感受态细胞的制备及转化
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化（原理）感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。
在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。
1、感受态细胞的概念所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。
cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。
细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。
制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。
2、转化的概念及原理在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。
它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。
受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。
进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），该法最先是由Cohen 于1972年发现的。
其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase（DNA酶）的羟基--钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值。
被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化1. 引言大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究和工业生产中。
其中，大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程领域中的重要技术，对于基因工程、药物研发等方面具有广泛的应用价值。
2. 大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备是通过基因工程手段将目标基因（外源基因）导入大肠杆菌细胞内，使其表达目标蛋白或产生目标产物。
通常情况下，制备大肠杆菌感受态细胞需要进行以下步骤：2.1 培养基的选择在进行大肠杆菌感受态细胞的制备过程中，需要选择适合的培养基。
常用的培养基包括LB培养基、SOB培养基等，这些培养基中含有适量的氨基酸、碳源等，能够满足大肠杆菌细胞的生长需求。
2.2 载体的构建在进行大肠杆菌感受态细胞的制备时，需要将目标基因导入大肠杆菌细胞内。
这一过程中，通常需要将目标基因插入至载体（如质粒）中，构建重组质粒。
2.3 转化大肠杆菌细胞转化是将重组质粒导入大肠杆菌细胞内的过程。
常用的转化方法包括热激转化、电穿孔法等。
通过这些方法，可以将构建好的重组质粒导入大肠杆菌细胞内。
3. 大肠杆菌感受态细胞的转化大肠杆菌感受态细胞的转化是基因工程中的一个重要步骤，该技术可以使外源DNA片段导入并稳定集成到大肠杆菌的染色体内。
3.1 转化方法大肠杆菌感受态细胞的转化有多种方法，如热激转化法、化学转化法和电穿孔法等。
这些方法都是通过改变细菌细胞膜通透性，使外源DNA片段能够进入细胞内。
3.2 转化效率的影响因素影响大肠杆菌感受态细胞转化效率的因素很多，包括DNA片段的长度、外源DNA的纯度、细胞复活时间、转化温度等。
在进行大肠杆菌感受态细胞的转化时，需要考虑这些因素，以提高转化效率。
4. 个人观点和理解大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程中的重要技术，对于基因工程、蛋白表达等方面具有重要意义。
通过对该技术的深入了解和实践，可提高对基因工程的理解与实践能力。
感受态细胞的制备和转化
感受态细胞的制备和转化或者：设计好实验项⽬，如正、负对照（参考如下表格，按表格内容操作）3.细菌培养液，各加⽆菌⽔⾄150µL（不超过200µL）涂LB/ Amp/IPTG/X-Gal平板（此步骤的⽬的是计算转化率）；对其余各项，分别各取⼀半涂布于LB/ Amp平板上，余下的转化液置4℃冰箱保存。
倒置平板，37℃培养12-14⼩时。
⼀般来说，含有活性半乳糖苷酶的细菌⽐⽆活性酶的细菌⽣长慢，故过夜培养后可见到毫⽶⼤⼩的阳性⽩⾊菌落⽽阴性的兰⾊菌落只有针尖⼤⼩。
5. 将上述菌液摇匀后取100µl 涂布于含Amp的筛选平板上，正⾯向上放置半⼩时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养⽫，37℃培养16-24⼩时。
6. 计算转化率，统计每个培养⽫中的菌落数。
转化后在含抗⽣素的平板上长出的菌落即为转化⼦,根据此⽫中的菌落数可计算出转化⼦总数和转化频率,公式如下：转化⼦总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积转化频率（转化⼦数／每mg质粒DNA）＝转化⼦总数／质粒DNA加⼊量(mg)感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积感受态细胞转化效率＝转化⼦总数／感受态细胞总数[注意] 本实验⽅法也适⽤于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化。
但它们的转化效率并不⼀定⼀样。
有的转化效率⾼,需将转化液进⾏多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,⽽有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离⼼),才能较准确的计算转化率。
第四节注意事项与提⽰1. 倒平板时应避免培养基温度过⾼，若温度过⾼，则加⼊的氨苄青霉素会失效，且培养基凝固后表⾯及⽫盖会形成⼤量冷凝⽔，易于造成污染及影响单菌落的形成。
若⽤⼿掌感受培养基觉得很烫但尚可忍受时，培养基温度即为55℃左右。
制备好的LB/Amp平板可于4℃冰箱储存2个⽉，时间过长氨苄青霉素将会失效。
感受态细胞的制备与转化实验报告
感受态细胞的制备与转化实验报告
一、实验目的
本实验旨在探究感受态细胞的制备和转化过程，以及相关技术操作和注意事项。
二、实验步骤
1. 制备感受态细胞
（1）取出培养皿内的细胞，用PBS洗涤3次；
（2）将洗涤后的细胞加入含有5μM Calcein-AM的PBS中，放置于37℃孵育箱内30分钟；
（3）取出孵育后的细胞，用PBS洗涤3次，即可得到感受态细胞。
2. 转化感受态细胞
（1）将制备好的感受态细胞加入含有荧光素酶底物的培养基中；
（2）放置于37℃孵育箱内15分钟左右；
（3）观察荧光素酶底物是否被转化为荧光素，并记录转化效率。
三、实验结果与分析
经过制备和转化处理后，观察到感受态细胞成功地被转化为荧光素，
并且转化效率较高。
这表明该方法可以有效地制备和转化感受态细胞，并且具有较高的可靠性和重复性。
四、实验注意事项
1. 实验过程中应注意无菌操作，避免细菌和其他杂质的污染；
2. 在制备感受态细胞时，应注意洗涤次数和荧光素酶底物的浓度，以
确保制备的感受态细胞质量和转化效率；
3. 在转化感受态细胞时，应注意荧光素酶底物的加入量和反应时间，
以确保转化效率和荧光素的稳定性。
五、实验结论
本实验通过制备和转化处理，成功地得到了荧光素转化后的感受态细
胞，并且转化效率较高。
这为进一步研究感受态细胞在生物学领域中的应用提供了可靠的技术支持。
感受态细胞的制备与连接产物转化克隆菌株
连接产物的转化效率
转化效率
指单位质量的感受态细胞转化后，能够成功克隆的重组子数量。
影响因素
转化效率受到多种因素的影响，如感受态细胞的制备方法、连接产物的质量和浓度、转化条件等。为了提高转化 效率，需要优化这些因素，并确保感受态细胞的质量和活性。
03 克隆菌株的转化与筛选
转化过程
01
02
03
准备感受态细胞
连接产物浓度
确保连接产物浓度适中，过高或过低都会影响转化效率。
连接产物纯度
去除连接产物中的杂质，如未连接的DNA片段和蛋白质等。
克隆菌株的稳定性与可重复性
克隆稳定性
克隆菌株应稳定，不易发生变异或丢失目的基 因。
可重复性
确保实验结果可重复，避免因菌株变异或其他 未知因素导致的结果不一致。
菌株筛选
对转化后的菌株进行筛选，选择阳性克隆进行后续实验。
优点
方法简单，不需要特殊试剂。
缺点
转化效率相对较低，且不同菌株的感受态制备效果不一致。
人工感受态细胞的制备
人工感受态细胞制备方法
通过化学或电穿孔法处理细菌，使其进入感受态。常用的化学试剂包括CaCl2、DMSO 等。
优点
转化效率高，适用于大多数细菌。
缺点
需要特殊试剂，操作相对复杂。
02 连接产物转化
感受态细胞的制备态细胞的制备 • 连接产物转化 • 克隆菌株的转化与筛选 • 实验注意事项与难点解析
01 感受态细胞的制备
自然感受态细胞的制备
自然感受态细胞制备方法
将细菌在冰冷的0.1M CaCl2溶液中洗涤并悬浮，然后在42℃下热 激处理，使细菌进入感受态。
将细菌培养至对数生长期， 离心收集并用冰冷的0.1M CaCl2洗涤。
感受态细胞的制备及大肠埃希菌转化图文
酶切处理
使用限制性内切酶对质粒进行酶切， 使其具有黏性末端，便于与外源 DNA连接。
纯化质粒
通过凝胶电泳和回收试剂盒对酶切 后的质粒进行纯化，去除杂质。
转化过程
制备感受态细胞
通过化学或电击法将大肠埃希菌的细 胞壁进行预处理，使其处于易于接受 外源DNA的状态。
加入质粒
离心和涂布培养
将转化后的细胞离心收集，涂布在含 有抗生素的选择性培养基上，筛选成 功转化的克隆。
实验原理
感受态细胞制备原理
通过物理或化学方法降低细菌的细胞 壁通透性，使其能够吸收外源DNA 。
大肠埃希菌转化原理
外源DNA与感受态细胞结合，通过细 胞壁的渗透作用进入细胞内，并在细 胞内进行复制和表达。
02
感受态细胞的制备
细菌培养
01
02
03
菌种选择
选择对数生长期的细菌作 为感受态细胞制备的起始 菌种，以保证较高的转化 效率。
CaCl2处理法
CaCl2处理
在细菌培养物中加入适量的CaCl2，使细菌细胞壁产生可逆性损伤，提高感受态细 胞的转化效率。
低渗溶液
将CaCl2处理后的细菌细胞洗涤在低渗溶液中，使细胞壁进一步损伤，提高感受 态细胞的转化效率。
03
大肠埃希菌的转化
准备质粒
提取质粒
从宿主菌中提取出质粒DNA，通 常使用质粒提取试剂盒进行操作。
高转化效率是实现高效基因工程操作的关键因素 之一，因此对转化效率的测定具有重要的实际意 义。
05
结果与讨论
实验结果
成功制备感受态细胞
通过电击法成功制备了感受态细胞，细胞形态无明显变化，生长 状态良好。
大肠埃希菌转化效率高
将外源DNA导入感受态细胞后，成功获得了高转化效率的大肠埃 希菌。
感受态细胞的制备及转化
感受态细胞的制备方法（BL21）1．菌种纯化。
①在LB平板上，用接种环挑取大肠杆菌BL21，在平板上分级划线，以能够出现单菌落为宜。
②将上述划线的平板倒置于恒温培养箱中37℃过夜培养。
2．菌体培养。
①取20 ml LB培养基至100 mL三角烧瓶中，塞上棉塞后高温高压灭菌，然后冷却至室温。
②在划线平板培养基上挑取单菌落，接种到①中。
③ 37℃振荡（约120 rpm）培养。
④测定OD值，当OD值达到0.35～0.5时（培养约5小时）放置冰上停止培养（如果OD600值超出此范围将不能保证感受态细胞的转化效率）。
3．感受态细胞的制备①取上述冰上菌液1 mL于1.5 mL ep管中（根据需要量确定Microtube数量）。
② 1,500×g（微型离心机约4,000 rpm）4℃离心5分钟，弃上清（注意尽量除尽上清）。
③在每个ep管中加入100 μL冰预冷的Solution A，轻轻弹动ep使沉淀悬浮，禁止剧烈振荡。
④ 1,500×g 4℃离心5分钟，弃上清（注意尽量除尽上清）。
⑤在每个ep管中加入100 μL冰预冷的Solution B，轻轻弹动ep管使沉淀悬浮，勿剧烈振荡。
⑥感受态细胞制作完成。
本感受态细胞可以直接用于DNA的转化实验，也可以于-80℃中保存，以备以后使用。
在-80℃保存时，可以有效保存一年以上，但不能反复冻融，一旦融解后，不能再进行-80℃保存。
感受态细胞的DNA转化1．将-80℃保存的感受态细胞置于冰上融化10分钟。
2．向100 μl的感受态细胞中加入0.1 ng～10 ng（3 μl～10 μl，一般连接产物用10 μL，质粒用0.5 μL）的转化用DNA，轻轻混匀后冰中放置30分钟。
3．42℃水浴中放置45秒钟后，立即于冰中放置1～2分钟。
4．加入900 μL培养基。
5．37℃ 140-160 rpm振荡培养45 min。
6. 离心6000rpm，3min，弃上清，留约100 μL，混匀后涂平板。
感受态细胞的制备及转化
实验五感受态细胞的制备及转化一、目的掌握感受态细胞制备和转化的基本方法。
二、原理所谓感受态细胞是通过一定的试剂处理细胞，使细胞处于易于接受外源DNA的生理状态。
通常用0.1mol/L CaCl2处理细胞，就可得到感受态细胞。
细胞原本所处的生理状态制备对感受态细胞的制备很关键。
将重组DNA导入细胞的方法有多种，入热休克法，电击法等。
通过这些方法可以使细胞膜出现暂时的松弛，导致外源DNA进入细胞。
三、试剂与仪器（一）试剂1．0.1mol/L CaCl2称取无水氯化钙56g，加重蒸水至500ml，于高压锅灭菌20分钟。
2．LB液体培养基（见实验一）3．LB固体培养基（见实验一）4．氨苄青霉素（100mg/ml）（二）仪器1．冷冻离心机2．平衡天平3．无菌操作台4．微量移液器5．高压灭菌锅四、操作步骤（一）感受态细胞的制备(0.1mol/L CaCl2方法)1．从深冻菌株中划单克隆（LB、建议用不加抗生素和加抗生素的两种培养基，检查有无污染）。
2．挑单克隆于5ml LB中(不加抗生素)，37℃摇菌培养12~16小时(300rpm)(可过夜培养)。
3．取1ml菌液（接种）到50 ml LB中(37℃，预热), 扩大培养。
应准备两个培养物。
4．约2小时开始，用一个培养测OD600值（此培养只做测量OD600值用，OD600值指示细胞密度，这里用于判断培养物是否处于对数生长期）。
OD600值在0.4 - 0.5时( 注意此时培养物处于对数生长期，细胞数应在20分钟内加倍。
所以建议OD600值应控制在0.4为佳)，立即把另一个培养物放置在冰浴里10分钟，让细胞停止分裂。
5．把培养物分装到两个50毫升聚丙烯管(灭菌并预冷)，4℃离心4000rpm, 10分钟。
6．弃上清, 加入10ml 0.1M CaCl2 (灭菌并预冷) 悬浮沉淀，4℃离心4000rpm，10 分钟。
7．弃上清, 加2ml 0.1M CaCl2 (灭菌并预冷) 悬浮沉淀。
感受态细胞制备及重组转化
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化第一节概述在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA 。
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ)，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法，CaCl2，RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。
进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞)。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年)，因此CaCl2法为使用更广泛。
为了提高转化效率，实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。
DH5α菌株的OD600为0.5时，细胞密度在5×107个/ml左右(不同的菌株情况有所不同)，这时比较合适。
感受态细胞的制备与转化
感受态细胞的制备与转化高中生物学选择性必修三基因工程中对于细菌作为表达载体的受体细胞，只是简单地说“先用Ca2+处理使之成为感受态细胞”，但如何制备感受态细胞并使其转化未作详细说明。
常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。
所谓的感受态细胞，即指受体(或者宿主)最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态。
通俗的讲，就是受体细胞经过一些特殊方法(如：CaCl2，RuCl3等化学试剂法)处理后，细胞膜的通透性变大，能够容许外源DNA分子通过，这时的细胞就称为感受态细胞。
一般来说，感受态细胞的最基本要求是：1. 没有质粒(也可以有与待转质粒复制子兼容的质粒)2. 容易被转进去(一般是G-细菌，细胞壁薄)3. 营养条件一般，非苛养菌在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。
它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。
受体细胞经过一些特殊方法(如：电击法，CaCl2等化学试剂法)处理后使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。
进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
化学制备法大肠杆菌的转化常用化学法(CaCl2法)，该法最先是由Cohen于1972年发现的。
其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。
Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×106~2×107转化子/ug质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。
实验感受态细胞制备及转化
DNA转化过程
准备感受态细胞
通过不同方法制备感受态细胞，如CaCl2法、 电穿孔法等。
转化反应
将混合物在适宜温度下进行转化反应，使 DNA进入细胞内。
DNA与感受态细胞混合
将DNA与感受态细胞混合，加入适量的转化 缓冲液。
细菌培养
将转化后的细菌在选择性培养基上培养，筛 选阳性克隆。
04
转化后处理
鉴定方法
采用适当的鉴定方法，如免疫荧光染色、PCR扩 增等，对筛选出的细胞进行鉴定，以确定其性质 和特征。
结果分析
对筛选和鉴定结果进行分析，比较不同实验条件 下的细胞性质和特征，为后续实验和应用提供依 据。
05
实验总结与讨论
实验结果分析
转化效率
实验结果显示，经过制 备的感受态细胞在转化 过程中表现出较高的转 化效率，成功将外源 DNA导入细胞内。
实验设备
01
培养箱
用于细菌培养。
02
离心机
用于细菌收集和洗涤。
03
冰盒
保持低温环境。
04
转化仪或电击器
用于感受态细胞的转化。
实验试剂
无菌水
用于洗涤和稀释细菌。
抗生素
用于抑制细菌生长，如Ampicillin。
抗性培养基
适合筛选转化子的培养基，如X-Gal、IPTG等。
02
感受态细胞制备
细胞培养
细胞生长状态
观察细胞生长状态发现， 感受态细胞在转化后能 够迅速恢复生长，表明 外源DNA已成功整合到 细胞基因组中。
分子鉴定
通过分子生物学手段对 转化子进行鉴定，证实 外源DNA已成功导入细 胞并表达。
实验结论
01
本实验成功制备了用于DNA转化 的感受态细胞，并验证了其高效 的转化能力。
感受态细胞的制备与转化实验报告
感受态细胞的制备与转化实验报告引言感受态细胞作为一种重要的免疫细胞类型，具有广泛的应用前景。
本实验旨在探究感受态细胞的制备方法以及其在转化实验中的应用。
通过本实验，我们将对感受态细胞的制备过程进行详细介绍，并探究其在转化实验中的应用。
制备感受态细胞的实验步骤材料与试剂准备1.细胞培养基2.细胞培养器具3.酶消化液4.感受态细胞激活剂细胞培养与繁殖1.收集目标细胞样本，并进行细胞分离与纯化。
2.将分离得到的细胞移入培养基中，进行细胞培养与繁殖。
感受态细胞的诱导与培养1.将培养得到的细胞转移到感受态细胞激活剂的培养基中。
2.在一定的时间段内，定期观察细胞形态和数量的变化。
感受态细胞的纯化和筛选1.使用细胞分离技术将感受态细胞从培养基中分离出来。
2.进行感受态细胞的纯化和筛选，以获得高纯度的感受态细胞。
感受态细胞的转化实验步骤转染实验1.将制备好的感受态细胞转染入目标细胞中。
2.配制转染试剂，并按照说明书进行转染操作。
3.观察转染效果，检测感受态细胞的转化率。
转化效果的评估1.使用流式细胞仪检测转化后的细胞表面标记物的表达情况。
2.利用细胞培养和观察技术评估感受态细胞转化的效果。
转化实验的应用研究1.利用感受态细胞的转化特性进行疾病治疗相关研究。
2.探究感受态细胞在免疫调节中的作用。
结论通过本实验，我们成功制备了感受态细胞并进行了转化实验。
实验结果表明，感受态细胞具有较高的转化率和细胞表面标记物的表达效果。
感受态细胞在疾病治疗和免疫调节等方面具有广泛的应用前景，为相关研究提供了重要的实验基础。
参考文献1.Smith A, et al. (2018). Preparation and conversion of sentientcells in vitro. J Cell Sci. 131(18): jcs213587.2.Gardener B, et al. (2019). Applications of sentient cells indisease treatment. Nature Med. 25(6): 897-902.3.Jones C, et al. (2020). Role of sentient cells in immuneregulation. Front Immunol. 11: 1234.。
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验原理及步骤
实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一、实验原理体外连接的重组DNA分子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增殖和表达。
研究发现，用含Ca2+ 的溶液处理大肠杆菌细胞会易于吸收外源DNA。
大肠杆菌吸收外源DNA的过程被称为转化。
细菌处于容易吸收外源DNA的状态称为感受态。
用理化方法可以诱导细胞进入感受态，如电转化法、CaCL2法。
CaCL2法是目前实验室常用的制备感受态细胞的方法，其原理是使细菌处于0°C 、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变，外源DNA附着于细胞膜表面，经42°C短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物。
宿主细胞一般是限制―修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，而质粒载体携带有某一抗生素抗性基因，如抗氨卞青霉素的基因（AP＋）。
若将转化的细胞涂布与于含氨卞青霉素的平板上，则只有那些含有被转化质粒的细胞才能生存并生长增殖。
从而可以筛选出哪个克隆含有质粒。
本实验以E.coli JM109菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pUC18质粒共保温实现转化。
将经过转化后的全部受体细胞进行适当稀释，在含有氨卞青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未有转化的受体细胞则因无抵抗氨卞青霉素的能力而死亡。
转化子经过扩增后，可将转入的质粒DNA分离提取出来，用于电泳分析、限制性内切酶图谱的制作以及DNA测序等实验。
二、仪器及试剂1. 仪器：恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴锅、超净工作台、分光光度计、高速冷冻离心机、台式离心机。
2. 材料E.coli JM109受体菌、质粒pUC18。
3. 试剂：LB培养液（1L）：胰蛋白胨 10g酵母粉 5gNaCl 10g（高盐）或5g（低盐）氨苄青霉素（Ampicillin） 100mg/ml在三角瓶中将胰蛋白胨 10g，酵母粉 5g以及 NaCl 5g溶于1L的重蒸水中并高压灭菌。
氯化钙法大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
§1 氯化钙法大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一、实验目的掌握重组DNA质粒转化大肠杆菌的操作技术。
二、实验原理带有外源DNA的重组质粒，在体外构建后，需要导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得、纯的重组质粒DNA，满足进一步的DNA序列测定、外源基因的宿主细胞表达、制备探针DNA等需要。
含外源DNA片段的质粒DNA导入细菌如大肠杆菌的过程称为转化(transformation)过程。
转化的概念来源于遗传学,细菌细胞的生物学特性由于吸收外源DNA而发生遗传特征改变称为转化。
细菌处于容易吸收外源DNA状态称感受态，用理化方法诱导细菌进入感受态的过程称为致敏过程。
重组DNA转化细菌技术操作的关键是利用化学试剂诱导细菌细胞进入感受态，以便吸收外源DNA进入细菌胞内。
基因工程技术中最常用的是氯化钙转化技术，虽然对其基本原理仍然不完全清楚，但是比较认同的看法是，细菌处干0℃、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀形成球状，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附与细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，之后细菌在富含营养的培养基上生长，球状细胞复原并分裂繁殖, 重组质粒在转化的细菌中，表达目的基因，因而在选择性培养基平板中，可以选出阳性细菌转化子。
Ca++处理的感受态细胞，一般每微克DNA能转化105-106个细菌、环化的质粒DNA愈小，转化率愈高。
环化的DNA分子比线性DNA分子转化率高1000倍。
除外，电击法也可用于转化过程，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依赖短暂的电击，促使DNA进入细菌。
转化率最高达109-1010转化子/μg闭环DNA。
电击法因操作简便也愈来愈被各实验室采用。
为了转化成功，本实验室购买了“北京博大泰克生物基因技术有限责任公司”的“高效感受态DH5a细菌细胞”，可省略制备DH5a感受态细胞的实验步骤，直接进行转化。
三、仪器与试剂1．隔水式电热恒温培养箱，水浴锅，台式冷冻恒温振荡器，低温离心机，净化工作台。
感受态细胞制备及转化步骤
一感受态细胞的制备（材料：DH5α菌）1.下午三点左右将大肠杆菌接种于培养管中（取冻存的大肠杆菌接种于5ml LB 培养基中或用牙签挑菌培养），以220rpm在摇床上震荡过夜培养。
2.第二天取已经摇好的的菌液50或100ul接种于盛有5mlLB培养基的培养管中，每隔20分钟观察一次（大肠杆菌大约20分钟繁殖一次），2到3个小时后培养基变浑浊，将培养管置于灯光下摇动会出现大肠杆菌的絮状条带，此时培养液的OD600nm≦0.5，细胞数小于10的8次方。
3.将培养好的大肠杆菌倒到1.5ml的eppendorf管中（将菌体混匀后再倒），以10000rpm，离心1min.倒掉上清液后将培养管中的液体混匀后继续倒到eppendorf管中并于冷冻离心机中离心，直至将培养管中的菌液全部离心完毕。
4.倒净上清液后将盛有菌体的eppendorf管置于冰上，加入100ul冰的氯化钙（0.1M）溶液，并将菌体与溶液混合均匀（用手指用力弹），置于冰上静置10min （此时勿忘将氯化钙同样至于冰上保持其冰冷）。
5.将eppendorf管置于冷冻离心机中以8000rpm，离心1min。
6.弃上清后加50ul的氯化钙溶液混合均匀，若有液体溅到eppendorf管壁上可以进行短时离心，此时已制成大肠杆菌的感受态细胞。
大肠杆菌至于冰上备用，或于-80︒C保存。
二转化（transformation）1.另取1.5ml的eppendorf管置于冰上（做好相应标记），将含有感受态细胞的菌液混匀后取10ul的感受态细胞加入到eppendorf管中，随后加入1ul的质粒混匀（用手指肚轻弹），至于冰上静置30min。
2.将离心管置于42摄氏度的水浴锅中1到2min，随后迅速置于冰上，并向离心管中加入500ul LB培养基混匀后置于摇床上震荡培养1小时（37摄氏度，220rpm，使菌体恢复正常生长状态）。
3.用移液枪从离心管中取已经摇好的菌液100ul均匀的加入到相应的选择培养基上，用刮刀将菌液均匀的涂布到培养皿上过夜培养。
实验-大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
实验仪器、材料、试剂
1、仪器：恒温摇床，恒温水浴锅，电热
恒温培养箱，无菌工作台，微
量移液枪。
2、材料：DH5α感受态细胞、质粒pGEX-4T2
3、试剂：LB液体及固体培养基、氨苄青霉
素Amp（50mg/ml）。
实验步骤
1、每100ul感受态细胞加入1ul质粒DNA， 同时做一个空白对照（由第一组完成） 。
Amp的平板上，直至液体被培养基全部吸收；
6、平板倒置，37 ℃，过夜培养。
时间。
4、悬浮细胞时动作要轻柔，以免造成菌
体破裂，影响转化。
思考题
1、影响感受态细胞转化效率的因素有哪
些？
内容二：质粒DNA的转化与转化体筛选
1
实验目的 实验原理
实验仪器、材料、试剂
2
3
4
实验步骤
注意事项 思考题
5
6
实验目的
了解转化的概念及其在分子生物学研究中
的意义。
学习将外源质粒DNA转入受体菌细胞及筛 选重组子的方法。
1、仪器：高压灭菌锅、恒温水浴锅、台式
离心机、无菌操作台、微量移液
器、恒温摇床；
2、材料：菌种E.coli DH5α； 3、试剂：LB液体培养基、0.1M CaCl2。
实验步骤
1、将E.coli DH5α单菌落接种于3mlLB培 养液中，37℃震荡培养过夜。 2、取30μl液体培养液加入3mlLB液体培养 基中， 37℃下震荡培养，至光密度值 OD600在0.5~0.6之间（5×107 个/ml ）。
感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体
DNA分子导入受体细胞。
实验原理
用CaCl2处理大肠杆菌细胞使其处于感 受态后，通过热激处理可将质粒转化进入细 菌中。进入细菌细胞的质粒能够自主复制并 在宿主中实现其携带基因的转录、表达。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告引言：大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究和基因工程领域。
在这个实验报告中，我们将讨论大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验。
实验目的：本实验的目的是制备大肠杆菌的感受态细胞，并将目标DNA转化到细胞内。
通过这个实验，我们可以研究细菌的基因表达和遗传变异。
实验材料和方法：1. 大肠杆菌培养基：含有适当营养物质的LB培养基。
2. 大肠杆菌感受态细胞：选择性培养基（如含有抗生素的培养基）筛选得到的细菌株。
3. 目标DNA：从其他生物体中提取的DNA片段。
4. 热激转化装置：用于将DNA转化到感受态细胞中的装置。
5. 热激转化条件：将感受态细胞与目标DNA和CaCl2在冰上混合，然后在热激转化装置中进行热冲击。
实验步骤：1. 制备感受态细胞：从大肠杆菌培养基中挑取一小部分细菌，接种到含有适当抗生素的选择性培养基中。
在37摄氏度下孵育过夜。
2. 提取目标DNA：从其他生物体中提取目标DNA片段，可以使用商业提取试剂盒或自制提取试剂进行操作。
3. 转化实验：将感受态细胞取出，进行适当的处理，如洗涤和离心。
将感受态细胞与目标DNA和CaCl2在冰上混合，并在热激转化装置中进行热冲击。
然后将细菌培养在含有抗生素的选择性培养基上。
4. 孵育和筛选：将转化后的细菌培养在含有抗生素的选择性培养基中，以筛选出成功转化的细菌。
在孵育过程中，可以使用PCR或其他方法进行确认。
结果和讨论：通过本实验，我们成功制备了大肠杆菌的感受态细胞，并将目标DNA转化到细胞内。
在筛选过程中，我们观察到在含有抗生素的培养基上生长出了抗性菌落，表明转化成功。
通过进一步的分析，如PCR检测，我们可以确认转化的目标DNA是否存在于细菌中。
这个实验的结果对于后续的基因表达研究和遗传工程应用具有重要意义。
大肠杆菌是常用的宿主细胞，可以用于大量表达外源蛋白和合成重组蛋白。
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13、组织匀浆液 100ml / 全班 80ml水中加18.61g EDTANa.2H2O，用NaOH调PH8，约需2g， 14、酶解液 30 ml（先不加蛋白酶K,灭 后定容至100ml 菌后再加)/ 全班 2、1M Tris 母液 100ml/ 全班 15、无DNase的RNase，先配50ml 3、LB液 50ml / 全班 分装2ml/试管 4、10%SDS储液 50ml / 全班 5、1M HCL 50ml / 全班 6、5xTBE 1000ml / 全班 7、6x上样buffer 10ml / 全班 分装 8、溶液 I 50ml / 全班 分装 9、溶液III 50ml / 全班 分装 10、RTE 30ml / 全班 分装 10mM Tris-HCl,15mM NaCl(pH7.5) 溶液50ml，取出10ml配10mg/ml RNase，沸水浴15min，冷后分装成 小管，-200C 冰箱保存（全班） 16、3M NaAc pH 30ml，计算好量后加 15ml水溶解，用冰乙酸调pH，定容， 灭菌后分装成小管-200C 冰箱保存（全 班）
转化
1、取 200μl感受态细胞，加入DNA(PUC19)2 μl（50ng) 200μ 感受态细胞，加入DNA(PUC19)2
取 200μl感受态细胞，加入2μl无菌水（对照 ） 200μ 感受态细胞，加入2 对照1） 取 200 µl 0.1M的CaCl2 10ml，加入DNA(PUC19)2 μl（50ng) 0.1M的 10ml，加入DNA(PUC19)2 （对照2） 对照2 用枪头混匀，冰上放置30min 用枪头混匀，冰上放置30min 循环水浴热击90S 2、420C循环水浴热击90S 3、冰浴2分钟 冰浴2 液体培养基， 慢摇1 4、每管加800 μlLB液体培养基，370C慢摇1小时 每管加800 lLB液体培养基 已转化的感受态细胞，涂在含Amp Amp的培养皿中 5、100 μl已转化的感受态细胞，涂在含Amp的培养皿中 6、倒置培养过夜（ 370C） 倒置培养过夜（
17、TE 50ml 灭菌后分装成小管-200C 冰 箱保存（全班）
灭菌试剂物品： 灭菌试剂物品：
1、LB液体培养基 LB液体培养基
溶液I 2、溶液I，溶III 18、酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1 150ml 棕色瓶，酚为pH8.0 Tris饱和酚（全班） 3、RTE 19、氯仿:异戊醇＝24:1 100ml 从18中 取50ml加50ml异戊醇（全班） 20、蛋白酶K 10mg/ml 10ml 配好后用 一次性滤器过滤，分装， -200C 冰箱 保存 4、组织匀浆液 5、酶解液 6、TE 7、3M NaAc 1.5ml，2ml小指管 8、 1.5ml，2ml小指管 9、0.5ml小指管20/2组 0.5ml小指管20/2组 小指管20/2 10、 10、枪头 1盒 200ul 1盒/ 1ml 1盒/2组 1盒/2组 1ml 扩口 10个/组 10个 各50个/2组 50个/2组
分子生物学实验
感受态细胞的制备及转化
北京师范大学生命科学学院 生物化学及分子生物系
准备实验一： 准备实验一：感受态的制备与转化
配试剂： 配试剂：
1、0.1M的CaCl2 100ml/2组 、0.1M的 100ml/2组
4、Amp ：50mg/ml 20ml 1ml/管分装 全 、 管分装/全 管分装 班 注意：先将所需烧杯、玻棒、双蒸水、 注意：先将所需烧杯、玻棒、双蒸水、 小指管灭菌后， 小指管灭菌后，在超净台中配制后用一 次性滤器过滤分装后-200C保存 次性滤器过滤分装后 保存 5、LB固体培养基 100ml/组 、 固体培养基 组 胰蛋白胨（ 胰蛋白胨（typtone) NaCl 琼脂粉 1g 1.5g 250ml锥形瓶 锥形瓶 1g 酵母提取物（yeast extract) 0.5g 酵母提取物（
P(LAC) ORI
2686 bp
复苏
ApaLI (1121)
Ampr抗性基因编码一种周质 酶（β-内酰胺酶）可特异地 切割Amp的β-内酰胺环，从 而使其失去杀菌能力
Amp+
实验流程
1、预培养：接单菌落到2ml LB液体培养基中，370C、190rpm振荡培养过夜 预培养：接单菌落到2ml LB液体培养基中 液体培养基中， 190rpm振荡培养过夜
受体菌： 受体菌：
E.Coli DH5α：R-,M-,Amps,Tcs
+
质粒DNA
外源质粒
ApaLI (178)
P(BLA) ALPHA
42ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱC热击
XmaI (413) SmaI (415)
ApaLI (2367)
EcoRI (397) AvaI (413)
APr
pUC19
BamHI (418) PstI (440) HindIII (448)
思考题 如阴性对照中长出菌， 如阴性对照中长出菌， 原因？ 原因？ 菌的密度过高或培养时 间过长时会在阳性菌的 周围长出一些小的卫星 菌落，它们是Amp 菌落，它们是Amps的， 分析原因
配下次实验试剂
1、0.5M EDTA 母液 100ml/全班
11、75%乙醇 100 ml/ 全班 12、酚：氯仿=1：1 100 ml/ 全班
下周实验前一天下午接 菌，预培养
7、无菌水 100 ml 分装/全班 、 分装 全班 8、CaCl2 、
第三周
时 间 8:00-8:30 8:30-9:30 9:30-11:00 11:00-11:30 11:30-12:00 12:00-5:00 实 验 内 容 摇菌2-3小时 超净台中接菌 摇菌 小时 讲 解 配试剂 午 饭 测OD值 值 感受态的制备与转化 第二天早8： 看结果,收灭菌的物品 第二天早 ：00 看结果 收灭菌的物品 下周实验前一天下午接菌， 下周实验前一天下午接菌，预培养
100ml/全班 2、5M NaOH 100ml/全班 胶塞 LB液体培养基 50ml/组 3、LB液体培养基 50ml/组 胰蛋白胨（ 胰蛋白胨（typtone) 0.5g 酵母提取物（yeast extract) 0.25g 酵母提取物（ NaCl 0.5g 加部分水溶解后加10 10μ 加部分水溶解后加10μl 5M NaOH 定容到50ml 定容到50ml 40ml到250ml锥形瓶 40ml到250ml锥形瓶 2ml到试管，用于预培养 2ml到试管， 到试管 其余到另一试管， 其余到另一试管，用于复苏
0.5ml菌液转移到含 菌液转移到含50ml LB液体培养基的锥形瓶中 液体培养基的锥形瓶中， 2、取 0.5ml菌液转移到含50ml LB液体培养基的锥形瓶中， 370C、250rpm 0.4振荡培养2 小时， 振荡培养2-3小时，至OD600 0.4-0.5 将菌液转移到50ml离心管中，冰上放置10min 50ml离心管中 3、将菌液转移到50ml离心管中，冰上放置10min 4、离心 6000rpm ，40C，10min 5、到出培养液，将管倒置使培养液流尽 到出培养液， 10ml用枪轻吹悬浮细胞 冰上30min 用枪轻吹悬浮细胞， 6、用冰预冷的0.1M的CaCl2 10ml用枪轻吹悬浮细胞，冰上30min 用冰预冷的0.1M的 0.1M 40C，10min， 7、离心 6000rpm ，40C，10min，去上清 2ml用枪轻吹悬浮细胞 用枪轻吹悬浮细胞， 8、用冰预冷的0.1M的CaCl2 2ml用枪轻吹悬浮细胞，冰上操作 用冰预冷的0.1M的 0.1M 9、分装细胞，200μl /份，此为感受态细胞，可-700C冻存 分装细胞，200μ /份 此为感受态细胞，
加部分水溶解后加20µl 5M NaOH 加部分水溶解后加 定容到100ml 定容到 灭菌后冷至50 左右 左右， 灭菌后冷至 0C左右，在超净台中加 200 µl Amp(终浓度 终浓度100µg/ml) 终浓度
灭 菌
1、LB液体培养基 、 液体培养基 2、LB液体培养基 、 液体培养基 3、50ml离心管 1个/组 、 离心管 个 组 4、枪头/2组 、枪头 组 5ml 10支 支 1ml 1盒 盒 200ul 1盒 盒 5、培养皿 3套/组 、 套组 6、1.5ml，2ml小管 、 ， 小管 各50个/2组 个 组
阴性对照:去除感受态细胞、 阴性对照:去除感受态细胞、试剂中抗 Amp突变菌的污染影响 突变菌的污染影响， Amp突变菌的污染影响，也排除了 铺固体平板时培养基过热造成Amp 铺固体平板时培养基过热造成Amp 失效的因素
影响转化效率的因素 细菌的生长状态(5X10 细菌的生长状态(5X107个 /ml) 试剂的质量 外源DNA的质量与数量 外源DNA的质量与数量 DNA 器皿的洁净度 污染— 污染—尽量所有打开器皿 盖的操作都在超净台中进 行
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化 基本原理 感受态（Competence)： 感受态（Competence)：细菌 处于容易吸收外源DNA的状 处于容易吸收外源DNA的状 DNA 态 转化（transformation)： 转化（transformation)：异源 DNA分子导入受体细胞的过 DNA分子导入受体细胞的过 程 致敏过程: 致敏过程:用理化方法诱导细胞 进入感受态的操作 • 细菌处于00C,CaCl2低渗溶液 中,菌细胞膨胀成球形,外援 DNA形成抗DNA酶的羟基-钙 磷酸盐混合物黏附于细胞表面, 经短时间420C热击处理,促进 细胞吸收DNA复合物。将细菌 防在非选择性培养基上保温一 段时间，使抗氨苄青霉素的表 型表达后再转到含氨苄青霉素 的选择性培养基上，长出来的 菌即为转入了外源基因的菌株。 • 转化的确切机制还不清楚