感受态细胞的制备及转化

思考题 如阴性对照中长出菌， 如阴性对照中长出菌， 原因？ 原因？ 菌的密度过高或培养时 间过长时会在阳性菌的 周围长出一些小的卫星 菌落，它们是Amp 菌落，它们是Amps的， 分析原因
配下次实验试剂
1、0.5M EDTA 母液 100ml/全班
11、75%乙醇 100 ml/ 全班 12、酚：氯仿=1：1 100 ml/ 全班
受体菌： 受体菌：
E.Coli DH5α：R-,M-,Amps,Tcs
+
质粒DNA
外源质粒
ApaLI (178)
P(BLA) ALPHA
420C热击
XmaI (413) SmaI (415)
ApaLI (2367)
EcoRI (397) AvaI (413)
APr
pUC19
BamHI (418) PstI (440) HindIII (448)
13、组织匀浆液 100ml / 全班 80ml水中加18.61g EDTANa.2H2O，用NaOH调PH8，约需2g， 14、酶解液 30 ml（先不加蛋白酶K,灭 后定容至100ml 菌后再加)/ 全班 2、1M Tris 母液 100ml/ 全班 15、无DNase的RNase，先配50ml 3、LB液 50ml / 全班 分装2ml/试管 4、10%SDS储液 50ml / 全班 5、1M HCL 50ml / 全班 6、5xTBE 1000ml / 全班 7、6x上样buffer 10ml / 全班 分装 8、溶液 I 50ml / 全班 分装 9、溶液III 50ml / 全班 分装 10、RTE 30ml / 全班 分装 10mM Tris-HCl,15mM NaCl(pH7.5) 溶液50ml，取出10ml配10mg/ml RNase，沸水浴15min，冷后分装成 小管，-200C 冰箱保存（全班） 16、3M NaAc pH 30ml，计算好量后加 15ml水溶解，用冰乙酸调pH，定容， 灭菌后分装成小管-200C 冰箱保存（全 班）
0.5ml菌液转移到含 菌液转移到含50ml LB液体培养基的锥形瓶中 液体培养基的锥形瓶中， 2、取 0.5ml菌液转移到含50ml LB液体培养基的锥形瓶中， 370C、250rpm 0.4振荡培养2 小时， 振荡培养2-3小时，至OD600 0.4-0.5 将菌液转移到50ml离心管中，冰上放置10min 50ml离心管中 3、将菌液转移到50ml离心管中，冰上放置10min 4、离心 6000rpm ，40C，10min 5、到出培养液，将管倒置使培养液流尽 到出培养液， 10ml用枪轻吹悬浮细胞 冰上30min 用枪轻吹悬浮细胞， 6、用冰预冷的0.1M的CaCl2 10ml用枪轻吹悬浮细胞，冰上30min 用冰预冷的0.1M的 0.1M 40C，10min， 7、离心 6000rpm ，40C，10min，去上清 2ml用枪轻吹悬浮细胞 用枪轻吹悬浮细胞， 8、用冰预冷的0.1M的CaCl2 2ml用枪轻吹悬浮细胞，冰上操作 用冰预冷的0.1M的 0.1M 9、分装细胞，200μl /份，此为感受态细胞，可-700C冻存 分装细胞，200μ /份 此为感受态细胞，
阴性对照:去除感受态细胞、 阴性对照:去除感受态细胞、试剂中抗 Amp突变菌的污染影响 突变菌的污染影响， Amp突变菌的污染影响，也排除了 铺固体平板时培养基过热造成Amp 铺固体平板时培养基过热造成Amp 失效的因素
影响转化效率的因素 细菌的生长状态(5X10 细菌的生长状态(5X107个 /ml) 试剂的质量 外源DNA的质量与数量 外源DNA的质量与数量 DNA 器皿的洁净度 污染— 污染—尽量所有打开器皿 盖的操作都在超净台中进 行
100ml/全班 2、5M NaOH 100ml/全班 胶塞 LB液体培养基 50ml/组 3、LB液体培养基 50ml/组 胰蛋白胨（ 胰蛋白胨（typtone) 0.5g 酵母提取物（yeast extract) 0.25g 酵母提取物（ NaCl 0.5g 加部分水溶解后加10 10μ 加部分水溶解后加10μl 5M NaOH 定容到50ml 定容到50ml 40ml到250ml锥形瓶 40ml到250ml锥形瓶 2ml到试管，用于预培养 2ml到试管， 到试管 其余到另一试管， 其余到另一试管，用于复苏
17、TE 50ml 灭菌后分装成小管-200C 冰 箱保存（全班）
灭菌试剂物品： 灭菌试剂物品：
1、LB液体培养基 LB液体培养基
溶液I 2、溶液I，溶III 18、酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1 150ml 棕色瓶，酚为pH8.0 Tris饱和酚（全班） 3、RTE 19、氯仿:异戊醇＝24:1 100ml 从18中 取50ml加50ml异戊醇（全班） 20、蛋白酶K 10mg/ml 10ml 配好后用 一次性滤器过滤，分装， -200C 冰箱 保存 4、组织匀浆液 5、酶解液 6、TE 7、3M NaAc 1.5ml，2ml小指管 8、 1.5ml，2ml小指管 9、0.5ml小指管20/2组 0.5ml小指管20/2组 小指管20/2 10、 10、枪头 1盒 200ul 1盒/ 1ml 1盒/2组 1盒/2组 1ml 扩口 10个/组 10个 各50个/2组 50个/2组
P(LAC) ORI
2686 bp
复苏
ApaLI (1121)
Ampr抗性基因编码一种周质 酶（β-内酰胺酶）可特异地 切割Amp的β-内酰胺环，从 而使其失去杀菌能力
Amp+
实验流程
1、预培养：接单菌落到2ml LB液体培养基中，370C、190rpm振荡培养过夜 预培养：接单菌落到2ml LB液体培养基中 液体培养基中， 190rpm振荡培养过夜
转化
1、取 200μl感受态细胞，加入DNA(PUC19)2 μl（50ng) 200μ 感受态细胞，加入DNA(PUC19)2
取 200μl感受态细胞，加入2μl无菌水（对照 ） 200μ 感受态细胞，加入2 对照1） 取 200 µl 0.1M的CaCl2 10ml，加入DNA(PUC19)2 μl（50ng) 0.1M的 10ml，加入DNA(PUC19)2 （对照2） 对照2 用枪头混匀，冰上放置30min 用枪头混匀，冰上放置30min 循环水浴热击90S 2、420C循环水浴热击90S 3、冰浴2分钟 冰浴2 液体培养基， 慢摇1 4、每管加800 μlLB液体培养基，370C慢摇1小时 每管加800 lLB液体培养基 已转化的感受态细胞，涂在含Amp Amp的培养皿中 5、100 μl已转化的感受态细胞，涂在含Amp的培养皿中 6、倒置培养过夜（ 370C） 倒置培养过夜（
加部分水溶解后加20µl 5M NaOH 加部分水溶解后加 定容到100ml 定容到 灭菌后冷至50 左右 左右， 灭菌后冷至 0C左右，在超净台中加 200 µl Amp(终浓度 终浓度100µg/ml) 终浓度
灭 菌
1、LB液体培养基 、 液体培养基 2、LB液体培养基 、 液体培养基 3、50ml离心管 1个/组 、 离心管 个 组 4、枪头/2组 、枪头 组 5ml 10支 支 1ml 1盒 盒 200ul 1盒 盒 5、培养皿 3套/组 、 套组 6、1.5ml，2ml小管 、 ， 小管 各50个/2组 个 组
分子生物学实验
感ห้องสมุดไป่ตู้态细胞的制备及转化
北京师范大学生命科学学院 生物化学及分子生物系
准备实验一： 准备实验一：感受态的制备与转化
配试剂： 配试剂：
1、0.1M的CaCl2 100ml/2组 、0.1M的 100ml/2组
4、Amp ：50mg/ml 20ml 1ml/管分装 全 、 管分装/全 管分装 班 注意：先将所需烧杯、玻棒、双蒸水、 注意：先将所需烧杯、玻棒、双蒸水、 小指管灭菌后， 小指管灭菌后，在超净台中配制后用一 次性滤器过滤分装后-200C保存 次性滤器过滤分装后 保存 5、LB固体培养基 100ml/组 、 固体培养基 组 胰蛋白胨（ 胰蛋白胨（typtone) NaCl 琼脂粉 1g 1.5g 250ml锥形瓶 锥形瓶 1g 酵母提取物（yeast extract) 0.5g 酵母提取物（
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化 基本原理 感受态（Competence)： 感受态（Competence)：细菌 处于容易吸收外源DNA的状 处于容易吸收外源DNA的状 DNA 态 转化（transformation)： 转化（transformation)：异源 DNA分子导入受体细胞的过 DNA分子导入受体细胞的过 程 致敏过程: 致敏过程:用理化方法诱导细胞 进入感受态的操作 • 细菌处于00C,CaCl2低渗溶液 中,菌细胞膨胀成球形,外援 DNA形成抗DNA酶的羟基-钙 磷酸盐混合物黏附于细胞表面, 经短时间420C热击处理,促进 细胞吸收DNA复合物。将细菌 防在非选择性培养基上保温一 段时间，使抗氨苄青霉素的表 型表达后再转到含氨苄青霉素 的选择性培养基上，长出来的 菌即为转入了外源基因的菌株。 • 转化的确切机制还不清楚
下周实验前一天下午接 菌，预培养
7、无菌水 100 ml 分装/全班 、 分装 全班 8、CaCl2 、
第三周
时 间 8:00-8:30 8:30-9:30 9:30-11:00 11:00-11:30 11:30-12:00 12:00-5:00 实 验 内 容 摇菌2-3小时 超净台中接菌 摇菌 小时 讲 解 配试剂 午 饭 测OD值 值 感受态的制备与转化 第二天早8： 看结果,收灭菌的物品 第二天早 ：00 看结果 收灭菌的物品 下周实验前一天下午接菌， 下周实验前一天下午接菌，预培养