土壤酶的测定方法
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参考关松萌等编制的土壤酶及其研究法
一、土壤蔗糖酶
3，5- 二硝基水杨酸比色法：
1、试剂的配制
①3，5- 二硝基水杨酸溶液：称0.5g二硝基水杨酸，溶
于20ml2N氢氧化钠和50ml水中，加30g的酒石酸钾钠，用水稀释至100ml.（不超过七天）
②pH5.5磷酸缓冲溶液：1/15M磷酸氢二钠
（11.867gNa2HPO4.2H2O溶于1L蒸馏水中）0.5ml加1/15M磷酸二氢钾（9.078g KH2PO4溶于1L蒸馏水中）9.5ml即成。
③8%蔗糖溶液。
④甲苯。
⑤标准葡萄糖溶液：将葡萄糖先在50—58℃条件下，真
空干燥至恒重。然后取500mg溶于100ml苯甲酸溶液中（5ml还原糖/ml）,即成标准葡萄糖溶液。再用标准溶液制成1ml含0.01—0.05mg葡萄糖工作溶液。
标准曲线绘制：取1ml不同浓度的工作液，并按与测定蔗糖酶活性同样的方法进行显色，比色后以光密度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制成标准曲线。
2、操作步骤称5g风干土，置于50ml的三角瓶中，注入
15ml8%蔗糖溶液，5ml pH5.5磷酸缓冲溶液和5滴甲苯。摇匀混
合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。到时取出，迅速过滤。
从中吸取滤液1ml，注入50ml容量瓶中，加3ml3，5- 二硝基水杨酸溶液,并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。
溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至50ml，并在分光光度计上于波长508nm处进行比色。
为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个实验需做无土对照。
无土对照：不加土样，其他操作与样品实验相同。
无基质对照：以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。
3、结果计算蔗糖酶活性以24小时后1g土壤葡萄糖的毫
克数表示。
葡萄糖（毫克）=a×4
式中：a——从标准曲线查得的葡萄糖毫克数
4——换算成1g土的系数
二、土壤淀粉酶
3，5- 二硝基水杨酸比色法:
1、试剂配制
①1%淀粉。
②甲苯。
③pH5.6磷酸盐缓冲溶液：1/15M磷酸氢二钠（11.867gNa2HPO4.2H2O溶于1L蒸馏水中）0.5ml加1/15M磷酸二氢钾（9.078g KH2PO4溶于1L蒸馏水中）9.5ml即成。
④3，5- 二硝基水杨酸溶液：称0.5g二硝基水杨酸，溶于20ml2N氢氧化钠和50ml水中，加30g的酒石酸钾钠，用水稀释至100ml.（不超过七天）
⑤麦芽糖（C12H22O11.H2O）标准溶液：配制每毫升含0.02—2mg麦芽糖液为标准液。
标准曲线绘制：分别取不同浓度麦芽糖标准液1ml，移于50ml 容量瓶中，加2ml 3，5- 二硝基水杨酸溶液,并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却。定容后在分光光度计上于波长508nm处进行比色。
2、操作步骤称5g风干土，置于50ml的三角瓶中，注入10ml 1%淀粉溶液，再加10ml pH5.6磷酸盐缓冲溶液和5滴甲苯。摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。
培养结束后，将悬液迅速过滤。从中吸取滤液1ml，注入50ml 容量瓶中，然后按绘制标准曲线的显色方法进行比色测定。
为了消除土壤中原有的蔗糖、麦芽糖引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个实验需做无土对照。
无土对照：不加土样，其他操作与样品实验相同。
无基质对照：以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。
3、结果计算蔗糖酶活性以24小时后1g土壤葡萄糖的毫
克数表示。
葡萄糖（毫克）=a×4
式中：a——从标准曲线查得的葡萄糖毫克数
4——换算成1g土的系数
三、土壤脲酶
靛酚比色法:
1、试剂配制：
①甲苯。
②10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。
③柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184g柠檬酸和147.5g氢氧化
钾分别溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释至1000ml。
④苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加
2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水中（B液）。将AB溶液保存在冰箱中。使用前将A、B溶液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。
⑤次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，
溶液稳定。
⑥氮的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至
1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的标准液。
标准曲线绘制：吸取配置好的氮溶液10ml，定容至100ml，即稀释了10倍，吸取1，3，5，7，9，11，13ml移至50ml容量瓶，加水至20ml，再加入4ml苯酚钠，仔细混合，加入3ml次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟,用水稀释至刻度。将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。
2、操作步骤
①称取5g过1mm筛的风干土样于100ml容量瓶中。
②向容量瓶中加入1ml甲苯（以能全部使土样湿润为度）并
放置15分钟
③之后加入10ml 10％尿素溶液和20ml柠檬酸缓冲液
（PH6.7），并仔细混合。
④将容量瓶放入37摄氏度恒温箱中，培养24h。
⑤培养结束后，用热至38摄氏度水稀释至刻度，仔细摇荡，
并将悬液用致密滤纸过滤于三角瓶中。
⑥显色：吸取3ml滤液于50ml容量瓶中，加入10ml蒸馏水，
充分震荡，然后加入4ml苯酚钠，仔细混合，再加入3ml次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟，用水稀释至刻度，溶液呈现（青定）酚的蓝色。