病原菌的分离培养和纯化

普通植物病理学

实验十七、病原菌得分离培养与纯化

一、目得要求

(1)了解分离与纯化微生物得基本原理及方法。

(2)掌握倒平板得方法与组织分离、稀释分离、平板划线分离得基本操作技术。

(3)掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状得方法。

二、基本原理植物病原菌得分离培养,就是植物病理实验室工作中得基本技能。为了获得某微生物得纯培养，一般就是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜得生活条件，即让病原菌生活在适宜得培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其她菌生长得环境.从而得到纯菌株。植物病原頁•菌得分离方法主要有组织分离法与稀释分离法两种。最常用得方法就是组织分离法，而稀释分离法主要用于病组织上产生大量砲子得病原真菌得分离。病原细菌得分离方法以划线分离法为最常用，在有些情况下也采用稀释分离法。为了获得分离菌得纯培养，必须要进行分离菌得纯化，纯化得方法类似于分离工作中采用得稀释分离法或划线分离法。

三、材料、仪器与用具

1•材料(依当地情况进行选择，下列材料供参考)

(1)稻瘟病叶、病节、病穗颈(pyric u 1 a r ia orycae)。

(2)玉米大斑病叶(exserohilum t urcicum)0

⑶玉米弯抱菌叶斑病叶(c u r v u lar i a 1 u n ata)。

(4 )玉米小斑病叶(bipo 1 aris may dis)。

(5)番茄灰霉病果(botryt i s cinefc a )。

(6 )黄瓜菌核病果(sclerotinia s c I erotio r um)«

(7)黄瓜细菌性角斑病叶(pscu d omo n as syringa e p v .lac h r y mans)。

(8)水稻白叶枯病叶(xant h o mo n as canipc s tmspv、o r y eue)o

（10）白菜软腐病叶（e r u dnia c a r otovo ra su b sp.c a rotovora）«

2 .培养基pda培养基;肉膏蛋白陈培养基;加寄主组织煎汁得培养基等。

3.仪器与用品超镜工作台、培养箱、培养皿、吸管、吸水纸、三角玻璃棒、剪刀、解剖刀、银子、

接种铲（针）、接种环（银）、70%洒精、0.1 %升汞、洒精灯、火柴、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉、铝锅等。0」％升汞溶液配制:升汞1 e浓盐酸2. 5 ml蒸馆水1000m 1 o 先将升汞溶于盐酸中，待充分溶解后，再加水稀释。升汞就是剧毒药物，在操作时应特别小心。

四、实验操作

（一）病原真菌得分离

1•组织分禽法按照以下步骤进行：

（1）取火菌培养皿一个,宜于湿纱布上，在皿盖上用玻璃铅笔注明分离日期、材料与分离人得姓名。提示:为了保证无菌操作，应注意下而几点：工作前最好将所需得物品都放在超净工作台内，工作中临时去取容易带来杂菌;保证工作人员自身得洁净,工作前用肥皂洗手；无菌操作前还要用7 0%酒精擦拭双手;工作中，特別在使用无菌操作间时，呼吸要轻，不要说话。

⑵用无菌操作法向培养皿中加入25%乳酸1-2滴（可减少细菌污染），然后将融化而冷至6 0 c左右得pda培养基倒人培养皿中，每皿倒10—15m 1，轻轻摇动使之成平面。凝固后即成平板培养基。提示:加入25%乳酸1~2滴,可基本保证平板上不出现污染细菌苗落。除乳酸外，在培养基中加入适当得抗菌素抑制细菌得生长，也就是常用得方法。加青霉素（20 u g/ml）可以抑制g+细菌生长：加多黏霉素

b（5.0 ug/ml）可以抑制g—细菌生长;加链霉素（40 u g/ml）或氯霉素（50ug/ml河以抑制大部分细菌得生长。除了氯篷素可在火菌前加入外, 其她抗菌素都应在火菌后并冷却到45c左右（以手背触三

角瓶感到烫,但尚可以忍耐为宜）’时加入。倒平板过程中只要遵循“稳、轻、快”要领，不必在火

焰上方，一般很少污染。

（3）取真菌叶斑病得新鲜病叶（或其她分离材料），选择典型得单个病斑，用剪刀或解剖刀从病斑边缘（病健交界处）切取小块（海边长3—-4mm）病组织数块。提示:选择新想病得组织作为分离得材料，可以减少腐生菌混入得机会。腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败得部分滋生,因此，一般

斑点病害应在临近健全组织得部分分离。

(4)将病组织放人70%洒精中浸3—5 s后,按无菌操作法将病组织移人0」％升汞液中分别表面消毒0.5、1、2、3、5r a in(也可使用其她表而消毒剂)，如植物组织柔嫩,则表而消毒时间宜短;反之则可长些。然后放入火菌水中连续漂洗三次，除去残留得消毒剂。提示：先用70% 得洒精浸2、3s就是为了消除寄主表面得气泡,减少表而张力,70%得酒精亦用于表而消毒，处理得时间较短(一般数秒至lmin)。升汞溶液消毒得时间因材料而异，可自30s至30min不等, 一般情况下，需时间3, 5mine

(5)用无菌操作法将病组织移至平板培养基上，每皿内放4 - 6块。提示:在将病组织小块移放到平板表面之前，应将其在无菌吸水纸上吸去多余得水,以大大减少病组织附近出现细菌污染。

(6)将培养皿倒巻放人2512左右恒温箱内培养。一般3-4d后观察待分离菌生长结果。

(7)若病组织小块上均长岀较为一致得菌落,则多半为要分离得病原菌。在无菌条件下，用接种针(铲)自菌落边缘挑取小块移入斜面培养基上，在25°C左右恒温箱内培养，数日后,观察菌落生长情况,如无杂菌生长，即得该分离病菌纯菌种，便可置于冰箱中保存。提示:除根据菌落得一致性初步确左长出得菌落就是否目标菌外，还要在显微镜下检査,进一步确左。如果就是对未知病原菌得组织分离，则要将长岀得蕾落分別转出，通过进一步得接种实验明确哪一种为英病原菌。在组织分离工作中，如果植物材料体积较大且较软(如患灰霉病得番茄果实)，在分离过程中可直接挖取内部患病组织移人平板培养基上，完成分离工作。

2.稀释分离法

(1)取火菌培养皿三个，平放在湿纱布上，编号,并注明日期、分离材料及分离人姓统。

(2)用火菌吸管吸取火菌水,在每一皿中分别注入0. 5~1.0ml°

(3)用移植环薛一滴泡子悬浮液，与第一个培养皿中得火菌水混合，再从第一个培养皿移三环到第二个培养皿中，混合后再移三环到第三个培养皿中。

(4)将熔化开冷却到45~50c得培养基，分别倒在三个培养皿中(为防止细菌污染，也可以向每个培养皿中事先加入1-2滴25%乳酸)，摇匀，凝固，要使培养基与稀释得菌液充分混匀。提示:倒平板时得培养基温度一立要掌握好，过热易将病原菌烫死而使分离失败,过冷则倒入培养皿中后难以形成平板，而成为起伏不平得表而,不利于分离。为大体估计培养基温度,可将盛培养基得器皿靠在人手背上，如果手背感到烫但尚可以忍耐，则大体为4 5〜5 Os

（5）将培养皿翻转后置恒温箱（251 3 ）中培养，数日后观察菌落生长情况。（6）挑菌。将培养后长岀较为整齐一致得单个菌落分别挑取,接种到斜而培养基上，置25°C左右培养。待菌长出后，检查菌