糖组学中糖蛋白糖链的研究技术及进展

糖组学中糖蛋白糖链的研究技术及进展1988年牛津大学Dwek教授在Annual Review of Biochemistry上发表了题为“Glycobiology” (糖生物学) 的综述，首次提出了糖生物学这一概念，标志着糖生物学这门学科的诞生[1]。在十几年后，糖生物学在糖链结构、生物合成、生理功能等方面取得了极大地进展。作为第3种生命信息分子的糖链正越来越受到重视，于是糖组学被誉为是继基因组学和蛋白质组学后的第三领域。糖组是指细胞内所有的糖链，包括糖复合物[2]。糖组学是研究糖链的表达、调控和生理功能的科学，通过研究糖链确定基因所携带的遗传信息与功能之间的关系。糖组学的研究依赖于糖组研究技术的发展，其中糖蛋白和糖链的研究技术比较成熟，本文主要对这两方面进行综述。

1.糖组学研究的内容及意义

基因对生命活动的调控是由基因所编码的蛋白质及其所合成的糖链和脂类来体现的，因此基因功能的阐明不仅需要基因组学的研究，还必须开展蛋白质组学和糖组学的研究。糖链、核酸和蛋白质都是生物大分子，但是糖链的结构远比核酸和蛋白质复杂，这是由于聚糖的糖单位之间糖苷键的链接方式的多样性[3]。糖链参与几乎所有真核生物的每一生命过程，其功能是复杂而多样的在分子内，糖蛋白糖链影响蛋白质的折叠、溶解度、半衰期、抗原性及生物活性等。在分子间，糖链可以通过糖基化影响蛋白的功能，更重要的是还与信号传递、细胞通讯密切相关。.糖与糖之间的相互作用介导细胞-细胞相互作用也被证实.因此糖组学的重要研究内容之一就是作为信息分子的糖类如何在细胞识别和信号传导中发挥作用[4]。为了研究糖类在细胞识别和信号传导中的作用首先要完成4个方面：什么是基因编码糖蛋白，即基因信息；实现被糖基化的位点，即糖基化信息；聚糖结构，即结构信息；糖基化功能，即功能信息[5]。目前预测细胞内超过５０％的蛋白质为糖蛋白，在这些糖蛋白中蛋白质是生理功能的主要承担者，而糖链则通过改变蛋白质的折叠方式、生物活性、溶解度、疏水性、聚合、降解、电荷、粘度及质量，对蛋白质的功能起修饰

作用。也即意味着糖可通过影响蛋白质的整体构象，从而影响由构象决定的所有蛋白质功白中分离纯化糖肽。糖组学研究的策略主要包括3 项内容：（1）收集单一个体中的全部聚糖亦即糖组；（2）锁定要研究的糖肽,并将糖组中的各种糖肽组分与基因组数据库相联系,最大限度地利用基因组的已有成果。否则，如果将聚糖与糖蛋白脱离，也就无法获得基因组信息；（3）研究包括cosmid ID、分子量和凝集素解离常数在内的特定糖肽的特征性质. 最后一点将是糖组学研究的主要内容[6]。

2.糖蛋白的结构与类型

蛋白中蛋白质肽链可在不同部位结合多个糖基或聚糖，含糖量一般为2% ～50%。糖基或糖链与蛋白质肽链的链接方式主要为O-连接和N-连接两种。参与糖肽键的氨基酸残基主要有：天冬酰胺(Asn)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、羟赖氨酸(Hyl)和羟脯氨酸(Hy p)。它们可以与N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺、木糖、半乳糖及阿拉伯糖形成5 种主要的糖肽键, 分别是:β-N-乙酰葡萄糖胺-天冬酰胺（GlcNAc-Asn)、α-N-乙酰半乳糖胺-丝氨酸/苏氨酸(GalNAc-Ser/Thr)、β-木糖-丝氨酸(Xyl-Ser)、β-半乳糖-羟赖氨酸(Gal-Hy l)、α-L-阿拉伯糖-羟脯氨酸(Ara-Hyp)。此外, 还发现罕见的以N-末端氨基酸残基为连接点的糖肽键, 存在于小鼠血红蛋白

A1c 中[7]。

3.糖蛋白的提取和分离纯化

糖蛋白往往存在于活体组织或者体外培养的细胞表面，属于膜蛋白，水溶性不好，其有效提取是糖组学糖链结构研究的瓶颈之一。目前常采用先制备质膜, 然后用去污剂释放或Triton X-114 相分离、有机溶剂萃取等方法提取糖蛋白。糖蛋白的分离制备常采用离子交换层析、凝胶过滤、凝集素亲和层析等方法获得，其中由几种不同类型凝集素亲合柱组成的序列凝集素亲合层析(SLAC)法是较好的方法[8]。在糖组学糖蛋白糖链结构研究中, 随着研究技术的发展, 也有不经过糖蛋白提取纯化的步骤而以整个细胞为研究对象, 直接对其表面糖蛋白糖链进行相关结构研究的，比如糖芯片法技术。尽管这种方法较为便捷, 但其所获得糖链结构信息比较有限。

4.糖链的获得

4.1糖捕捉法

一些游离糖、单糖和寡糖可与植物凝集素特异结合，通过不同凝集素柱可直接富集得到目标糖链。通过与糖组学组数据库结合使用, 这种方法能系统地鉴定可能的糖蛋白和糖基化位点, 目前大量用于糖组研究。常用的凝集素有刀豆素A（CoA）、半乳糖凝集素（LEC-6或GaL6）、花生凝集素（PNA）、橙黄网胞盘菌凝集素（AAL）等，但是值得注意的是不同类型的糖蛋白和糖肽需要使用不同的凝集素。具体过程如下[9]：（1）凝集素亲和层析-1( 用于糖蛋白分离)：凝集素柱的分离效果与要分离的糖蛋白的聚糖类型有关，因此不同组别糖蛋白的纯化步骤可以单独或串联使用不同的凝集素柱。（2）蛋白质消化:将分离得到的糖蛋白用相应的蛋白酶消化为糖肽。（3）凝集素亲和层析-2( 用于糖肽分离) : 采用与步骤1相同的凝集素柱从消化液中捕集目的糖肽。（4）得到糖链：用N-寡聚糖糖肽酶消化糖肽释放出肽链和糖链。（5）肽链和糖链分别经HPLC/MS分离鉴定并获得肽序列和糖链分子量。（6）结合已有的数据库，分析蛋白质和糖的结构信息。（7)然后,使用不同的凝集素柱进行循环，捕集其它类型的糖肽，以对某种糖蛋白进行较全面的糖组学研究。

4.2电泳法

硫酸化、唾液酸化的蛋白糖链可用电泳法分离纯化。中性蛋白糖链通过与硼酸作用形成带电的复合物，也可用电泳分离。电泳技术不仅可以对糖蛋白糖链进行一定的分离纯化, 还可以给出其相关结构信息。荧光辅助糖电泳(FACE)、毛细管电泳(CE)等是糖链分离纯化、结构解析的常用工具。糖链在荧光标记后进行的PAGE 电泳即FACE , 通过RAAM 法和标准糖链的比对可以给出目标糖蛋白糖链的结构信息,相关的N-糖链FACE 测序试剂盒已商品化。CE可快速分离分析微量糖链, 且不同缓冲体系中标准糖链的CE 行为构建的糖谱，可以用于相关未知糖链的结构鉴定。但CE 重现性不好, 目前还不能用于制备。SDS-PAGE 胶上酶解法可同时分析糖蛋白糖链结构和糖基化位点，适用于不易纯化或量少的样品，是糖组学糖蛋白糖链结