非常高。
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其他无机氧化剂的化学发光体系
• 近年来，一些科学家就一些无机氧化 剂直接氧化一些物质产生化学发光的 化学发光新体系,如高锰酸钾、铈(Ⅳ)、 过氧化氢、高碘酸钾、次氯酸盐和铁
氰化钾等在药物分析方面的应用展开 了研究，并取得了一定的成果。
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化学发光免疫分析法
• 化学发光免疫分析是将高灵敏度的化 学发光测定技术与高特异性的免疫反 应相结合, 借以检测抗原或抗体的分析 技术。它兼有发光分析的高灵敏度和 免疫反应的特异性。
• 优点：灵明度高，线性范围宽，光信 号持续时间长，分析方法简便快速， 结果稳定、误差小，安全性好，使用 周期长。
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荧光免疫分析法
• 荧光免疫分析法是以荧光物质标记 抗原或抗体, 形成的标记物发生免 疫反应后, 引起荧光强度发生变化, 从而达到定量分析的目的。
• 目前为止认为比较满意标记物的有: 异硫氰酸荧光素( FITC )、二氯三 嗪氨基荧光素( DTAP)、四乙基罗 丹明( RB200)和四甲基异硫氰酸罗 丹明( TMR ITC ) 。
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• 吖啶类化合物：
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（金刚烷）-1,2-二氧乙烷及其衍生物
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电化学发光体
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生物发光体系
• 北美荧火虫体内的荧光素/荧光素酶是 著名的生物化学发光体系,它由虫荧光 素酶、虫荧光素[D-(-)-2-6’-羧基-2’苯 并噻唑-△2-噻唑啉-4-羧酸]、ATP、 Mg2+及O2所组成。虫荧光素酶在催 化时,首先与虫荧光素酰腺苷酸(由 Mg2+-ATP与虫荧光素复合而成)生成 复合物,然后该复合物放出质子,酶变 构导致虫荧光素氧化脱羧并发射光子。 另一生物发光体系是水母发光蛋白,它 不需要加入荧光素酶,只需加入Ca2+ 或Se2+便能通过分子内反应而发出
免疫分析方法的最新研究进展
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总结与展望
• 总之, 免疫学分析技术的发展也就是 标记学的发展。目前, 多种免疫分析 标记方法并存, 相互竞争, 相互补充, 如将EIA 与荧光技术或化学发光技术 结合, 形成荧光酶免疫分析( FEIA) 及 化学发光酶免疫分析( CLEIA ) , 从而 大大提高灵敏度, 增大检测范围。但 不管怎样, 目前还没有一种免疫分析 标记技术是完美无缺的。因此, 各种 标记技术还需要不断发展和完善, 并 且人们还在不断研究, 以开发出更新、 更理想的免疫分析标记技术。
免疫分析方法的最新研究 进展
免疫分析法起始于本世纪50 年 代, 首先应用于体液大分子物质的分 析, 1960 美国学者Yalow 和Berso n 等将放射性同位素示技术和免疫反
应结合起来测定糖尿病人血浆胰岛 素浓度, 开创了放射免疫分析方法的 先河。同年,Oliv er 将地高辛同牛血 清白蛋白结合, 使之成为人工抗原, 免疫动物后成功获得了抗地高辛抗 体, 从而开辟了用免疫分析法测定小 分子药物的新领域。