质粒提取总结(原理、小提、中提、浓度测定)
质粒提取总结原理小提中提浓度测定
碱裂解法抽提质粒原理溶液I，５0mM葡萄糖/25 ｍM Trｉs—Cl / 10ｍM EDTA,pH８。
０;（溶菌酶：使细胞壁裂解;RNase:将裂解完的ＲNA去除，防止RNA污染)溶液II,０。
２N NaOH/ 1％SＤS;溶液IＩI，3M醋酸钾/ 2 M醋酸。
溶液I的作用:①任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当ｐＨ值的Tris —Ｃｌ溶液。
②５0ｍＭ葡萄糖：加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部.因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言,几乎没有任何影响.所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。
③EＤTA:ＥDTA是Ca2＋和Mｇ2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性和抑制微生物生长.在溶液I中加入高达10 mM的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。
如果不加EDTＡ,其实也没什么大不了的，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DＮA会迅速被降解,因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。
如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢?只要用等体积的水,或LB培养基来悬浮菌体就可以了.有一点不能忘的是,菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。
溶液II:这是用新鲜的0.4 N的NaＯH和2％的SDS等体积混合后使用的。
要新从浓ＮaOH稀释制备０.4N的NaOＨ，是为了保证ＮaOH没有吸收空气中的CＯ2而减弱了碱性.其实破细胞的主要是碱，而不是SＤS,所以才叫碱法抽提。
事实上NａOH是最佳的溶解细胞的试剂,不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞,碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer(双层膜）结构向micelle（微囊)结构的相变化所导致。
用了不新鲜的0.4 N NａOH,即便是有ＳＤＳ也无法有效溶解大肠杆菌,自然就难高效率抽提得到质粒.如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SＤS也是碱性的,只是弱了点而已。
质粒的提取及浓度的测定
细菌裂解的方法： • 碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS • 煮沸裂解法:沸水煮沸40秒 • SDS裂解法：10%SDS,一般用于 质粒大量提取。
DNA浓度的测定：
测定DNA浓度的方法有两种，即利用分光光 度计法测定DNA的紫外光吸收值；另一种方 法是测定样品中溴化乙锭发射的荧光的强度 来计算核酸的含量。
原理：
DNA 是具有一定结构的物质，一些特殊 的环境会导致DNA的变性，如加热、极端 pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等， 而适宜的环境又可以使DNA复性。
SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细 菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以 SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的 破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞 中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱 性（NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性 乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒 DNA将迅速复性，而染色体DNA，由于分子巨 大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清 中，而染色体DNA则与细胞碎片一起沉淀到 离心管的底部。通过这种方法即可将质粒 DNA从细菌中提取出来。
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4. 步骤
A.质粒DNA的提取
碱裂解法
溶液1－GET缓冲液： 50mmol/L葡萄糖， 10mmol/L EDTA，20mmol/L 20mMTris-HCl pH8.0， 100mg/ml RNas A 4oC 保存。 溶液2－0.2mol/L NaOH, 1%SDS 溶液3－乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)： 60mL的5mol/L KAc, 11.5ml冰醋酸， 28.5mL H2O TE缓冲液: 10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA ， pH8.0, 100%乙醇，70％乙醇
质粒提取总结
碱裂解法抽提质粒原理溶液I，50 mM葡萄糖 /25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH ；（溶菌酶：使细胞壁裂解；RNase：将裂解完的RNA去除，防止RNA污染）溶液II， N NaOH / 1% SDS；溶液III，3M醋酸钾 / 2 M醋酸。
溶液I的作用：①任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液。
②50mM葡萄糖：加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。
所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。
③EDTA：EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性和抑制微生物生长。
在溶液I中加入高达10 mM的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。
如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。
如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。
有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。
溶液II：这是用新鲜的 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。
要新从浓NaOH稀释制备的NaOH，是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。
其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。
事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。
用了不新鲜的 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌，自然就难高效率抽提得到质粒。
如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。
质粒抽提原理与详细操作步骤
质粒抽提,实验室必备技能之一质粒质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。
质粒抽提从细菌中分离质粒DNA的方法包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。
采用强碱液、加热或溶菌酶（主要针对革兰氏阳性细菌）可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS）和TritonX-100（一般很少使用）可使细胞膜裂解。
经溶菌酶和SDS或Triton X-100处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。
当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA，简称cccDNA）的两条链不会相互分开。
当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。
质粒抽提最常用的方法是碱裂解法，它具有得率高、适用面广、快速和纯度高等特点。
当然，碱裂解法也有缺陷：容易导致不可逆的变性。
要降低不可逆的变性，就要控制好碱裂解的时间。
碱裂解法抽提质粒需要用到以下三种溶液溶液Ⅰ50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0），10 mmol/L EDTA（pH 8.0），在15 psi 压力下蒸汽灭菌15 min，4℃保存。
溶液Ⅱ0.2 mmol/L NaOH（从10 mmol/L 贮存液中现用现稀释），10 g/L SDS（室温保存）。
溶液Ⅲ5 mol/L乙酸钾60.0 mL，冰乙酸11.5 mL，无菌水28.5 mL， 4℃保存，使用时置于冰浴中。
下面介绍一下碱裂解法小提质粒的具体操作：01柱平衡：向吸附柱中加入500 μl平衡Buffer，12000 rpm离心30-60 s，倒掉收集管中的废液；注意：吸附柱平衡后可最大限度激活硅基质膜，提高质粒的得率；吸附柱平衡后应立即使用，长时间放置会影响其吸附效果。
提取质粒的原理
提取质粒的原理质粒是一种环状的DNA分子，存在于细菌、酵母等微生物细胞中，具有自主复制和传递的能力。
质粒在基因工程中扮演着重要的角色，可以被用来携带外源基因并在宿主细胞中表达。
因此，提取质粒是基因工程实验中必不可少的步骤之一。
本文将介绍提取质粒的原理及其相关技术。
提取质粒的原理提取质粒的原理基于细胞裂解和质粒分离的过程。
一般来说，提取质粒的步骤包括以下几个方面：1. 细胞裂解首先需要将含有质粒的细胞进行裂解，使质粒从细胞内部释放出来。
细胞裂解的方法有多种，包括机械破碎、超声波破碎、化学裂解等。
其中，化学裂解是最常用的方法之一，其原理是利用化学试剂破坏细胞壁和细胞膜，使细胞内部的物质释放出来。
常用的化学试剂包括SDS、EDTA、蛋白酶K等。
2. 分离质粒细胞裂解后，需要将质粒从其他细胞组分中分离出来。
质粒的分离方法有多种，包括离心、柱层析、电泳等。
其中，离心是最常用的方法之一，其原理是利用离心力将不同密度的物质分离开来。
在离心过程中，质粒会沉积到离心管底部形成沉淀，其他细胞组分则会在上层形成上清液。
此时，可以将上清液倒掉，留下质粒沉淀。
3. 纯化质粒分离出的质粒可能会受到其他杂质的污染，因此需要进行纯化。
质粒的纯化方法有多种，包括酚-氯仿法、硅胶柱层析法、离子交换柱层析法等。
其中，酚-氯仿法是最常用的方法之一，其原理是利用酚和氯仿的不同溶解度将DNA、RNA和蛋白质分离开来。
在酚-氯仿法中，质粒会在上层形成一个白色的粘稠物质，其他杂质则会在下层形成。
提取质粒的技术提取质粒的技术有多种，包括常规提取法、快速提取法、自动提取法等。
其中，常规提取法是最常用的方法之一，其步骤如下：1. 细胞裂解将含有质粒的细胞进行裂解，使质粒从细胞内部释放出来。
常用的化学试剂包括SDS、EDTA、蛋白酶K等。
2. 分离质粒将裂解后的细胞进行离心，分离出质粒沉淀。
3. 纯化质粒将分离出的质粒进行酚-氯仿法纯化。
4. 洗涤质粒将纯化后的质粒进行洗涤，去除残留的酚和氯仿。
质粒小提的原理和提取过程中的注意事项
质粒小提的原理和提取过程中的注意事项质粒小提是一种常用的实验方法，用于从细菌中提取质粒DNA。
其原理和提取过程中有一些注意事项，下面是详细介绍。
质粒小提的原理：质粒小提的原理是利用离心法将大量细菌聚集在一起，然后使用碱解液溶解细菌细胞壁和膜，将质粒DNA释放到溶液中。
接下来，通过加入特定的盐和有机溶剂，将质粒DNA与其他细胞成分分离开来。
最后，通过离心将质粒DNA沉淀下来，即完成了质粒小提。
质粒小提的提取过程中的注意事项：1.使用无菌操作：在整个提取过程中，确保使用无菌操作，以防止外源性DNA的污染。
使用无菌平台和器具，并且在实验室操作台上清洁表面。
2.选择适当的细菌培养基：选择适当的培养基和条件来培养细菌，以获得最佳的质粒DNA产量。
选择含有适当选择抗生素的培养基，以确保只有含有目标质粒的细菌生长。
3.对细菌进行预处理：在提取过程之前，对细菌进行适当的预处理是很重要的。
通常，细菌应该处于对质粒DNA产生最佳条件的生长阶段。
此外，使用良好的细菌培养方法，以确保质粒DNA在细菌中的稳定和延长拷贝数。
4.合理选择裂解液：选择适当的裂解液可以有效地裂解细菌细胞壁和膜，释放质粒DNA。
常用的裂解液包括碱、酶和界面活性剂。
根据不同的细菌类型和质粒特性，选择合适的裂解液方法。
5.应用适当的离心条件：离心是质粒小提过程中一个非常重要的步骤，可以将质粒DNA与其他组分分离开来。
确定适当的离心速度和离心时间，以确保质粒DNA能够沉淀下来，并且去除其他细胞残留物。
6.保存提取的质粒DNA：提取到的质粒DNA需要正确保存，以避免降解和污染。
使用无菌的保存管和适当的缓冲液，如TE缓冲液，在低温（通常-20°C）下保存质粒DNA。
以上是质粒小提的原理和提取过程中的注意事项的详细介绍。
在操作过程中要严格控制操作条件，以获得高质量的质粒DNA。
质粒提取的原理操作步骤各溶液的作用
质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。
各类质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情形下可持续稳固地处于染色体外的游离状态，但在必然条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞割裂传递到后代。
质粒已成为目前最经常使用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可取得大量纯化的质粒DNA分子。
目前已有许多方式可用于质粒DNA的提取，本实验采纳碱裂解法提取质粒DNA。
碱裂解法是一种应用最为普遍的制备质粒DNA的方式，其大体原理为：当菌体在NaOH和 SDS 溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
纯化质粒DNA的方式一般是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平稳离心、离子互换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方式，但这些方式相对昂贵或费时。
关于小量制备的质粒DNA，通过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可知足细菌转化、DNA 片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中经常使用。
一、试剂预备1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH ，10mM EDTA(pH ）。
1M Tris-HCl<!--[if !supportAnnotations]--><!--[endif]--> (pH ）， EDTA（pH ）10ml，葡萄糖，加ddH2O至500ml。
在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。
任何生物化学反映，第一要操纵好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液。
质粒提取 原理及步骤
质粒提取原理及步骤质粒提取是分子生物学中的一项重要实验技术，被广泛应用于基因克隆、基因转染、基因表达等方面。
本文将重点介绍质粒提取的原理及步骤。
一、原理质粒提取的原理基于质粒和细胞的生化学性质差异。
质粒是一种独立复制的DNA分子，可以自主复制并传递给细胞的子代。
而在真核细胞中，大多数DNA都位于细胞核中，很难获得足够的DNA量进行实验。
质粒提取利用了这一差异，将大量的质粒从细胞中提取出来。
质粒提取的主要步骤如下：二、步骤1. 细胞培养首先需要选择适当的细胞类型并在培养基中培养，使细胞处于最佳生长状态。
对于大多数细胞类型，建议在对数生长期时采集，因为此时细胞数量最多且代谢活跃，可以有效提高质粒提取的DNA量和质量。
同时，还需注意避免细胞因为过于密集而形成聚集体或凝胶。
2. 细胞收获收获细胞的方法取决于细胞类型和实验的目的。
常见的方法包括用PBS或细胞培养液将细胞冲洗下来，或者用胶体离心等方法进行细胞收获。
收获的细胞量需要根据实验需求进行调整，一般建议在0.1-1g的范围内收获细胞。
3. 细胞裂解细胞裂解是质粒提取过程中最关键的步骤之一，它能有效破坏细胞膜和核膜，释放细胞内的DNA。
常用的细胞裂解剂包括SDS、Triton X-100和Tween-20等，同时还需要将细胞裂解液加入蛋白酶抑制剂和DNA酶切酶，以避免核酸降解和一些酶促反应的发生。
细胞裂解后，将细胞裂解液转移到离心管中，并进行离心分离，将细胞碎片等大分子杂质通过离心将其剔除。
4. DNA纯化DNA纯化是质粒提取的最后一步，目的是将提取得到的DNA从其他杂质中纯化出来。
不同的实验需求需要不同级别的DNA纯化，从而需要使用不同种类的DNA纯化试剂盒。
目前常用的DNA纯化试剂盒包括酚/氯仿提取法、离子交换柱纯化法、硅胶膜纯化法等。
在DNA纯化后，通过分析电泳和UV测定等方法进行检测，以确保提取的DNA质量和浓度满足实验需求。
总结质粒提取是分子生物学中非常基础和常用的实验技术，其所涉及的步骤包括细胞培养、细胞收获、细胞裂解和DNA纯化等步骤。
质粒提取总结(原理、小提、中提、浓度测定)
如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的纳离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。
质粒小提
质粒小提（这里试剂盒没有柱平衡步骤）：
1、大离心管4000rpm离心5min，吸除上清；
2、每5ml菌液、加入250μlP2，上下颠倒6-8次，温和，＜5min；
4、加入350μlP3，上下颠倒6-8次，温和；12000rpm离心10min；
5、取上清，加到柱子里，12000rpm离心2min，弃废液；
6、加入去蛋白液HB 500μl，12000rpm离心1min，弃废液；
7、加入75%乙醇700μl，12000rpm离心1min，弃废液；
8、重复上一步；
9、空离一次，12000rpm离心2min，弃收集管；
10、晾干；
11、加ddH2O溶解，放2min，12000rpm离心2min。
注意：如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
3、向离心管中加入250μl溶液P1（先检查是否加入RNase A），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀；
质粒提取步骤及原理
质粒提取是分子生物学中常用的实验技术，其目的是从细菌中提取出质粒DNA，用于后续的基因操作和分析。
下面是质粒提取的主要步骤和原理的详细解释。
一、质粒提取原理
质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。
作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。
在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。
从宿主细胞中提取质粒DNA，是DNA重组技术中最基础的实验技能。
二、质粒提取步骤
培养细菌使质粒扩增：将含有目标质粒的细菌接种在适当的培养基上，提供适当的条件（如温度、湿度和营养）使细菌生长和繁殖，从而使质粒得到扩增。
收集和裂解细菌：通过离心等方法收集培养好的细菌，然后使用适当的裂解液裂解细菌，使细菌的细胞壁和细胞膜破裂，释放出内部的质粒DNA。
分离和纯化质粒DNA：通过离心、过滤或层析等方法，将裂解液中的蛋白质、细胞碎片等杂质去除，得到相对纯净的质粒DNA。
这个过程中可能需要使用一些特殊的试剂或柱子来提高分离和纯化的效率。
通过以上步骤，我们可以从细菌中提取出高质量的质粒DNA，用于后续的基因操作和分析。
质粒DNA的提取实验报告
质粒DNA的提取一、实验方法碱裂解法抽提质粒DNA二、实验原理基于质粒DNA与染色体DNA变性与复性的差异。
三、实验步骤1）质粒提取1. 10,000g,1min离心收集1.5－5ml菌液沉淀于1.5ml离心管中。
2. 加入100μl溶液1，振荡至彻底悬浮。
3. 加入200μl溶液2，立即轻柔颠倒离心管6次，使菌体充分裂解，随后将离心管冰上放置3分钟4. 加入150μl溶液3，立即温和颠倒离心管数次，冰上放置3分钟，10，000g离心10min。
5. 将步骤4的上清转移至新的离心管（尽量去除杂质），加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合均匀10，000g离心5min。
6. 将步骤5的上清转移至新的离心管，加入2倍体积的无水乙醇，室温放置5－10min，沉降DNA7. 10，000g离心10分钟,弃乙醇，保留沉淀，加入1ml 70％的乙醇洗涤沉淀，10，000g离心5分钟8. 倒掉乙醇溶液，用吸水纸吸净管壁上的水珠，室温蒸发痕量乙醇9. 加入适量含RNase的TE或灭菌双蒸水溶解质粒DNA2）质粒鉴定→琼脂糖凝胶电泳灌胶：胶中加入荧光染料(SYBR Green I)加样：质粒+上样缓冲液→混匀电泳结果观察：UV灯下四、实验结果五、实验分析裂解细胞中除含有质粒DNA外，还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂类等物质，因此用碱裂解法除去杂质1、防止DNA裂解：Solution 11）、所含糖增加溶液黏度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切作用降解2）、所含EDTA抑制酶活性2、溶解与变性：Solution21)强碱使质粒DNA和染色体DNA变性2）离子型表面活性剂SDS可溶解膜蛋白3、沉降与复性：Solution31)质粒DNA复性2）在钾盐中，染色体DNA形成缠连的不溶性网状结构，和不稳定的大分子RNA以及变性的蛋白质和细菌碎片等一起沉淀预期结果为剩余质粒DNA4、琼脂糖凝胶电泳1）荧光染色染料分子可嵌入双链DNA分子配对碱基之间2）琼脂糖可起到电泳和分子筛的作用，因所带电荷、分子量大小和构型不同，泳动速度不同六、误差分析实验失败，本组实验出现4条带，3明1暗，明亮处应为DNA分子数最多的，为质粒DNA，质粒DNA前有较暗的两条带，推测其中一条为未复性质粒DNA，可能Solution2处变性过长，不易复性，或Solution3处时间过短，复性不充分。
质粒提取原理和方法
质粒提取原理和方法质粒提取是从细菌基因组中提取出质粒DNA的一种方法。
它是分子生物学和遗传工程中常用的技术，可用于质粒的纯化和制备。
质粒提取的原理主要基于以下几个步骤：1.细菌培养：首先，我们需要将含有目标质粒的细菌培养在适当的培养基上，通过高速离心将细菌收集起来。
2.细菌溶解：将培养物进行离心，分离菌落。
然后采用一定的细胞破碎方法，如超声波震荡、冻融等，将细菌细胞壁破坏，使质粒DNA释放到溶液中。
3.质粒分离：通过离心将细菌碎片、蛋白质等杂质与质粒DNA分离。
一般是通过两次离心来完成，第一次较低速离心用于去除细菌碎片和细胞蛋白质，第二次较高速离心用于沉淀质粒DNA。
4.DNA纯化：将质粒DNA从上一步得到的沉淀物中提取出来。
可以使用酚/氯仿法、硅胶柱法、商用试剂盒等方法进行纯化。
其中酚/氯仿法是较为常用的方法，它可以将DNA溶于水相，而蛋白质和其他的污染物则溶于有机相。
5.DNA沉淀：将纯化得到的DNA溶液加入适量的酒精沉淀剂（如乙醇或异丙醇），再次进行高速离心，使DNA沉淀到离心管底部。
6.DNA洗涤：将离心管底部形成的DNA沉淀用70%乙醇洗涤，去除酒精沉淀剂和其他杂质。
然后用空气吹干，最后用一定体积的纯水或缓冲液溶解。
质粒提取的方法根据实验需求不同和实验室条件的不同可以有所差异，常用的方法有以下几种：1.酚/氯仿法：这是一种经典的DNA提取方法，它将质粒DNA溶于三氯甲烷和酚的混合物中，蛋白质和其他污染物则溶于酚相。
离心去除酚相，再用异丙醇沉淀DNA，最后用70%乙醇洗涤。
2.硅胶柱法：这是一种基于硅胶柱的离心柱技术，可用于高通量的质粒提取。
DNA样品在硅胶柱中被结合，杂质被洗掉，最后用纯水或缓冲液洗提质粒DNA。
3.磁珠法：这是一种基于磁性珠子的质粒提取方法，通过在磁性珠子表面修饰DNA结合物，使质粒DNA与磁性珠子结合。
通过外加磁场将磁性珠子与DNA一起沉淀，然后去除上清液，最后用纯水洗提DNA。
提取质粒的原理
提取质粒的原理随着基因工程技术的不断发展，提取质粒已经成为了分子生物学和生物技术领域中的一项基本操作。
质粒提取是指从细菌中提取质粒，并进行纯化和鉴定的过程。
质粒是一种很小的环状DNA分子，它存在于细菌细胞内，并承担着细菌的一些重要生命活动，如抗生素抗性等。
质粒提取的过程是分子生物学实验中的一个重要步骤，对于分子生物学实验的成功与否有着至关重要的作用。
本文将介绍质粒提取的原理和方法。
质粒提取的原理提取质粒的原理主要是利用细菌细胞壁的物理和化学特性，将细菌细胞壁破裂，并将质粒从其中分离出来。
主要的步骤包括：1. 细胞裂解将细菌细胞裂解是提取质粒的第一步。
细胞壁的物理和化学特性限制了质粒的提取，因此需要先破坏细胞壁。
通常使用碱性溶液、高渗液、超声波等方法破坏细胞壁，使得细胞内的物质可以释放出来。
2. 分离质粒破坏细胞壁后，质粒和细胞内的其他物质就一起释放出来了。
此时需要用化学方法将质粒与其他物质分离开来。
常用的方法有离心、溶液层析、凝胶过滤等。
3. 纯化质粒分离出来的物质中，除了质粒外还有其他的DNA片段、RNA、蛋白质等。
为了得到纯净的质粒，需要进行进一步的纯化。
如聚丙烯酰胺凝胶电泳、离子交换层析、亲和层析等。
4. 鉴定质粒最后一步是鉴定质粒。
鉴定质粒的方法有多种，包括酶切、PCR、测序等。
通过这些方法可以确定质粒序列、大小、拓扑结构等信息。
质粒提取的方法1. 碱裂解法碱裂解法是最常用的质粒提取方法之一。
其原理是利用NaOH和SDS对细胞壁进行破坏，使得细胞内的DNA、RNA、蛋白质等物质可以释放出来。
具体步骤如下：（1）将细菌菌落接种到含有适当抗生素的LB培养基中，进行培养。
（2）将菌落转移到含有适当抗生素的LB培养基中，进行预培养。
（3）收集细菌菌落，进行洗涤。
（4）将菌落加入含有10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0的缓冲液中，进行瞬时冻存。
（5）加入含有50mM葡萄糖、25mM Tris-HCl、10mM EDTA、0.5% SDS、pH12.0的溶液中，进行碱裂解。
(完整版)质粒DNA提取及浓度纯度测定
质粒DNA提取及浓度纯度测定[实验原理]质粒（Plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1—200Kb之间，是具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。
质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主地进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。
从细胞生存来看，没有质粒存在基本上不防碍细胞的存活，因此质粒是寄主性的自主复制因子。
根据质粒的这种特性，通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等基因工程的技术和方法，使重组到质粒的某种基因带进受体细胞表达它的遗传性质，改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物，或产生新的物质。
目前，质粒已广泛地用作基因工程中D NA分子无性繁殖的运载体，同时它也是研究DNA结构与功能的较好模型。
所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。
碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体D NA在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于12.0—12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。
当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，由于共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子R NA，蛋白质—SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
实验中，在EDTA （乙二胺四乙酸）存在下，用溶菌酶破坏细菌细胞壁，同时经过NaOH和阴离子去污剂SDS（十二烷基硫酸钠）处理使细胞膜崩解，从而达到菌体充分的裂解，同时细菌染色体DNA缠绕附着在细胞膜碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液内，其中还含有可溶性蛋白、核糖核蛋白和少量染色体DNA，实验中加入蛋白质水解酶和核酸酶可以使它们分解，通过碱性酚（pH8.0）和氯仿—异戊醇混合液的抽提可以去除蛋白质等。
质粒提取简介及问题分析
质粒提取简介及问题分析一、导论(一) 质粒提取得原理:为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液:溶液I,５0mM葡萄糖,25mＭＴris-ＨCl,10 mＭEＤTＡ,ｐＨ8、０;溶液II,0、2N NａOＨ，1%SＤＳ;溶液III，３M 醋酸钾,２M 醋酸。
让我们先来瞧瞧溶液I得作用。
任何生物化学反应,首先要控制好溶液得ｐH，因此用适当浓度得与适当pH值得Ｔris-HCl溶液,就就是再自然不过得了。
那么50 mM葡萄糖就就是干什么得呢?加了葡萄糖后最大得好处只就就是悬浮后得大肠杆菌不会快速沉积到管子得底部。
因此,如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒得抽提本身而言几乎没有任何影响,所以说溶液I中葡萄糖就就是可缺得。
EDTＡ就就是Ca2＋与Ｍg2+等二价金属离子得螯合剂,配在分子生物学试剂中得主要作用就就是:抑制DNaｓe得活性,与抑制微生物生长。
在溶液I中加入高达10mM 得ＥＤTA，就就就是要把大肠杆菌细胞中得所有二价金属离子都螯合掉。
如果不加EDTＡ,其实也没什么大不了得,只要就就是在不太长得时间里完成质粒抽提，就不用怕ＤＮA会迅速被降解,因为最终溶解质粒得TE缓冲液中有EDTA。
如果手上正好缺了溶液I，可不可以抽质粒呢？只要用等体积得水或LB培养基来悬浮菌体就可以了。
有一点不能忘得就就是,菌体一定要悬浮均匀,不能有结块。
轮到溶液II了。
这就就是用新鲜得０、4 N得ＮaOH与2％得SDS等体积混合后使用得。
要新从浓ＮaOH稀释制备０、4N得NａOH,无非就就是为了保证NaOＨ没有吸收空气中得CO２而减弱了碱性。
很多人不知道其实破细胞得主要就就是碱，而不就就是SＤＳ,所以才叫碱法抽提。
事实上ＮaOH就就是最佳得溶解细胞得试剂，不管就就是大肠杆菌还就就是哺乳动物细胞,碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解,这就就是由于细胞膜发生了从bｉlayer(双层膜）结构向ｍiceｌle（微囊)结构得相变化所导致。
质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用
细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA 分子。
目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH 和 SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。
对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。
一、试剂准备1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。
1M Tris-HCl[t1] (pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。
在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。
任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液。
50 mM葡萄糖最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。
质粒提取方法及原理
质粒提取方法及原理质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，当前通常用其来特指细菌、真菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的 DNA分子。
在基因工程领域，质粒常常被当做基因的载体使用。
在分子生物学中，质粒 DNA被当做基因运载工具具有非常广泛的应用。
在质粒DNA的应用过程中，其纯度对于酶切、PCR扩增等实验结果有着比较大的影响，因此需要保证质粒DNA提取的纯度和效率。
在细菌中提取质粒DNA通常按照以下步骤进行:第一步，培养细菌，使质粒扩增;第二步，进行细菌的收集和裂解;第三步，质粒 DNA的分离和纯化。
在质粒DNA的提取过程中，其提取效果和其大小呈现出正比例关系，越小越容易进行提取，这主要是由于，如果质粒DNA比较大的话，其特性机会和染色体DNA比较接近，这样想要将二者分离开来难度就会变大。
在进行质粒DNA的分离时，适宜的条件是非常重要的，主要包括pH值、SDS浓度、时间和溶菌温度等，在适宜的条件下质粒DNA和染色体DNA 才能够更好的分离开来。
细菌浓度对于质粒 DNA的提取也是非常重要的，如果细菌的浓度比较高，那么在溶菌时，溶菌液很难和细菌液充分混合，导致溶菌不彻底的问题，这样会造成质粒的回收率比较低；而如果细菌溶度比较低，溶菌液和菌液均分混合，会造成溶液中含有较多的蛋白质、染色体以及菌体碎片，在这样的情况下，沉淀时质粒回合这些物质共沉，进而导致质粒的回收率也会比较低。
在生物学的相关研究之中，细菌质粒DNA的提取是比较常规的技术和操作，主要的方法有碱裂解法、煮沸法以及SDS裂解法等，下面对碱裂解法进行介绍。
碱裂解法碱裂解法是当前应用比较广泛的质粒 DNA提取方法，这种方法的优点在于提取的质粒DNA纯度高，操作便捷，缺点是需要较长的提纯时间。
研究人员在缩短这一方法的提纯时间方面做了大量的研究，但是没有得到理想的效果，当前这一方法提取 DNA 的时间都在1.5h 以上。
碱裂解法提取质粒DNA的基本原理:首选，在菌液中加入溶液Ⅰ，细菌细胞悬浮，同时其中的EDTA会和Ca2+以及Mg2+鳌合，起到抑制DNase活性的作用；然后，加入溶液Ⅱ，将细胞裂解，在这个过程中蛋白质和少量质粒将会变质；再次，加入溶液Ⅲ，使多数蛋白质以及染色体DNA被沉淀，并使得质粒DNA复性。
质粒提取的原理
质粒提取的原理
质粒提取是通过破碎细菌细胞膜和细胞壁，将质粒分离出来的一种方法。
其原理主要包括以下几个步骤：
1. 培养大量含有目标质粒的细菌：首先，在适当的培养基中培养含有目标质粒的细菌。
这些细菌在培养过程中大量繁殖，产生足够数量的质粒。
2. 细菌破裂：将培养好的细菌经过离心，使得细菌沉淀成为细菌沉淀物。
然后，可以使用机械方法（如超声波破碎）或化学方法（如使用洗涤剂）破裂细菌细胞膜和细胞壁，释放出细胞内的质粒。
3. 分离质粒：通过离心将破碎的细菌碎片从质粒和其他细胞组分中分离出来。
由于质粒通常较小，可以利用离心的不同速度和时间来分离不同大小的颗粒。
质粒会在相对较高的离心速度下沉积形成沉淀，而其他的细胞残渣等则留在上清液中。
4. 纯化质粒：沉淀中含有质粒和其他杂质，需要进行纯化。
可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或使用商用质粒提取试剂盒来进一步纯化质粒。
这些方法可以根据质粒的大小、线性或环状、DNA含量等特性进行分离和纯化。
通过以上步骤，可以获得相对纯净的质粒，用于进一步的实验操作，如基因克隆、转化等。
10质粒提取生物化学与分子生物学实验
1:10000添加荧光染料
四、操作步骤
6、琼脂糖凝胶电泳 （2）上样、电泳和观察
10 μl 质粒溶液与 1.5 μl上样缓冲液混匀
上样完成后 电压100 V 电泳
将凝 胶放 置于 电泳 槽中
溴酚蓝距凝胶边缘2cm停止电泳，于254nm紫外光观察
注意事项
1、转化操作过程中，感受态细胞需要在冰上融化，加入质粒后轻 轻混匀；
目录
01 实验原理
03 实验步骤
02 所用试剂和器材 04 注意事项
一、实验原理
质粒简介： ➢闭合双链DNA； ➢存在于细菌的细胞质中、独立于 染色体之外可主复制的遗传成份。
一、实验原理
质粒对细菌具有重要意义
一、实验原理
碱裂解法小提质粒简介
➢ 菌体在NaOH和SDS溶液中裂解， 蛋白质与DNA发生变性；
➢ 加入中和液后，质粒DNA分子能够 迅速复性，且呈溶解状态，离心后 位于上清液中；蛋白质与染色体 DNA不复性而呈絮状，离心后沉淀；
➢ 将质粒纯化。
一、实验原理
质粒的检测方法： 琼脂糖凝胶电泳简介
琼脂糖凝胶--均匀介质，胶的浓度不 同导致其孔径不同，达到不同的分 离效果；
DNA--带负电，电泳的快慢与分子 大小和形状有关；
取10µL质粒加入到 100µL感受态菌体中，
冰浴30min
42℃，90 S
冰浴，2.5 min
加800 µL LB培养基
37℃恒温培养
涂布
6000 rpm X5 min 摇床，50 min
四、操作步骤
2、挑菌
挑取单菌落放到含相应 抗生素的LB培养基中
37℃剧烈振摇培养12小时左右
四、操作步骤
3 、细菌的收集
质粒DNA的提取及浓度判定
• 浓缩漂洗液配置成工作浓度时，一定要使用无 水乙醇，否则，吸附于硅基质材料上的DNA可能 被洗脱下来，影响回收效率。 6. A.重复步骤5一次；B.随后，再次于12000rpm空 管离心2分钟，尽量除去漂洗液。 • 洗涕时（即步骤5和6）一定要尽量除去漂洗液， 否则，漂洗液中得乙醇会抑制后续得各种酶促 反应。必要时，可适当延长离心时间或者用Tip 头吸净。
质粒DNA的提取及浓度检测
1. 目的与要求 通过质粒的一些特性、质粒 DNA的提取、测定，学习用 碱变性法提取质粒DNA的方 法，了解用分光光度计测定 DNA含量的方法。
2. 相关知识及原理
质粒(Plasmid) ：
独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传 的遗传因子。是一种环状的双链DNA分子。 存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物 细胞中，在细菌细胞中最多。
•Copy number: ~500
EcoR1 1.9kb
Insert
Xho1
pCMV-Myc-T10
4. 步骤
A.质粒DNA的提取
碱裂解法
溶液1－GET缓冲液： 50mmol/L葡萄糖， 10mmol/L EDTA， 25mMTris-HCl pH8.0。 溶液2－0.2mol/L NaOH, 1%SDS 溶液3－乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)： 60mL的5mol/L KAc, 11.5ml冰醋酸， 28.5mL H2O TE缓冲液或水（+ 20mg/ml RNase ）: 10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA ， pH8.0, 100%乙醇，70％乙醇
2. 取 液 体 培 养 液 1.5-3ml 于 Eppendorf 管 中 ，
10000r/min 离 心 1min ， 去 掉 上 清 液 ， 加 入
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碱裂解法抽提质粒原理溶液I，50 mM葡萄糖/25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；（溶菌酶：使细胞壁裂解；RNase：将裂解完的RNA去除，防止RNA污染）溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3M醋酸钾/ 2 M醋酸。
溶液I的作用：①任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液。
②50mM葡萄糖：加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。
所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。
③EDTA：EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性和抑制微生物生长。
在溶液I中加入高达10 mM的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。
如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。
如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。
有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。
溶液II：这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。
要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。
其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。
事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。
用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌，自然就难高效率抽提得到质粒。
如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。
很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。
有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。
这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。
基因组DNA的断裂会带来麻烦，后面我再详细说明。
溶液III溶液III加入后就会有大量的沉淀，最容易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。
如果你这样怀疑，往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。
大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。
如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。
既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。
因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。
但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。
这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate,PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。
如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的纳离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。
SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。
这个过程不难想象，因为基因组DNA 太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。
那么2M的醋酸又是为什么而加的呢？是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。
基因组DNA一旦发生断裂，只要是50－100 kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了。
所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。
很多人误认为是溶液III加入后基因组DNA无法快速复性就被沉淀了，这是天大的误会，因为变性的也好复性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。
NaOH本来是为了溶解细胞而用的，DNA分子的变性其实是个副产物，与它是不是沉淀下来其实没有关系。
溶III加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了PDS沉淀更充分一点。
不要以为PDS沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了，其实还有很多蛋白质不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提，然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA，不然时间一长就会因为混入的DNase而发生降解。
这里用25/24/1的酚/氯仿/异戊醇是有很多道理的，这里做个全面的介绍。
酚对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如4M的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），应此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。
至于异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。
回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入2倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀出来。
这时候如果放到-20℃，时间一长反而会导致大量盐的沉淀，这点不同于普通的DNA酒精沉淀回收，所以不要过分小心了。
高浓度的盐会水合大量的水分子，因DNA分子之间就容易形成氢键而发生沉淀。
如果沉淀，就用70％的乙醇多洗几次，每次在室温放置一个小时以上，并用tip将沉淀打碎，就能得到好的样品。
得到的质粒样品一般用含RNase（50ug/ml）的TE缓冲液进行溶解，不然大量未降解的RNA会干扰电泳结果的。
琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，多数情况下你能看到三条带，但千万不要认为你看到的是超螺旋、线性和开环这三条带。
碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA，不信的话你用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样。
其实这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。
如果你不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。
质粒小提质粒小提（这里试剂盒没有柱平衡步骤）：1、大离心管4000rpm离心5min，吸除上清；2、每5ml菌液加入250μl P1（4℃），彻底悬浮，移到1.5ml EP离心管中；3、加入250μl P2，上下颠倒6-8次，温和，＜5min；4、加入350μl P3，上下颠倒6-8次，温和；12000rpm离心10min；5、取上清，加到柱子里，12000rpm离心2min，弃废液；6、加入去蛋白液HB 500μl，12000rpm离心1min，弃废液；7、加入75%乙醇700μl，12000rpm离心1min，弃废液；8、重复上一步；9、空离一次，12000rpm离心2min，弃收集管；10、晾干；11、加ddH2O溶解，放2min，12000rpm离心2min。
12、测浓度质粒小提试剂盒（离心柱型）：天跟本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞，再通过离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA。
1、柱平衡：向吸附柱CP3（吸附柱放入收集管中）加入500μl的平衡液BL，12000rpm 离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；2、取1-5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12000rpm离心1min，尽量吸除上清；注意：如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
3、向离心管中加入250μl溶液P1（先检查是否加入RNase A），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀；4、向离心管中加入250μl溶液P2（使用后立即盖上瓶盖，以免空气中的CO2中和P2中的NaOH反应，降低溶菌效率），温和地上下翻转6-8次，使菌液充分裂解；注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片段。
此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒收到破坏，如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
5、加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转6~8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀，12000rpm离心10min；注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。
如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
6、吸取上一步上清液转移至吸附柱CP3中（吸附柱放入离心管中），尽量不要吸出沉淀，12000rpm离心1min，倒掉收集管中废液，将吸附柱放入收集管中；7、可选步骤：向吸附柱CP3中加入500μl去蛋白液PD，12000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。
如果宿主菌是end A+宿主菌（TG1，BL21，HB101，JM系列，ET12567等），这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，推荐采用此步。
如果宿主菌是end A-宿主菌（DH5α，TOP10等），此步可省略。
8、向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW（先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm 离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中；9、重复操作步骤8；10、将吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm离心两分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。
为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
11、将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm离心2min将质粒溶液收集到离心管中。