[原创]-Western-blot转膜整个过程

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Western Blot技术详细操作步骤

Western Blot技术详细步骤蛋白质印记（Western Blot）是一种常用的生物技术，用于检测特定蛋白质在细胞提取物中的存在。

Western Blot基本步骤如下：1. 准备样品和设备：收集细胞或组织样品，然后使用适当的细胞裂解缓冲液将细胞破碎。

前处理样本并测定蛋白质浓度。

准备凝胶电泳设备，包括聚丙烯酰胺凝胶和Tris-glycine SDS运行缓冲液。

2. 凝胶电泳：将处理好的样品与样品缓冲液混合并加热，然后将其加载到凝胶孔中。

接着将预染蛋白质分子量标记也加载至凝胶中。

开始分子量依赖的电泳，使蛋白质在凝胶中分离。

3. 转印：将蛋白质从凝胶转移到结构更加稳定的膜载体，如聚偏氟乙烯（PVDF）或者硝酸纤维素膜。

使用电转印或半干转印设备进行转移。

4. 封闭：为防止非特异性结合，使用5%无脂奶粉或BSA溶于TBST （Tris-缓冲的盐水加Tween 20）在膜上进行封闭。

一般封闭时间约为1小时，根据实验需求可调整。

5. 第一抗体孵育：将特异性的一抗稀释（通常为多克隆或单克隆抗体），然后在封闭液中孵育膜。

根据抗体浓度与孵育时间进行相应优化。

6. 清洗：使用TBST清洗膜，以去除未结合的一抗。

通常需要清洗3次，每次5-10分钟不等，避免一抗非特异性结合。

7. 第二抗体孵育：将标记有荧光或酶的二抗稀释后，再次孵育膜。

封闭液中的二抗通常是与一抗长在不同宿主动物中的特异性抗体。

孵育时间需要优化。

8. 清洗：再次清洗膜，以去除未结合的二抗。

重复步骤6的清洗方法。

9. 检测：将膜放入检测设备中，如化学发光仪、荧光扫描仪等。

等待信号产生并记录结果。

测定蛋白质相对表达量的强度并进行定量分析。

10.数据分析：使用图像处理软件进行定量分析，如ImageJ等软件，并进行归一化处理，一般以内参蛋白（如β-actin, GAPDH等）数据为基准。

以上就是蛋白印记的基本操作步骤，具体细节及操作条件可能因实验室环境和试剂不同而有所差异。

western blot实验流程(自己整理)

Western Blot实验步骤1.制胶2.细胞蛋白抽提步骤1.提前预冷离心机，溶解lysis buffer；2.将细胞沉淀置于冰上；1ml PBS重悬，4℃离心5min，（除去样中微量血清）；3.每107cells加裂解工作液100ul，轻轻重悬细胞沉淀；4.置冰上10min，其间振荡2-3次；5.13000rpm离心10min，4℃；6.将上清转到小离心管中；7.取出1ul，用于Bradford测定蛋白浓度（ug/ul）=（样本OD值的平均值-对照OD值平均值）*斜率100℃，5min；提前预热。

中间打开盖子1~2次。

6.上样电泳（100V，90min）向电泳槽中加入电泳缓冲液，使两块玻璃内侧电泳液高于上样孔，外侧电泳槽内电泳液浸没凝胶底部。

玻璃板内侧液面高于外侧。

然后开始上样，保证每孔总蛋白量在30-50ug,总上样量小于30ul,注意上样时间尽量短，避免样品扩散。

上样完毕，盖好电泳槽的盖子，注意正负极，并选择适当的电压进行电泳。

通常在不连续的系统中，上层浓缩胶的电泳电压(建议70-80V)要低于分离胶电泳电压(建议90-110V)，以达到更好的浓缩效果，使样品进入分离胶时被压缩在同一水平线上。

电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处停止电泳，电泳时间约2-3 小时。

电泳时间根据具体情况定。

7.转膜（250mA，1h 30min）转膜顺序：阴极碳板+海绵+三滤+胶+膜+三滤+海绵+阳极碳板湿式电转膜1. 电泳结束后取出凝胶，在转膜缓冲液中漂洗数秒。

按“三明治”模式，打开电转印夹，每侧垫上一块专用的用转膜液浸泡透的海绵垫，再各放一块转膜液浸透的快速高效蛋白转移垫(定性滤纸），将凝胶平放在阴极侧滤纸上，最后将转膜液浸透博士德硝酸纤维素NC 膜平放在凝胶上，去除气泡，夹好电转印夹，注意NC 膜与胶，NC 膜与滤纸，滤纸与胶之间不可有气泡。

2. 转印槽加满转膜缓冲液，插入电转印夹，将转印槽放入冰箱内（-20℃），确保NC 膜最靠近正极，带负电的氨基酸和蛋白质向正极迁移。

Western blot详细操作过程

Western BlotWestern Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄（NC ）膜或聚偏二氟乙烯（PVDF ）膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。

流程：蛋白样品的提取→蛋白样品定量与变性→PAGE 凝胶电泳→转膜→丽春红染色→封闭→抗体孵育→底物显色。

实验器材和试剂：一．蛋白提取试剂1.10% SDS 裂解液：称取10g SDS 粉末加入双蒸水至90mL ，充分溶解，定容至100ml 室温保存。

2.RIPA 裂解液1ml 裂解液工作液配方： 10ul 100mmol/L PMSF (1mM) 0.2ul 10mg/ml Aprotinin (2ug/ml) 5.0ul 1mg/ml Leupeptin (5ug/ml)0.9848ml 裂解液0.5ml 裂解液工作液配方： 5ul 100mmol/L PMSF (1mM) 0.1ul 10mg/ml Aprotinin (2ug/ml) 2.5ul 1mg/ml Leupeptin (5ug/ml)0.4924ml 裂解液 PMSF 必须摇匀至无结晶时才可与裂解液混合3．蛋白酶抑制剂：100mmol/L PMSF ：17.4mg PMSF 粉末溶于1ml 异丙醇(AR)，分装250ul 每管后－20℃保存。

使用终浓度为1 mmol/L 。

【PMSF ：在溶液中不稳定，应在临用前从储存液中现加于裂解液中。

PMSF 剧毒，严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险一旦眼睛或皮肤接触了PMSF ，应立即用大量的水冲洗。

--Western blot 详细步骤(中文版)

Western blot 步骤一、蛋白样品制备1.细胞样品：弃去培养基→预冷PBS洗涤3次→弃去PBS，加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，冰上轻摇裂解30min→将裂解液及细胞碎片移至离心管→4℃下12000rpm离心5min→取少量上清，BCA法测定蛋白浓度→其余上清加入蛋白上样缓冲液，煮沸变性，-80℃保存。

2.组织样品：直径5mm组织放入1.5ml EP管→加入RIPA和蛋白酶抑制剂→冰上剪碎→电动匀浆器间歇匀浆1min→间断超声破碎2min→4℃下12000rpm离心5min→取少量上清，BCA法测定蛋白浓度→其余上清加入蛋白上样缓冲液，煮沸变性，-80℃保存二、电泳、转膜1.组装制胶版，按目的蛋白分子量配制7ml对应浓度的分离胶液，摇匀后迅速灌胶至胶板2/3高度。

2.以ddH2O封闭胶液，室温下静置30分钟。

倾去覆盖水层，以滤纸小心吸去剩余的水。

3.配制5％积层胶3ml，迅速混匀，加到分离胶上至胶版上缘，小心插入梳子，室温下聚合时间1h。

4.将聚合好的两块胶安装至电泳槽中，倒入1×电泳缓冲液5.将取等质量蛋白样品及蛋白Ladder，每孔上样10-20μL。

6.接通电源，积层胶电压为60V。

7.待溴酚兰电泳至积层胶与分离胶分界处，将电压调为100V继续电泳，待溴酚兰电泳至底部时终止电泳，小心取胶，放置于转膜缓冲液中。

8.剪下同样大小的PVDF膜，甲醇浸泡30秒后转膜缓冲液轻漂洗。

9.组装“三明治”，以恒定电流350mA转膜2小时10.转膜完毕后，取出PDDF膜，蛋白面向上，5％脱脂奶粉室温下轻摇封闭2小时。

11.取出PVDF膜，吸去表面奶液后放入杂交袋，蛋白面向上，一抗TBS稀释后加入杂交袋，4℃孵育过夜。

12.取出PVDF膜，1×TBS摇床漂洗10分钟，漂洗3次后放入杂交袋。

13.二抗TBST稀释后加入杂交袋，室温孵育2小时。

14.以1×TBST洗膜三次，每次10分钟。

最详细的WesternBlot过程步骤详解

最详细的WesternBlot过程步骤详解最详细的W e s t e r n B l o t 过程步骤详解最详细的W e s t e r n B l o t过程步骤详解Pleasure Group Office【T985AB-B866SYT-B182C-BS682T-STT18】Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答)Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。

对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术:一、原理二、分类i.放射自显影ii.底物化学发光ECLECFiv.底物DAB呈色三、主要试剂四、主要步骤五、实验常见的问题指南1.参考书推荐2.针对样品的常见问题3.抗体4.滤纸、胶和膜的问题的相关疑问6.染色的选择7.参照的疑问8.缓冲液配方的常见问题9.条件的摸索10.方法的介绍11.结果分析一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

二、分类现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。

只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP 标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

western blot实验步骤

一、提取组织蛋白新鲜肺组织取20-30mg，减去气管，组织匀浆机研磨，100W超声3S，12000r/min离心37℃孵育30min，测OD562。

按所得结果定量到50微升计算上样量，将20微升上清分装到一个1.5ml的EP管，加5微升上样缓冲液，-20℃冻存。

二、煮样95℃，煮10min,待温度降到室温关闭机器，煮后的组织离心7500r/min，1min备用三、安装玻璃板，倒入电泳缓冲液，拔梳子，用进样针吸取计算的上样量上样，装好正负极，倒满电泳液，设置80V，30min跑条带，结束后100V，60min，没跑到底酌情延长时间(30min)，准备转膜所需工具：1.剪好6片滤纸，转膜液湿润海绵及滤纸，赶气泡。

2.PVDF膜，准备甲醇激活膜2min，蒸馏水5min电泳时间到关闭电源，取出玻璃板，准备切胶，切好后，按形状切稍大一圈的PVDF膜，覆盖到切好的胶上，标记好上下。

安好夹子，放入电泳槽准备转膜，转膜需冰浴。

四、转膜结束后，将膜取下，TBST清洗3遍，每遍5min。

五、7%牛奶（1.75g，加TBST 25毫升）,封闭2小时，慢摇。

六、封一抗内参：β-actinα-SMA:1：10000配制波形蛋白：1：5000制备杂交袋，放入膜，滴入抗体，封口，4℃过夜七、将过夜的膜放入37℃恒温箱中孵育30min，结束后回收一抗，标记好第几次用，TBST清洗膜3遍，每遍10min。

八、封二抗：羊抗兔HRP(1：5000)稀释，配制10ml，慢摇1小时后回收二抗，标记好第几次。

TBST清洗膜3遍，每遍15min。

九、1：1配制发光液（避光保存），准备眼科镊、滤纸、托盘、曝光，先曝背景再报条带，先自动后手动。

Westernblot基本操作步骤

W e s t e r n b l o t基本操作步骤一、细胞蛋白的提取弃去培养基，加入预冷的PBS洗一遍，加入的RIPA裂解液（含1mM PMSF(100×)，每10ml加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂各一片，六孔板每孔150-250μl，60mm×15mm培养皿300-400μl，），于冰上裂解约5分钟，裂解总液12000rpm离心10 min。

取上清，用BCA法测定蛋白浓度。

用于western blot的蛋白样品取一定量加4×loading buffer，10×reducing，再用裂解液补齐到所需上样体积。

离心，使蛋白沉底。

将EP管于沸水中煮5min，变性，之后再离心后准备上样。

二、BCA法测蛋白浓度操作步骤将蛋白标准配制溶液溶解蛋白标准（BSA），配制成5mg/ml的蛋白标准溶液，10μl 分l。

；水②将预制胶固定到电泳装置中，并在装置中加满Runnig Buffer(1×)，内槽加入0.5mL抗氧化剂，小心拔下梳子；③向上样孔中加入一定体积的蛋白样品（总蛋白量20μg以上）。

向marker孔中加入2.5μl marker（按照实验要求设定marker量），向空白孔中加入一定体积的加样缓冲液(loading buffer)。

注意采用相同（或相近）的上样体积，以保证蛋白的各带宽度相同。

防止体积较大的上样孔中的蛋白质将向相邻的泳道扩散。

3、电泳将电泳装置与电源连接。

调节电压为100-200V，电泳50min，直至溴酚兰接近分离胶的底部，然后关闭电源并撤去连接的导线。

拆除电泳装置：先倒掉电泳缓冲液，连同槽一起将凝胶夹层取出，小心的撬起凝胶外层塑料板，使凝胶暴露出来，切去浓缩胶以及无蛋白样品的凝胶部分（将胶留在短的一面塑料板上）。

4、转膜（湿转）①将转膜液（1× Transfer Buffer）放于大饭盒内，泡4片海绵，剪4片滤纸、1片PVDF膜，PVDF膜于甲醇中活化30s，取出置于转膜液中；②按照2层海绵+2层滤纸+胶+膜+2层滤纸+5层海绵（填满）的顺序组装转膜装置，注意组装此装置时一定要保证滤纸、膜、凝胶精确对齐并不留气泡；③将组装好的装置放入电转槽，合上盖子，电转槽置于冰浴，接通电源，调节电压为15V，时间为16~18h（或恒流300mA, 3h）。

western-blot步骤

western-blot实验流程：一、裂解细胞：1、收集细胞。

1000rpm,5min.弃上清，加1ml PBS,混匀，移至EP管。

2、4℃，1000rpm,5min。

弃上清，加1ml PBS，4℃，1000rpm,5min再洗一次。

3、配制裂解液（见附录一）：WB buffer 500μlNa3VO4 5μl配方一：Na4P2O7 5μlPMSF 5μlCocktail 5μl1×107/ml裂解液，冰上孵育15min（每隔3~5分钟混匀一次），13000rpm(或16000rpm)，4℃，离心10min.分装上清液（裂解蛋白），－20℃保存。

（一般另取5μl，作蛋白定量用）配方二：RIPA配方三：Nuc Buster TM protein extraction Kit二、蛋白定量（BCA法，Bio-Rad）：1、工作液的准备每ml A试剂中加入20ul的S试剂（此工作液在1周之内稳定，但在配制1天后会形成沉淀。

若有沉淀形成，加热并旋涡混匀使沉淀溶解，勿用Tip吸取沉淀）若样品中不含去垢剂，此步骤可省略，直接使用试剂A。

2、将蛋白标准液稀释，浓度从0.2mg/ml至1.5mg/ml。

稀释液与样品的溶解液相同。

3、待测蛋白做相应的稀释。

（一般稀释2.5或5倍）4、每孔加入5ul标准蛋白溶液和待测蛋白溶液。

5、每孔加入25ul的试剂A或试剂A’6、每孔200ul试剂B，轻轻混匀，室温放置15分钟，650-750NM检测吸光度。

三、配胶：10% (10ml，1小板) 8% (50ml，1大板) 分离胶：40% Acr-Bis 2.5ml 10. ml1.5M Tris-HCl PH8.82.5ml 12.5 mlH2O 4.8ml 26.5 ml10%SDS 100ul 500ul10% AP（H2O现配）100ul 500ulTEMED 4ul 30ul 注：大板——> 0.3cm梳子（大齿）50ml;0.5cm梳子（小孔）65ml.浓缩胶：(5ml, 1小板)40% Acr-Bis 625ul1.0M Tris-HCl PH6.8 625ulH2O 3.7ml10%SDS 50ul10%AP 50ulTEMED 5ul四、样品处理：配方一：sample buffer：0.5M Tris-HCl, PH6.8 1.0ml5×Glyceral 0.8ml（8ml）10%SDS 1.6ml二巯基乙醇0.4ml0.05%溴酚兰（用水配）0.4mlH2O 3.8ml配方二（常用）：电泳样品：25μg/孔。

Western blot(蛋白印迹法)详细步骤

Western blot（蛋白印迹法）详细步骤一、组织的研磨准备：研钵、研磨棒、EP管、药匙、液氮、液氮匙、自封袋、一次性手套、棉手套步骤：①用研磨棒将装有冻存组织的EP管敲碎，取出组织，在研钵中盛满液氮，用力敲碎组织，研磨。

②研磨过程中一旦液氮干了，立即加入液氮，保持研磨在液氮中进行，直至组织呈干粉状。

③用在液氮中浸泡过的药匙将研磨好的粉末盛入新的EP管中。

④装有组织粉末的EP管现在液氮中保存，待所有组织都研磨结束后装入自封袋，于-80℃保存。

注意：1.研钵使用前要用锡纸包口、研磨棒用锡纸包头，在烘箱中烘烤180℃至少3h 以上。

2.组织研磨成粉末后待液氮全部挥发后再将组织粉末装管。

3.每种样品都最好留有副管，备用。

二、裂解提蛋白准备：裂解液配制比例RIPA:PMSF=1000：10=100：1若需要加入蛋白酶抑制剂，则比例一般为1:1000（即1ml裂解液加1μl蛋白酶抑制剂）步骤：①将RIPA和PMSF按比例混匀，加入到装有组织粉末的EP管中，一般加入300~500μl左右（浓度尽量高点）。

②盖好盖子，在冰上裂解30~40min.③到时间后于4℃，12000rpm离心10min，取上清液转移到新的离心管中，于-20℃保存。

注意：1.裂解液加入后用手指弹一下混匀，当加入量很少时，成粘稠状，有必要时应用枪头混匀。

三、BCA法测定蛋白浓度（BCA试剂盒）准备：BCA试剂盒（BCA试剂A、BCA试剂B、蛋白标准液）、酶标板、酶标仪、摇床步骤：①按1:15或1:30稀释待测样品，即取1μl样品+14μl水。

③按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）根据样品数量配制BCA工作液。

④每个标准品孔加入200μl BCA工作液，样品孔加入待测样品10μl和200μlBCA工作液，充分混匀，在摇床上震荡30s，37℃放置30min，于492nm下测定OD值。

⑤标准曲线以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，根据样品的吸光度可以在标准曲线上查得相应的蛋白含量。

Western Blotting操作步骤及说明

Western Blot操作方法及步骤1).蛋白质提取Extraction buffer组成:蔗糖0.7 MTris/HCl0.5 MEDTA 50 mMKCl0.1 M配制成母液pH 9.4巯基乙醇2%蛋白酶抑制剂25×取100-200 mg植物叶片，用液氮速冻后用研磨仪打碎（若量比较大可用液氮研磨，分装到多管中），加入500 µl 提取缓冲液，涡旋；完全混匀后加入500 µl 苯酚（分层，取下层酚层）, 涡旋；在3000 g 的转速下离心10 min, 4 °C拿两只新的EP管，各取200 µl 离心后的上清液；向两只EP管中各加入1 ml 0.1M NH4Ac（用甲醇溶解配制）；在-20°C下沉淀放置至少2 h过夜放置；在13000 rpm转速下离心5 min，4 °C；用0.1 M NH4Ac（用甲醇溶解配制）洗涤，用枪头将蛋白吹散，洗净杂质；在13000 rpm转速下离心5 min，4 °C；取上清后空甩EP管，去除多余的溶液；室温干燥蛋白, 用1% SDS（100ul左右）溶解蛋白。

2). 测定总蛋白浓度。

用BCA蛋白检测试剂盒测定提取物中的蛋白质含量(1)蛋白浓度测定1、考马斯亮蓝G250通过与蛋白质内的氨基和羧基基团间的静电结合作用以及范德华力，考马斯亮蓝与蛋白质形成强但非共价键连接的复合物。

蛋白-染料复合物的形成稳定染料携带的负电荷阴离子，从而产生在膜上或者胶上肉眼可见的蓝色①测定总蛋白浓度步骤：按照BCA试剂盒说明书进行操作1.配制标准曲线的标准样品--胎牛血清蛋白（BSA）浓度BSA原液浓度：5mg/ml②待测样品稀释用Nanophotometer（纳米光度计）初步测一下待测样品的浓度，计算好稀释的体积，使得终浓度在标准曲线区间内。

③加样准备测定标准样品和待测样品各准确吸取20μl溶液于酶标孔中，加入BCA工作液200μl。

westernblotting实验操作步骤讲解

westernblotting实验操作步骤讲解蛋⽩免疫印迹杂交（Western Blot, WB）WB是将蛋⽩样本通过聚丙烯酰胺电泳按分⼦量⼤⼩分离，再转移到杂交膜上，然后通过⼀抗/⼆抗复合物对靶蛋⽩进⾏特异性检测的⽅法。

WB 是进⾏微量蛋⽩质分析⽐较成熟的技术之⼀。

以下是总结Western Blot 操作⽅法及常见问题分析，有助于成功完成WB。

A第⼀部分：蛋⽩样本提取制备蛋⽩样品制备是Western Blotting的第⼀步，更是决定WB成败的关键步骤，总体原则和注意事项：1.尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取⽬的蛋⽩（通过采⽤不同提取⽅法或选择不同的试剂盒产品）；2.保持蛋⽩处于溶解状态（通过裂解液的pH 、盐浓度、表⾯活性剂、还原剂等的选择）；3.提取过程防⽌蛋⽩降解、聚集、沉淀、修饰等，（低温操作，加⼊合适的蛋⽩酶和磷酸酶抑制剂）；4.尽量去除核酸，多糖，脂类等⼲扰分⼦（通过加⼊核酸酶或采取不同提取策略）；5.样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。

⽅法的选择◆⾃⾏配制抽提试剂，根据⽂献⽅法或经验提取；◆购买商品化试剂盒，按其说明书的⽅法提取。

Example 1：实验中提取肾脏总蛋⽩，具体实验过程如下：1.提前⼀天4℃解冻RIPA，⼀定要完全融化；配PBS（⽤于细胞试验则需⾼压）；2.配制裂解液：PMSF:RIPA=1:99,PMSF终浓度为100mM（根据样本数配制所需的量，临⽤临配）；3.裂解组织：每个样品称取100mg，加1ml裂解液，匀浆后4℃静置2h使其充分裂解，14000g，4℃离⼼10min，取上清。

4.蛋⽩定量：取少量上清稀释30倍蛋⽩定量，然后计算出各样本原液蛋⽩浓度。

注意由于裂解液⾥含有较⾼浓度的洗涤剂，蛋⽩定量不能选⽤Bradford法，可以选⽤改良的Lowry’s法或者BCA法。

5.样品蛋⽩浓度均⼀化：根据蛋⽩定量计算的结果将各样品蛋⽩浓度调整⼀致。

western blot 全过程详细步骤

一：提蛋白：1.PBS洗2遍，加RIPA 80-100ul（含10xcooktail）。

2.在冰上刮到离心管中，在冰上裂解20-30min。

3.4度离心，13000rpm、10-15min（准备新的离心管、配BCA 200ul/每孔(A:B=50：1)、96孔板加PBS(2个对照组20ul，实验组18ul)）。

4.取上清转移到新离心管中，记住转移的体积。

5.96孔板中每孔加2ul蛋白液。

6.每孔加200ulA/B混合液。

7.37度半小时。

8.测浓度以及标化用一起在libo文件夹找模板，最后得到每组需要加的RIPA以及loding buffer，还有标化后的浓度。

562波长0.046斜率（实验组值-对照组值）/斜率=浓度浓度最好在4-8ug/ul最好，跑胶时就可以只加10ul蛋白液（蛋白含量40-80ug）9.加好对应的RIPA以及loding buffer后，煮蛋白5-15min，-20度保存。

二：跑胶1. 1.0玻板，洗干净2.配制10%或者12%分离胶一块胶需要5ml3.灌分离胶，在分离胶上层灌无水乙醇4.配制5%浓缩胶2块胶需要4ml5.待分离胶干后，灌浓缩胶，插梳子6.待胶干后，将胶及玻板一起放入电泳槽，拔梳子，倒入1*running buffer（上腔灌满，下腔过电线丝）7.预电泳，100v，10-15min8.加样（蛋白样品及marker）10ul，marker 5ul9.60v 10-20min，之后100-110v三：转膜1.配transfer buffer ，用10*transfer buffer 稀释10倍，并加20%甲醇2.transfer buffer浸泡海绵、滤纸3.pvdf膜，甲醇泡1分钟，清水洗2次，泡在transfer buffer里20min4.胶取出，在transfer buffer里泡10min5.黑胶白膜（一层海绵，2层滤纸）6.转膜100v，1—1.5h（黑对黑，冰板，在冰里跑）四：封闭、一抗、二抗1．5%脱脂奶粉（pbst溶）1h 37度2.一抗4度12h3.pbst洗膜，3次，每次10min4.二抗（1:5000）1h 37度5. pbst洗膜，3次，每次10min6.显影剂A和B各300ulPBST：1000ml’PBS+1mltween5%脱脂奶粉：100mlPBST+5g脱脂奶粉10*running buffer：tris 30.3g 甘氨酸144.1g sds 10g 加水至1000ml10*transfer buffer：tris 30.3g 甘氨酸144.1g 加水至1000ml1* transfer buffer：100ml10*transfer buffer 200ml甲醇加水至1000ml。

Westernblot操作步骤[完整版]

Westernblot操作步骤[完整版]Western blot 操作流程作者：孙雪纯审核人：关宝生发布者：王建宇实验原理：Western,也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。

Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

内参:WB过程监测以及目的蛋白定量的标准;最重要和最不可或缺的对照就是内参照。

1.内参可检测整个WB实验过程及体系是否正常工作,如果一个实验连内参照都出不了阳性结果的话（在内参抗体有效的情况下）,那么这个体系就是存在问题的；2、起半定量的标准的作用,内参一般选择管家基因编码表达的蛋白,在很多组织和细胞中都是稳定表达的,因此可以作为检测靶蛋白表达量的标准；内参名称分子量大小适用范围beta-actin 43kDa 胞浆和全细胞GAPDH 30-40kDa 胞浆和全细胞Tubulin 55kDa 胞浆和全细胞VCDA1/Porin 31kDa 线粒体COXIV 16kDa 线粒体TBP 38kDa 细胞核实验步骤一、蛋白样品制备（组织中总蛋白的提取）第一步：法（1）敲取0.07-0.1g组织+400-500ul裂解液，放入打样管，放入打样机打样。

法（2）实验室研钵研磨：取稍大于0.1g的样品放入研钵中，来回磨，至粉末状，用枪头刮取收集入离心管。

注：任何操作都要在液氮中进行，并且要将枪头和离心管提前泡在液氮中。

Western Blot概述及步骤

W estern Blot概述及步骤Western Blot概述及步骤Western Blot（WB）是通过聚丙烯酰胺电泳根据分子量大小分离蛋白后转移到杂交膜上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。

WB进行蛋白质分析最流行和作成熟的技术之一，超过60% 的生命科学工作者使用该方法。

根据凝胶电泳的类型，WB可分为：*还原（变性）WB：最常用的一类，使用SDS-PAGE电泳。

主要是来检测蛋白质的特性、存在与否、蛋白质的同源性以及估计蛋白质的分子量等*非还原（非变性）WB：主要用来分析蛋白质的结构、保持蛋白的活性的。

一般不使用SDS、DTT等变性剂。

成功完成Western Blot检测，必须满足4个条件：*凝胶洗脱：转移期间蛋白质必须从凝胶中洗脱出来，如果蛋白质还截留在凝胶中，将无法在膜上进行分析* 吸附到膜上：在转移过程中蛋白质必须吸附到膜上，如果蛋白不吸附，将无法在膜上进行分析*处理期间仍截留在膜上：在转移后的处理过程中蛋白质必须保持吸附在印迹膜上*处理过程中可接近：被吸附的蛋白质必须能够与检测试剂接触，如果蛋白质被掩盖则无法检测成功进行WB检测，则设置合适正确的对照是必不可少的，只要正确设置了这些对照，即可快速和准确的找到WB的问题所在，并保证实验结果的准确性和特异性！一般需要设置的对照如下：*阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率*阴性对照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性*二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性*内参对照：检测标本的质量和二抗系统*空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果Western Blot概述及步骤Western Blot（WB）是通过聚丙烯酰胺电泳根据分子量大小分离蛋白后转移到杂交膜上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。

WB进行蛋白质分析最流行和作成熟的技术之一，超过60% 的生命科学工作者使用该方法。

WesternBlot操作流程

Western Blot操作流程本人将自己做 WB实验时的具体操作流程，做了详细的记录并整理。

因为每个实验室的条件不一样，所以本流程仅供参考，具体适合自己的实验操作需要大家摸索。

由于知识量有限，有些描述用词并不专业，请大家谅解。

一、流程图制胶→→电泳跑胶 (1.5-2.5h)→→转膜（3h）→→（可使用立春红检测是否蛋白是否成功转移）TBST 清洗（ 10min）→→封闭（ 2h）→→ TBST 清洗（ 10min）→→附Ⅰ抗（内参：小鼠抗β-Actin，先摇床轻摇30min，再放冰箱 4 度过夜）→→ TBST 清洗三次（ 10min/ 次）→→附Ⅱ抗（内参：山羊抗小鼠，轻摇1.5h）→→ TBST清洗三次（ 10min/ 次）→→显影二、物料及配制1、电泳液：一包电泳粉+1000ml双蒸水（可回收使用）2、10%过硫酸铵： 1g 过硫酸铵 +10ml 双蒸水3、转膜液：一包转膜粉+800ml双蒸水+200ml甲醇（可回收使用）4、TBST溶液：50ml 20*TBS+950ml双蒸水 +1ml 吐温 20。

（无需回收）5、封闭液：购买6、Ⅰ抗（内参）：将小鼠抗β-Actin：Ⅰ稀释液按1:500稀释待用， 4 度保存。

Ⅰ抗（目的蛋白 58kDa）：将 smad2：Ⅰ稀释液按1:1000稀释待用， 4 度保存。

7、Ⅱ抗（内参）：将山羊抗小鼠：Ⅱ抗稀释液按1:5000稀释代用， 4 度保存。

Ⅱ抗（目的蛋白58kDa）：将山羊抗兔：Ⅱ抗稀释液按1:5000 稀释待用， 4 度保存。

7、显影液：按说明书配制，避光可长期回收使用8、定影液：按说明书配制，可长期回收使用9、发光液：超敏发光液 A 液： B 液=1:1三、步骤（一）制胶1、Tris-甘氨酸 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液的配制溶液成分成分体积（共约10ml ）双蒸水4ml30%丙烯酰胺溶液 3.3ml1.5mol/L Tris （ pH8.8）2.5ml10%SDS0.1ml10%过硫酸氨0.1mlTEMED0.004ml2、Tris-甘氨酸 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳 5%积层胶所用溶液溶液成分成分体积（共约5ml）双蒸水 3.4ml30%丙烯酰胺溶液0.83ml1.5mol/L Tris （ pH6.8）0.63ml10%SDS0.05ml10%过硫酸氨0.05mlTEMED0.005ml3、1）将规格 1.0mm 或其它规格的玻璃板固定好。