4.3酵母细胞的固定化

〖思考3〗为什么要海藻酸钠溶液冷却后才能 加入酵母细胞？
防止高温杀死酵母细胞。
（5）固定化酵母细胞：
以恒定速度缓慢地将注射器中的溶液
滴加到CaCl2溶液中，形成凝胶珠状颗粒。
思考：CaCl2溶液有什么作用？
使海藻酸钠胶体发生聚沉，形成凝胶珠。凝胶珠在
在CaCl2溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。
（3）包埋法
将酶包埋在能固化的载体中，如将酶包裹 在聚丙烯酰胺凝胶等高分子凝胶中，或包裹 在硝酸纤维素等半透性高分子膜中，前者包 埋成格子型，后者包埋成微胶囊型。 （凝胶包埋、纤维包埋和微胶囊包埋）
三种方法的优、缺点
●物理吸附法 工艺简便且条件温和，生产实践中应用广泛
●化学结合法 微生物反应活性损失较大，且采用的交联剂比 较昂贵
〖思考2〗微火加热并不断搅拌的目的是什 么？
防止海藻酸钠焦糊。
海藻酸钠的浓度涉及到固定化细胞 的质量。如果海藻酸钠浓度过高，将很 难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的 凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少
(4)海藻酸钠溶液与酵母细胞的混合： 将溶化的海藻酸钠溶液冷却至室温，加
入活化酵母细胞液，搅拌后吸入到注射器中。
直接使用 酶
固定化酶
固定化细胞
酶的种数 一种或几种
一种
一系列酶
常用载体
高岭土、皂土、 硅胶、凝胶
明胶、琼脂糖、海 藻酸钠、醋酸纤维 素、聚丙烯酰胺
制作方法
化物学理结吸合附固固定定化化、包埋法固定化
是否需要 营养物质
否
否
是
催化反应 单一或多种
单一
一系列
反应底物
各种物质(大 分子、小分 子)
各种物质(大分 子、小分子)
小分子物质
直接使用酶 固定化酶 固定化细胞
缺点 优点
①对环境条件 非常敏感， 易失活
②难回收，成 本高，影响 产品质量
不利于催化一 系列的酶促反 应
反应物不易与 酶接近，尤其 是大分子物质， 反应效率下降
催化效率高、 耗能低、低污 染
①既能与反应 物接触，又 能与产物分 离
②可以反复利 用
成本低、操作 容易
③反应后，酶会混在产物中，影响产品质量， 难以在工业生产中广泛应用
一、固定化酶知识
1.定义：指用物理学或化学的方法将酶与固相 载体结合在一起形成的仍具有酶活性的酶复 合物。
催化反应中，以固相状态作用于底物，反 应完成后容易与水溶性反应物和产物分离。
优 点：既保持酶的催化活性，又具有一般化 学催化剂能反复使用。
常用的载体有明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋 酸纤维素和聚丙烯酰胺等。
海藻酸钠：一种天然多糖，是由海带中提取的天然多糖 碳水化合物，可作为食用的食品添加剂，也可作为支架 材料用于医学用途，其温和的溶胶凝胶过程、良好的生 物相容性使其适于作为释放或包埋药物。
酵母菌细胞的固定化技术
1. 制备固定化酵母细胞 （1）酵母细胞的活化： 1g干酵母＋10mL蒸馏水→50mL烧杯→搅 拌均匀→放置1h，使之活化。
●包埋法 对细胞活性影响小，是固定化细胞常用方法
固定化酶缺点:一种酶只能催化一种化学反应， 而在实际生产中，很多产物的形成是通过一系列 的酶促反应才能得到。
20世纪70年底，为进一步简化操作，降 低成本，固定化酶制备技术发展为固定化细 胞技术。 固定化细菌技术 + 固定化酶技术
= 固定化生物催化技术（现代的）
（1）免去了破碎细胞提取酶的手续； （2）酶在细胞内的稳定性较高，完整细胞固 定化后酶活性损失少； （3）制备的成本低； （4）无需辅酶再生；
固定化细胞的不足
（1）仅能利用胞内酶 （2）细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限 制作用 （3）载体形成的孔隙大小影响高分子底物的 通透性
六、固定化细胞技术的应用
（海藻酸钠+CaCl2
凝胶珠+氯化钠）
刚形成的凝胶珠应在CaCl2溶液中浸 泡一段时间，以便形成稳定的结构。检验 凝胶珠的质量是否合格，可以使用下列方 法。
一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上 用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有 液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。
二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝 胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠 是成功的
〖思考4〗发酵过程中锥形瓶为什么要密封？ 酵母菌的酒精发酵需要缺氧条件。
〖思考5〗锥形瓶中的气泡和酒精是怎样形 成的？ 酵母菌进行无氧呼吸产生的。
〖思考6〗在利用固定化酶或固定化细胞进 行生产的过程中，需要无菌操作吗？
需要。
四、课题成果评价
（一）观察凝胶珠的颜色和形状
如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻 酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少；
固定化酶的应用实例 生产高果糖浆 （1）什么是高果糖浆？它有何优点？
指果糖含量为42%左右的糖浆。用它代替蔗糖， 不会出现因蔗糖过多诱发肥胖、高血压、糖尿病、
~
心血管等疾病，对人类健康更有益。
（2）生产高果糖浆需要什么酶？酶的作用是什么？ 直接使用酶有何缺点？
葡萄糖 葡萄糖异构酶 60-70℃
果糖
二、固定化细胞技术
1.对象： 微生物、动植物细胞及各种细胞器； 特点：被固定化细胞仍能进行正常的新陈 代
谢，也能增殖。
2.常用方法：包埋法，材料主要是有机高聚物； 早期，如聚丙烯酰胺； 后期，如海藻酸盐、卡拉胶、琼脂等天然聚合物 （毒性小）
三、制备固定化酵母细胞
本课题使用包埋法来固定细胞，即将微生物 细胞均匀地包埋在不溶于水的多孔性载体中。
固定化酵母细胞的发酵
（6）冲洗：将固定的酵母细胞凝胶珠用蒸馏水冲洗2～3次。 （7）发酵：150mL10％葡萄糖＋固定化酵母细胞 →200mL锥形瓶→密封→25℃发酵24h。
思考：（1）为什么要用蒸馏水冲洗凝胶珠？ （2）葡萄糖在这里的作用是？
（1）洗去凝胶珠表面多余的CaCl2溶液，以免对实验 造成影响。 （2）既可以作为发酵底物，也作为酵母细胞的营养 物质。
目前，日用化工厂大量生产的酶制
剂，其中的酶大都来自
A.化学合成
D
B.动物体内

C.植物体内
D.微生物体内
4.酶制剂特点
如何解决这 些问题？
（1）优点
催化效率高、低耗能、低污染，大规模地应用于食 品、化工等各个领域
（2）实际问题
①天然酶通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂 等条件非常敏感，容易失活 ②溶液中酶很难回收，不能再次利用，提高了 生产成本
2.如图为固定化酶的反应柱示意图, 其中①为反应柱,②为固定化酶,③ 为分布着小孔的筛板,请据图回答: (1)关于固定化酶中用到的反应柱,
理解正确的是( C )
A.反应物和酶均可自由通过反应柱 B.反应物和酶均不能通过反应柱 C.反应物能通过,酶不能通过 D.反应物不能通过,酶能通过
(2)与一般酶制剂相比,固定化酶的突出优点 是__既__能__与___反__应__物__接___触__,_又__能__与__产___物_ 分离,能 被__反___复__利__用_ ,固定化细胞的优点是_____ _成__本__更__低__,_操__作__更。容易 (3)③的作用是__使__酶__颗___粒__无__法__通___过__,反_ 应液 _能__自__由___通__过_。
1.研究认为，用固定化酶技术处理污染物是
很有前途的。如将从大肠杆菌得到的磷酸三
酯酶固定到尼龙膜上制成制剂，可以用来降
解残留在土壤中的有机磷农药，与用微生物
降解相比，其作用不需要适宜的（ D ）
A.温度
B.PH
C.水分
D.营养
2.在制备固定化酵母细胞的实验中，
CaCl2溶液的作用是（ C ）
A调节溶液pH B进行离子交换 C胶体聚沉 D为酵母菌提供钙离子
直接使用酶缺点：
酶溶于葡萄糖溶液后，就无法从糖浆中回收， 造成很大的浪费。
（3）改进方法： 固定化酶技术 （4）具体做法：
（5）优点
反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本 提高了果糖的产量和品质
1.下列说法不正确的是（D ）
A.葡萄糖与固定化葡萄糖异构酶接触，转化 成的是果糖 B.从固定化酶反应柱下端流出的是果糖 C.高果糖浆不会像蔗糖那样诱发肥胖、糖尿 病、龋齿和心血管病 D.酶溶解于葡萄糖溶液，可以从糖浆中回收
(4)制作固定化葡萄糖异构酶所用的方法有 化__学___结__合__法__、___物__理__吸__附___法__(至少两种)。
2.固定化酶的方法
（1）物理吸附法
将酶吸附在纤维素、琼脂糖等多糖类或多 孔玻璃、离子交换树脂等载体上的固定方式。 （包括物理吸附、离子吸附2种）
（2）化学结合法
利用多功能试剂进行酶与载体之间的交联， 在酶和多功能试剂之间形成共价键，从而得 到三维的交联网架结构。
第四章第3节
酵母细胞的固定化
学习目标
1. 举例说出固定化酶的应用 2. 尝试酵母菌细胞的固定化
基础知识
（一）酶制剂 1.酶制剂的概念和种类 ①定义： 含有酶的制品 ②种类： A.液体酶制剂 治疗某些胃病的胃蛋白酶液 B.固体酶制剂 多酶片、加酶洗衣粉中的蛋白酶 和脂肪酶
2.酶的提取和分离纯化
提取出来的酶还要经过分离、纯化，再加 入适量的稳定剂和填充剂，制成相应的酶制剂 后才能用于催化化学反应
〖思考1〗活化是指什么？ 活化:让处于休眠状态的微生物重新恢
复正常生活状态的过程。
（2）配制CaCl2溶液： 0.83gCaCl2＋150mL蒸馏水
→200mL烧杯→溶解备用。
思考：为什么要用蒸馏水，而不用自来水？ 防止自来水中各种离子影响实验结果
（3）配制海藻酸钠溶液：
0.7g海藻酸钠＋10mL水→50mL烧杯→酒 精灯微火（或间断）加热，并不断搅拌，使 之溶化→蒸馏水定容到10mL。