农杆菌介导的植物转基因技术
根瘤农杆菌介导植物转基因流程
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农杆菌介导遗传转化原理
!
冠瘿碱代谢基因
农杆菌转化植物的过程 •植物受伤部位酚类化合物的分泌 •附着（chvA、chvB） •VirA/G的双组分系统感受受伤信号 （signal to A Pi to G） •其他Vir基因的表达 •T-DNA链的切出（VirD1+VirD2；Border to Border） •T-complex的形成 •运输（从细菌中输出、进入入植物细胞、入入核） •整合
A
B
C
PCR（A）、RT-PCR（B）和 Southern（C）鉴定结果
影响植物农杆菌转化效率的因素 •植物品种（基因型效应）； •农杆菌菌株及载体； •起始材料； •侵染所用用菌浓度（OD值）； •共培养条件(温度、时间、光照、培养基成分)； •共培养之后的筛选方方式； 等等；
农杆菌介导的 植物遗传转化
农杆菌的分类 革革兰氏氏阴性菌、杆状； 按侵染植物的后果分为： •根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens） 形成冠瘿（crown gall） •发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes） 形成发根（hairy root）
按合成/代谢冠瘿碱（Opine）的种类，根癌农杆菌分为 ： •章⻥鱼碱（Octopine）型 •胭脂碱（Nopaline）型 •农杆碱（Agropine）型
The Plant Cell, Vol. 18, 3350–3352
冠瘿病的害处： 苗木木感病后发育受阻；生生⻓长缓慢；植株矮小小；严重 时叶片片萎蔫、早衰，甚至至死亡； 大大树受害后树势衰弱，生生⻓长不良，提前落叶，果实 变小小，树龄缩短。主干受害降低材质及工工艺价值。
农杆菌能够导致植物产生生冠瘿病的原因： Ti（Ri）质粒
•T-complex的转运 通过细菌细胞壁上由11个VirB蛋白白和VirD4组成的通 道从农杆菌向外输出
一种发根农杆菌介导的转基因杨树的构建方法和其应用
一种发根农杆菌介导的转基因杨树的构建方法和其应用一种常用的发根农杆菌介导的转基因杨树的构建方法是利用农杆菌介导的遗传转化技术。
该方法主要包括以下步骤：1. 构建转基因载体：首先，选择合适的载体，如农杆菌受体质粒(pCAMBIA系列)。
然后，将目标基因的编码序列插入到载体的适当位点上，并添加合适的启动子、终止子等调控元件。
2. 农杆菌培养：接下来，将构建好的转基因载体转化到农杆菌中，将该菌株在适宜的培养基中培养至菌液浓度达到一定程度。
3. 植物杨树的样本处理：从要转化的杨树中取一些新生芽或叶片作为样本，进行消毒处理，以去除杂菌。
4. 农杆菌介导的遗传转化：将农杆菌菌液和杨树样本共同处理，可以通过浸泡法、伤口注射法或利用农杆菌耐冻性侵染方法等手段。
5. 培养和筛选转基因杨树：将处理后的样本在适宜的培养基上进行培养，待转基因杨树生长出来后，利用适当的筛选方法去除未转化的杨树细胞。
6. 鉴定转基因杨树：对转基因杨树进行PCR扩增、Southern杂交等方法进行鉴定，确定其是否成功转化。
7. 进一步培养和繁殖：将鉴定通过的转基因杨树进行进一步培养和繁殖，以得到足够数量的转基因杨树。
转基因杨树的应用主要包括以下几个方面：1. 抗逆性提高：通过引入耐盐、耐干旱、耐寒等抗逆基因，增强杨树对环境逆境的适应能力，提高生存率和产量。
2. 木质纤维改良：通过引入纤维素合成相关基因，增强杨树木质纤维的产量和质量，提高杨树的木材利用价值。
3. 生物能源生产：通过引入生物质降解酶的基因，增强杨树木质纤维的降解能力，提高生物能源的产量。
4. 农药抗性改良：通过引入抗虫、抗病等相关基因，提高杨树对害虫和病原体的抵抗能力，减少农药的使用。
5. 环境修复：通过引入重金属吸收、分解等相关基因，增强杨树对重金属的吸附和分解能力，用于环境修复和污染治理。
总之，农杆菌介导的转基因杨树的构建方法可以为杨树的遗传改良提供途径，具有重要的应用价值。
农杆菌介导的植物转基因技术
农杆菌介导的植物转基因技术
农杆菌介导的植物转基因技术（Agrobacterium-mediated plant transformation）是一种常用的植物遗传转化技术。
该技术利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）作为载体，将外源基因
导入目标植物细胞，使其产生转基因植物。
农杆菌天然具有植物细胞转化的能力。
当农杆菌感染植物时，其携带的质粒（T质粒）能够在植物细胞中插入外源基因，并
将其转化为转座子形式，随后将其整合入宿主植物基因组中。
转座子通常包含目标基因、转座酶和调控序列，它们共同确保外源基因正确表达。
T质粒还携带有自身所需的发育激素和植
物生长调节物质，以维持转化后细胞的生存和分裂。
农杆菌介导的植物转基因技术具有许多优点。
首先，它可以用于许多不同植物物种的基因转化。
其次，该技术可以实现整株或局部的基因转化，包括细胞、组织、器官或整个植株。
此外，农杆菌介导的转基因技术可实现稳定遗传转化，外源基因可以遗传到植物后代中。
最后，该技术对植物基因组中的特定位点插入外源基因，使得外源基因可以与内源基因进行正常结合。
随着转基因技术的不断发展，农杆菌介导的植物转基因技术仍然广泛应用于研究和农业生产领域。
它为植物功能研究、抗病虫害、提高产量和改善品质等方面提供了有效手段。
然而，农杆菌介导的转基因技术也面临着一些挑战，如转化效率低、插入位点随机性以及响应植物抗性等问题。
因此，研究人员不断探索新的转基因技术和改进农杆菌介导的植物转基因技术的方法，以改善转基因植物的性状和应用。
转基因技术——动植物转基因方法
转基因 技术
【DAWN_ZX】
转基因技术的步骤
转基因 技术
STEP4：目的基因的检测和表达
1.检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目 的基因。 方法：采用DNA分子杂交技术。 2.检测目的基因是否转录出了mRNA。 方法：采用用标记的目的基因作探针与 mRNA 杂交。 3.最后检测目的基因是否翻译成蛋白质。 方法：从转基因生物中提取蛋白质，用相应的 抗体进行抗原－抗体杂交。 4. 进行个体生物学水平的鉴定。
转基因 技术
【DAWN_ZX】
动物转基因方法
原核显微注射法
胚胎干细胞介导法 逆转录病毒载体法 精子介导的基因转移 核移植转基因法 体细胞核移植法 线粒体介导法
转基因 技术
【DAWN_ZX】
动物转基因方法
原核显微注射法（最常用） •方法：将外源基因注射到受精卵细胞的原核内，
外源基因与胚胎基因组融合后体外培养， 移植到 受体母畜子宫内发育，这样分娩的动物体内的每一 个细胞都含有新的DNA片段。 •缺点：效率低、位置效应(外源基因插入位点随 机性)造成表达结果有不确定性、动物利用率低。 反刍动物繁殖周期长，有较强的时间限制、需要大 量的供体和受体动物。
转基因 技术
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植物转基因方法 基因枪介导转换法
•方法：利用火药爆炸或高压气体加速将包裹
了带目的基因的DNA溶液的高速微弹直接送入 完整的植物组织和细胞中，然后通过细胞和组 织培养技术，再生出植株，选出其中转基因阳 性植株即为转基因植株。 •优点:不受受体植物范围的限制，而且其载 体质粒的构建也相对简单，是目前转基因研究 中应用较为广泛的一种方法。
转基因技术的步骤 STEP2：基因表达载体的构建
目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且 可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥 作用。 组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因 标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含 有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出 来。常用抗生素基因。
农杆菌介导转基因植物t-dna的整合方式
农杆菌介导转基因植物t-dna的整合方式
农杆菌介导转基因植物T-DNA的整合方式
农杆菌介导转基因植物T-DNA的整合方式是指利用农杆菌介导技术将外源基因导入植物基因组中的过程。
农杆菌介导转基因技术是一种常用的植物遗传转化技术，通过该技术可以将外源基因导入到植物细胞中，并将其整合到植物基因组中，从而实现对植物性状的改良和优化。
农杆菌介导转基因植物T-DNA的整合方式主要包括以下几个步骤：
1. 农杆菌感染：首先需要将含有目标外源基因的质粒导入到农杆菌中，然后利用农杆菌的特殊途径将质粒中的T-DNA片段转移到植物细胞中。
2. T-DNA整合：一旦T-DNA片段进入到植物细胞中，它会与植物基因组中的某个位置发生重组，从而将外源基因整合到植物基因组中。
这个过程是随机的，T-DNA片段可以整合到植物基因组的不同位置。
3. 外源基因表达：一旦T-DNA片段整合到植物基因组中，外
源基因就可以在植物细胞中得到表达，从而产生目标蛋白质或RNA。
4. 遗传稳定性：经过一系列的培养和筛选，可以获得稳定遗传的转基因植物株系，这些植物株系可以传递给下一代，从而实现外源基因在植物种群中的稳定传递和表达。
农杆菌介导转基因植物T-DNA的整合方式是一种高效、可靠
的转基因技术，它已经被广泛应用于多种重要农作物的遗传改良和品种选育中。
通过这种技术，可以实现对植物抗病、抗虫、耐逆性等重要性状的改良，为农业生产提供了强有力的技术支持。
同时，随着分子生物学和生物技术的不断发展，农杆菌介导转基因植物T-DNA的整合方式也在不断完善和优化，为农
作物遗传改良和新品种选育提供了更加强大的技术平台。
农杆菌转化法及转基因植物检测方法
农杆菌转化法及转基因植物检测方法摘要：近年来，植物基因工程技术飞速发展，转基因植物在很多领域的研究推广取得了令人瞩目的成绩。
植物基因工程中常用的转化方法一般是通过土壤农杆菌系统、植物病毒系统和DNA直接导入法这三种方法进行。
另外，转基因技术快速发展的同时转基因植物检测技术也在不断地进歩和完善，目前被广泛应用的转基因植物检测方法有三类：整合水平上的检测、转录水平上的检测和表达水平上的检测。
本文着重对农杆菌介导的植物转化方法和转基因植物的检测两方面进行综述。
关键词：农杆菌，转化，转基因植物，检测方法伴随着生命科学的飞速发展，植物组织培养技术以及植物组织分化、植物基因重组等技术发展迅速并得到广泛应用。
1984年转基因烟草的诞生[1]，使外源基因导入植物细胞从而获得转基因新品种的设想成为现实。
随后，转基因技术被广泛应用于各个方面如：植物新品种的改良、植物性状改良、植物抗性的提高以及植物基因功能的研究等[2-4]。
新型转基因大豆、转基因番茄及转基因玉米等转基因新品种陆续面世[5]。
植物转基因技术不但能够打破植物的物种界限，还能够使物种基因彼此进行交流。
使植物育种年限缩短，植物育种进程加快，植物抗性也在一定程度上得到很大提高，使来自于不同生物种类的优良目的基因导入植物并得到优良植物新品种。
同时，运用转基因技术研究植物自身基因结构组成及其基因功能调控等方面也取得了一定成果；运用转基因技术还研制出生物反应器和雄性不育系[6]。
目前，利用转基因技术将目的基因导入植物基因组中的常用方法主要有：土壤农杆菌介导的基因转化、DNA直接导入和植物病毒系统介导法。
本文着重介绍土壤农杆菌介导的目的基因转化法，同时也对目前转基因植物的检测进行适当总结。
1 土壤农杆菌介导系统的种类土壤农杆菌中的发根农杆菌和根癌农杆菌能够侵染植物伤口并形成与土壤农杆菌中大质粒有关的植物肿瘤和冠瘿。
能够诱发此类肿瘤的根瘤农杆菌中常常带有分子量为200-250kb的Ti质粒。
转基因技术动植物转基因方法
转基因技术动植物转基因方法转基因技术是一种现代生物技术，通过对生物体的基因进行修饰和重组，从而实现特定的性状改良或新性状的引入。
在动植物领域，有多种转基因方法被广泛应用，以下将为您详细介绍。
一、动物转基因方法1、显微注射法这是动物转基因技术中最常用的方法之一。
其基本原理是在显微镜下，将经过处理的外源基因直接注射到受精卵的雄原核中。
因为雄原核较大，更容易容纳和整合外源基因。
注射后的受精卵经过培养和筛选，然后移植到代孕母体的子宫内，最终发育成转基因动物。
这种方法的优点是操作相对直接，成功率较高；但缺点是技术难度大，对设备和操作人员的要求较高，且可能会对受精卵造成一定的损伤。
2、病毒载体法利用病毒作为载体将外源基因导入动物细胞。
经过改造的病毒失去了致病性，但仍能携带外源基因并将其整合到宿主细胞的基因组中。
常用的病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒等。
此方法的优势在于转染效率较高，能够感染多种类型的细胞；然而，病毒载体的容量有限，可能引起免疫反应，且存在潜在的生物安全风险。
3、胚胎干细胞介导法首先从早期胚胎中分离出胚胎干细胞，然后通过基因工程技术将外源基因导入胚胎干细胞。
经过筛选和鉴定，含有外源基因的胚胎干细胞被重新注入到囊胚腔中，与囊胚细胞融合，形成嵌合体胚胎。
最后将嵌合体胚胎移植到代孕母体子宫内发育。
这种方法可以实现精确的基因修饰，但胚胎干细胞的培养和操作难度较大。
4、体细胞核移植法先将供体细胞进行基因修饰，使其携带外源基因，然后将供体细胞的细胞核移植到去核的卵母细胞中，构建重组胚胎，再将重组胚胎移植到代孕母体中发育。
这种方法的优点是可以获得大量遗传背景相同的转基因动物，但技术流程复杂，成功率相对较低。
二、植物转基因方法1、农杆菌介导转化法农杆菌是一种天然的植物基因转化载体。
当植物受伤时，农杆菌会感染植物，并将其携带的一段 DNA（称为 TDNA）转移并整合到植物基因组中。
在转基因操作中，将含有目的基因的 TDNA 载体导入农杆菌，然后用农杆菌感染植物细胞，从而实现目的基因的转化。
根癌农杆菌介导的植物遗传转化1
实验三根癌农杆菌介导的植物遗传转化一实验目的了解植物遗传转化的方法和理论掌握根癌农杆菌介导的遗传转化技术二原理植物遗传转化技术是指通过物理的，化学的或生物学的方法，将外源的基因导入受体植物细胞中获得再生植株的转基因技术。
自1983转基因植物问世以来，至今不到20年时间里，植物转基因技术发展迅速，除了占指导地位，运用最为广泛的农杆菌介导法，还发展了10多种转基因方法，如物理方面的基因枪法，电激法，显微注射法，超声波法，激光微束法，炭化硅纤维介导法，电泳法等；化学方面PEG介导转化，脂质体介导转化；生物学方面的种质系统法如花粉介导法，花粉管通道法等。
农杆菌介导法土壤农杆菌（Agrobacterium）是一种革兰氏阳性菌，有两个种与植物转基因有关，即根癌农杆菌（Agrobacterium Tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium Rhizogenes）.它们在自然状态下具有趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠缨瘤或发状根，在离体条件下，可以在不加任何生长素的培养基中持续生长，研究表明根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti 和Ri质粒,上面有一段T-DNA区，可以通过一系列过程进入植物细胞并将这一段T-DN插入到植物基因组中，这是农杆菌侵染植物后产生冠缨瘤或发状根的根本原因，因此农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系，人们可将所构建的目的基因插入到去除了致瘤基因的Ti(Ri)质粒的T-DNA区，借助农杆菌侵染受体植物细胞后T-DNA向植物基因组的高频转移和整合特性，实现目的基因对受体植物细胞的转化，然后通过植物细胞合和组织培养技术，利用植物细胞的全能性获得转基因再生植株。
农杆菌介导法转基因技术的关键是T-DNA整合受体植物基因组的过程，这一过程依赖与Ti质粒上的T-DNA区，和Vir区各种基因的表达以及一系列蛋白质和核酸的相互作用。
简略地说。
其过程是：植物细胞在受伤后细胞壁破裂，分泌高浓度的创伤诱导分子，它们是一些酚类化合物，如乙酰丁香酮（acetosyringone,AS）和羟基乙酰丁香酮（hydroxy- acetosyringone,OH-As）农杆菌对这类物质具有趋化性，首先在植物细胞表面发生贴壁，继而植物创伤分子诱导农杆菌Vir区各种基因的激活和表达。
植物转基因技术
植物转基因技术植物转基因技术，也被称为植物基因工程技术，是一种利用生物技术手段改造植物基因组的方法。
通过将外源基因导入植物细胞中，植物转基因技术使得植物获得了新的性状或功能，从而在农业、环境保护和医药等领域带来了革命性的变化。
一、植物转基因技术的原理和方法植物转基因技术主要依靠DNA分子的重组和重构完成。
其中，常用的方法包括基因枪法、农杆菌介导转化法和双链RNA法。
基因枪法是将外源基因通过微粒轰击的方式送入植物细胞中，使得外源基因插入目标植物基因组中。
农杆菌介导转化法则通过利用农杆菌将外源基因转移到植物细胞中。
双链RNA法则是通过RNA干扰的方式，引导RNA分子与目标基因互作，从而达到基因沉默的目的。
二、植物转基因技术的应用植物转基因技术在农业领域中有着广泛的应用。
常见的转基因植物作物包括转基因水稻、转基因玉米、转基因大豆等。
这些作物通过引入耐草酮类和杀虫剂抗性基因，提高了作物的抗蚜、抗虫能力，从而减少了农药的使用量。
此外，转基因作物还能够抵抗病毒、细菌和真菌等各类病害，提高了作物的产量和质量。
植物转基因技术在环境保护领域也有重要的应用。
通过转基因技术改造植物的性状，例如增加植物的污染物吸收能力和金属离子富集能力，可以用于修复受到污染的土壤和水源。
此外，转基因技术还可以改善植物的耐旱、抗盐性能，以应对气候变化和土地退化等问题。
植物转基因技术还在医药领域有着巨大的潜力。
通过转基因技术，植物可以成为生产蛋白质药物和疫苗的“生物工厂”。
例如，转基因植物可以表达人类胰岛素、乳制品过敏症患者所需的乳头素等蛋白质，用于治疗糖尿病、乳制品过敏等疾病。
三、植物转基因技术的争议和风险尽管植物转基因技术在农业、环境保护和医药领域带来了巨大的潜力，但它也面临着一些争议和风险。
其中，最主要的争议之一是关于转基因食品的安全性问题。
有人担心转基因食品对人体健康产生潜在影响，而另一些人则认为已有的科学研究没有证明转基因食品有害。
农杆菌介导的植物转基因技术试验指导
农杆菌介导的植物转基因技术一、实验目的1 了解低温离心机、恒温振荡培养箱、超净工作台等仪器的使用。
2学习真核生物的转基因技术及农杆菌介导的转化原理；掌握农杆菌介导转化植物的实验方法，了解转基因技术的操作流程。
二、实验原理农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。
农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。
因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。
人们将目的基因插入到经过改造的丁-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。
实验一培养基配制一、仪器和试剂1、仪器：高压灭菌锅，超净工作台2、药品：Beef extract （牛肉浸膏）5g/L，Yeast extract （酵母提取物）1g/L， Peptone （蛋白胨）5g/L，Sucrose （蔗糖）5g/L，100ml，Agar （琼脂）100ml， MS粉，有机溶液，肌醇，Fe盐，NAA （萘乙酸），6-BA（6-苄氨基腺嘌吟），卡那霉素（kan），利福平（"「，链霉素（str）。
二、实验方法第一组配制YEB固体培养基1、配制250mlYEB固体培养基：先称取Beef extract （牛肉浸膏）；Peptone （蛋白胨）；Yeast extract （酵母提取物）；Sucrose （蔗糖）；1g ；琼脂粉；将上述药品置于250ml三角瓶中，用量筒称取200ml蒸馏水将其溶解混匀，然后再定容至250ml,用NaOH调pH=。
2、灭菌：将盛有250ml培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。
3、抗生素的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到50-60℃时（手可触摸）加入已经过滤好的抗生素（100ug/ml kan+50Dg/ml Str+50ug/ml rif）,以免温度过高导致抗生素失效。
农杆菌介导转化方法
农杆菌介导转化方法农杆菌介导转化方法是一种常用的基因转化技术，广泛应用于植物、微生物等领域。
本文将介绍农杆菌介导转化方法的原理、步骤和应用。
一、原理农杆菌介导转化方法是利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）作为载体，将外源基因导入目标细胞中的一种方法。
农杆菌是一种自然界广泛存在的土壤细菌，它能将其自身的DNA转移到植物细胞中，从而导致植物发生病理性变化。
利用这一特性，科学家将目标基因插入到农杆菌的载体DNA中，通过农杆菌的感染作用，将目标基因导入到目标细胞中。
二、步骤农杆菌介导转化方法通常包括以下几个步骤：1. 农杆菌培养：首先需要将含有目标基因的农杆菌培养至适宜的生长期，以保证其感染能力。
2. 植物处理：将目标植物的组织经过表面消毒处理，然后将其切割成小片或小块，以增加接触面积。
3. 农杆菌感染：将培养好的农杆菌与植物组织接触，使其感染植物细胞。
通常使用浸泡法或注射法进行感染。
4. 抗生素筛选：在感染后的组织中加入适当浓度的抗生素，以筛选转化成功的细胞。
只有携带目标基因的细胞才能够存活下来。
5. 培养和再生：将筛选出的转化细胞进行培养和再生，形成转基因植株。
三、应用农杆菌介导转化方法已成功应用于多种植物和微生物中，具有以下几个优点：1. 高效性：农杆菌介导转化方法可以在较短时间内实现大量基因转化，且转化效率较高。
2. 转基因稳定性：通过农杆菌介导转化方法获得的转基因植株通常具有较高的遗传稳定性，能够稳定地传递给下一代。
3. 广泛适用性：农杆菌介导转化方法适用于多种植物和微生物，包括农作物、果树、花卉等。
可以用于改良作物的品种、抗病性、耐逆性等性状。
4. 无需种子：与传统的植物遗传改良方法相比，农杆菌介导转化方法无需使用种子，能够直接利用植物的组织进行转化，节约了时间和资源。
5. 无需外界辅助：农杆菌介导转化方法不需要借助特殊设备或昂贵试剂，只需在实验室条件下进行即可。
农杆菌介导的转化作用原理
农杆菌介导的转化作用原理
农杆菌介导的转化是一种生物技术方法，用于将外源DNA引入植物细胞中。
其原理是利用农杆菌生长势旺盛、易于培养的特点，将目标外源DNA导入到农杆菌的质粒中，形成重组质粒。
然后通过将转化质粒与植物细胞接触，使其外源DNA传递到植物细胞内部。
具体步骤如下：
1. 构建重组质粒：在质粒中插入目标外源DNA，通常使用限制性内切酶将目标基因插入到质粒的多克隆位点（多克隆位点是一段DNA序列，能够容纳外源DNA）。
2. 转化农杆菌：将质粒导入到农杆菌中，使其质粒与细菌细胞融合，形成重组菌株。
3. 培养菌株：培养重组菌株，使其扩增到大量细胞。
4. 处理植物组织：将希望转化的植物组织（例如幼嫩的叶片或胚）与农杆菌接触，使农杆菌与植物细胞发生互作用。
5. 重组质粒转入植物细胞：通过机械方法（例如悬浮培养）或生理方法（例如创伤诱导），使农杆菌穿过植物细胞的细胞壁，使重组质粒进入植物细胞。
6. 重组质粒在植物细胞中复制和表达：重组质粒在植物细胞中复制，并将插入的目标基因转录和翻译为蛋白质。
通过农杆菌介导的转化方法，可以有效地将外源基因导入到植物细胞中，实现基
因转移和基因表达的目的。
这种方法在植物基因工程和转基因技术中得到广泛应用。
农杆菌介导遗传转化原理
农杆菌介导遗传转化原理农杆菌介导遗传转化是一种常用的遗传工程技术，用于将外源基因导入植物细胞中。
它的原理是利用农杆菌与植物之间相互作用的特点，通过构建适当的载体将外源基因导入农杆菌，然后通过农杆菌感染植物的细胞，将外源基因转移到植物细胞内，使其表达。
农杆菌是一种革兰氏阴性细菌，具有携带可导致植物组织的病变形成的质体。
这种质体称为农杆菌的转座质粒（Ti质粒），其中包含了表达病原蛋白的基因。
在自然界中，农杆菌通过感染植物细胞并将自身质粒中转座基因转移到植物细胞中，从而引起植物组织的异常增生和瘤形成。
1.构建适当的载体：首先需要构建一个适合农杆菌介导遗传转化的载体，该载体通常包含农杆菌的图纸质粒与外源基因。
2. 转座基因的导入：将外源基因转移到农杆菌中，一般利用基因工程技术将外源基因插入到农杆菌的质粒中，通常选用表达农杆菌亲和素（VirA/VirG）基因的质粒。
这些基因能够诱导农杆菌感染植物细胞并转座到植物基因组中。
3. 农杆菌感染植物细胞：利用农杆菌对植物细胞的感染能力，将转座基因导入植物细胞中。
通常使用离体培养的植物组织进行转化，如幼苗的叶片、幼芽、胚轴等。
在转化过程中，植物组织被浸泡在含有农杆菌的培养液中，农杆菌利用其细菌素（VirE/VirF）蛋白，将转座质粒导入植物细胞中。
4.外源基因的整合与表达：经过转化的植物细胞在激素的诱导下会形成植物的癌瘤样结构，其中农杆菌转座质粒中的外源基因将被整合到植物基因组中。
随着癌瘤的生长，外源基因会在植物组织中得到表达。
5.植物再生和筛选：癌瘤样组织可通过激素的去除和调节激素比例来诱导植物再生。
然后通过选择合适的培养基和条件培养植物胚，获得含有外源基因的转基因植株。
农杆菌介导遗传转化技术广泛应用于植物基因工程中，可用于植物基因功能研究、育种改良、生产含有特定蛋白质的转基因植物等。
这种遗传转化技术具有高效性、简便性和广泛适用性的优点，已被应用于多种作物植物的转基因研究和应用实践中。
(完整版)农杆菌介导法
Ti质粒
Ti质粒是根癌农杆菌 细胞核外存在的一种 环状双链DNA分子， 长度约200kb，平均 周长54.1－75 .4 um， 分子质量为（90－ 150）×106 Da。在温 度低于30℃的 条件下， Ti质粒可稳定地存在 于根癌农杆菌细胞内。
的冠瘿碱类型分为三类：章鱼碱(octopine)类 胭脂碱(nopaline)类 农杆碱（agropine） 类。
Ti质粒携带着既能分解又能合成这些化合物的酶类和相应 基因，然而冠瘿碱合成基因却不能在根癌农杆菌中表达， 它们只有进入植物细胞后才能表达，Ti质粒上的冠瘿碱分 解基因产物却能分解冠瘿碱，为宿主细胞提供能源、氮源 和碳源。
子的刺激，Ti质粒vir区毒性
基因被激活和表达。
目前已经发现9种信号因子，均为水溶性酚类化合物。 其中乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）和羟基乙酰 丁香酮（OH-AS）的作用较强，儿茶酚、原儿茶酚、没 食子酸、焦性没食子酸、二羟基苯甲酸、香草酚和对羟 基苯酚处理农杆菌时也对Vir区的基因表达起促进作用。
脂碱型根癌农杆菌Ti质粒中TDNA的左右两侧是一段24bp 的重复序列,构成T-DNA的边 界序列(border sequence), 分别称为左边界(left border,LB)和右边界(right border,RB).在某些章鱼碱型 根癌农根癌农杆菌Ti质粒中TDNA是以两个分开的独立片 段形式存在，即T-DNA左边 区段和T-DNA右边区段。研 究表明，插入在T-DNA边界 序列之间的任何DNA都可被 转到植物染色体中。因此Ti质 粒可用做外源目的基因的载 体。
农杆菌介导转化法
农杆菌介导转化法的概述完整版
农杆菌介导转化法的概述完整版农杆菌介导转化法（Agrobacterium-mediated transformation）是生物技术领域中常用的一种基因转化技术，它是利用植物病原细菌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens 或 Agrobacterium rhizogenes）在哺乳动物细胞和植物细胞之间转移DNA的过程.Ti质粒在不同的农杆菌株中具有普遍性，主要包含两个部分，一部分是右边界（RB）和左边界（LB）之间的T-DNA区域，另一部分是辅助基因的区域。
T-DNA区域是真正起作用的区域，它包含多个基因，其中最重要的是含有颠倒重复序列的两个直接重复序列（Direct Repeat，DR）以及插入块（Insert）。
在农杆菌内部，T-DNA区域通过辅助基因的编码产物，如细菌激素合成生物合成酶（enzymes），被剪切出来。
剪切后的T-DNA区域携带着颠倒重复序列的两个直接重复序列（DR），与全身黑素瘤疫斑细菌的Direct Repeat（DR）高度相似，它作为单链向外产生（unidirectional）的。
Ti质粒上还存在两个移去片段（Removal Sequences）的辅助基因，它们能够结合T-DNA的两个断点，从而使T-DNA脱离质粒。
1.选择合适的农杆菌菌株：选择具有较高转化效率且对目标植物亲和性强的农杆菌株。
2.制备适宜的载体：选择合适的Ti质粒载体，可根据需要进行修饰和改造，添加目标基因、标记基因和选择基因等。
3.构建转化质粒：将目标基因和其它所需基因与农杆菌Ti质粒进行重组，得到构建好的转化质粒。
4.培养农杆菌：将重组后的质粒转化到农杆菌中，然后利用适宜的培养基进行培养和增殖，以形成菌液。
5.感染植物细胞：将培养好的农杆菌菌液与目标植物细胞接触，通过创伤组织或利用组织培养等方式实现细菌进入植物细胞内部。
6.培养转化物：将感染的组织培养在适宜的培养基上，培养一段时间，以使转化进行进一步发展，形成完整的植株。
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（五）侵染转化
将预培养的红花子叶放入 菌液中浸染8-25min，在侵染过 程中轻轻摇晃，确保菌液充分进 入到红花子叶中。
（六）除菌
取出外植体，将其放在无菌 滤纸上，充分吸干菌液，避免菌
液残留在红花子叶上，使其在培
养过程中，菌液过量生长。
（七）侵染后的培养
首先将红花子叶置于共培养上，使其生长。培养一周后，将其转入
八、思考题
1、农杆菌转化的基本步骤有哪些？ 2、农杆菌遗传转化的优缺点？ 3、哪些措施可以提高农杆菌介导的转化率？
培养基中，进行液体振荡培 养，28℃,180rpm，制备用 于侵染转化的工程菌。
（三）离心，收集菌体
将农杆菌离心，2000
rpm，10min，收集菌体,
目的是去除细菌培养基 的高浓度盐。
（四）重悬菌体
用液体MS培养基将菌 体用移液枪吹打起来， 使菌体重新悬浮，其目
的是减少细菌培养基对
植物体的伤害。
分化培养基上，进行培养，待其诱导分化出不定芽后，继续培养，不定
芽分化成苗后，将其移入生根培养基中，培养获得转基因植株。
六、实验结果
农杆菌侵染时间 8min 10min 12min 15min 20min 25min
外植体数量
10
10
10
10
10
10
染菌情况
分化情况
转化率
七、注意事项
1、在操作过程中，一定要保证无菌，整个操作过程均需要再无菌 的条件下完成。 2、进入超净工作台前，要检查紫外灯是否关闭，避免对皮肤造成 损害。 3、进入超净工做台进行实验时，要进行表面消毒，用酒精喷洒并 擦净台面和双手。
phaP Target gene phaT 35S Bar NOS(A)
R B
PstI
XmnI
NcoI
HindIII
kpnI
speI
五、实验方法
（一）农杆菌菌液的制备
用牙签蘸取农杆菌，在
YEB培养基上划线，达到纯
化农杆ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ的目的。
（二）制备工程菌（摇菌）
用牙签挑取划线得到的
单菌落，将其置于YEB液体
整
合
。
四、实验仪器与试剂
1、仪器：超净工作台，离心机，恒温摇床，组织培养室；
2、试剂：农杆菌EHA105，YEB培养基，MS液体培养基，共培
养基（MS+6-BA+NAA），分化培养基（MS+6-BA）
生根培养基（MS+IBA+NAA）；
3、材料：红花无菌苗。
改造后的农杆菌的T-DNA区，含有目的地基因和Bar筛选基因 L B
分子生物学操作技术之实验五
农杆菌介导的植物转基因技术
讲课人：杨晶
一、转基因植物概述
转基因玉米
转基因辣椒
转基因玫瑰
日闭幕的东京国际花卉博览会上，全球首批真正的蓝玫瑰首次在公众面前亮相。
二、实验目的
1、学习真核生物的转基因技术及农杆菌介导的转化原理； 2、掌握农杆菌介导转化植物的实验方法，了解转基因技术 的操作流程。
三、实验原理
根癌农杆菌，属根瘤菌科，为革兰
农杆菌 感染柳树 产生 冠瘿瘤
氏阴性。根癌农杆菌感染双子叶植物时，
可在被感染的伤口形成冠瘿瘤 , 诱导有 关的质粒为Ti质粒 。Ti质粒上有一段TDNA区，人们将外源基因插入到TDNA 区，借助农杆菌的感染使携带外 源基因的 T-DNA 区转入植物基因组中， 从而实现外源基因向植物细胞的转移和