菌种的保藏与复壮PPT课件
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10菌种的衰退复壮和保藏_PPT课件
菌种保藏的具体方法
2.隔绝空气保藏法： 该法保藏的原理主要是通过限制
氧的供应以削弱微生物的代谢作用， 故不适用于厌氧菌。
石蜡油保藏法 橡皮塞密封保藏法 琼脂柱穿刺封口保藏法
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菌种保藏的具体方法
3.干燥保藏法：断绝对微生物的水分供应，能 使微生物的代谢活动强度明显减弱。
最后，衰退还表现在抗不良环境条件 （抗噬菌体、抗低温等）能力的减弱 等。
菌种的衰退是一个由量变到质变的逐 步演变过程，必须及时采取有效措施 进行复壮。
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菌种的复壮
1.纯种的分离： 通过纯种分离可把退化菌种中的一部
分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来， 经过扩大培养就可恢复原菌株的典型性状。 粗放的方式：只能达到“菌落纯”的水平， 即从种的水平来说是纯的。 较精细的方式：单细胞或单孢子分离方法。 它可以达到“细胞纯”即“菌株纯”的水 平。
菌种的保藏
菌种是国家的重要自然资源，菌 种保藏是微生物学的重要基础工作。 菌种保藏的目的是使之不混乱、不死 亡、不污染，并稳定保持原有特性。 农业微生物学国家重点实验室－－
国内唯一的、代表我国农业微生 物科研领域最高水平的实验室。
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菌种保藏的具体方法
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常见活菌制剂成品的 保存条件及适宜储存时间？
成品种类 冻干乳酸菌 冻干红假单胞菌 液态乳酸菌 液态红假单胞菌 复合芽孢杆菌粉 粪肠球菌
保存条件
密封、常温、避光、阴凉 密封、常温、避光、阴凉 密封、常温、避光、阴凉 密封、常温、避光、阴凉 密封、常温、避光、阴凉 密封、常温、避光、阴凉
医学课件第四部分菌种退化复壮与保藏教学课件
国微生物菌种保藏管理委员会 CCCCM
中国普通微生物菌种保藏中心CGMCC(归口中国科学院) 中国科学院微生物研究所(AS) 中国科学院武汉病毒研究所(AS-IV) 中国农业微生物菌种保藏中心ACCC(归口中国农业科学院) 中国农业科学院土壤与肥料研究所(ISF) 中国工业微生物菌种保藏中心CICC(归口轻工业总会) 中国食品发酵工业研究所(IFFI)
1.纯种分离法
平板表面涂布法 菌落纯 （菌种纯） 纯种分离法 平板划线分离法 琼脂培养基浇注法
用“分离小室”进行单细胞分离 细胞纯 （菌株纯）
用显微操纵器进行单细胞分离 用菌丝尖端切割法进行单细胞分离
菌株：又称品系,表示任何由一个独立分离的单细胞(或单个病毒粒子)繁
殖而成的纯种群体及其后代。因此,一种微生物的每一个不同来源的纯培养 物均可称为该菌种的一个菌株。
二. 菌种的复壮 rejuvenation
狭义复壮 在菌种已发生衰退 的情况下，通过纯种分离和 测定典型性状、生产性能等 指标，从已衰退的群体中筛 选出少数尚未退化的个体， 以达到恢复原菌株固有性状 的相应措施；
广义复壮 在菌种的典型特征或 生产性状尚未衰退前，就 经常有意识地采取纯种分 离和生产性状的测定工作， 以期从中选择到自发的正 突变个体。也称生产育种
种，并创造最有利于休眠的环境条件，使微生物处于
代谢不活泼、生长受抑制的休眠状态。
措施 低温：生长温度低限约为-30℃，水溶液中
酶促反应温度低限-140℃ 干燥 缺氧 避光 缺乏营养 添加保护剂：甘油、脱脂牛奶、血清白蛋白 添加酸度中和剂
（三）菌种保藏方法
1.斜面保藏法
中国兽医微生物菌种保藏中心CVCC(归口农 业部) 农业部兽药监察研究所(NCIVBP) 中国林业微生物菌种保藏中心CFCC(归口中 国林业科学院) 中国林业科学院林业研究所(RIF)
中国普通微生物菌种保藏中心CGMCC(归口中国科学院) 中国科学院微生物研究所(AS) 中国科学院武汉病毒研究所(AS-IV) 中国农业微生物菌种保藏中心ACCC(归口中国农业科学院) 中国农业科学院土壤与肥料研究所(ISF) 中国工业微生物菌种保藏中心CICC(归口轻工业总会) 中国食品发酵工业研究所(IFFI)
1.纯种分离法
平板表面涂布法 菌落纯 （菌种纯） 纯种分离法 平板划线分离法 琼脂培养基浇注法
用“分离小室”进行单细胞分离 细胞纯 （菌株纯）
用显微操纵器进行单细胞分离 用菌丝尖端切割法进行单细胞分离
菌株：又称品系,表示任何由一个独立分离的单细胞(或单个病毒粒子)繁
殖而成的纯种群体及其后代。因此,一种微生物的每一个不同来源的纯培养 物均可称为该菌种的一个菌株。
二. 菌种的复壮 rejuvenation
狭义复壮 在菌种已发生衰退 的情况下，通过纯种分离和 测定典型性状、生产性能等 指标，从已衰退的群体中筛 选出少数尚未退化的个体， 以达到恢复原菌株固有性状 的相应措施；
广义复壮 在菌种的典型特征或 生产性状尚未衰退前，就 经常有意识地采取纯种分 离和生产性状的测定工作， 以期从中选择到自发的正 突变个体。也称生产育种
种，并创造最有利于休眠的环境条件，使微生物处于
代谢不活泼、生长受抑制的休眠状态。
措施 低温：生长温度低限约为-30℃，水溶液中
酶促反应温度低限-140℃ 干燥 缺氧 避光 缺乏营养 添加保护剂：甘油、脱脂牛奶、血清白蛋白 添加酸度中和剂
（三）菌种保藏方法
1.斜面保藏法
中国兽医微生物菌种保藏中心CVCC(归口农 业部) 农业部兽药监察研究所(NCIVBP) 中国林业微生物菌种保藏中心CFCC(归口中 国林业科学院) 中国林业科学院林业研究所(RIF)
菌种的提纯与复壮知识(共10张PPT)
〔1〕防止菌种退化的措施
• ①控制菌种传代次数 。菌种退化性的变异，是在繁殖 过程中发生的，因此，减少传代次数可以防止退化。母
种的传代扩接应控制在3次以内，扩接次数愈多，后 代的生活力就愈衰退。原种个栽培种也应尽量减少 传代次数。 • ②优化菌种培养和保藏的环境条件 。菌种退化这有 是基因突变引起的，基因突变与环境条件、代谢产 物有关。一般突变比率随温度降低而减少，因此， 应采用低温(0～4℃)条件保藏菌种。另外，用木屑或
6、改善营养成份：首先改换培养基主料成份，使菌种吸收不同的营养成份，促进复壮。 ⑵对已开始退化菌种的复壮措施
钟后菌球占菌液浓度的X％以上或不分层， 食用菌的复壮可以用豆芽、棉籽皮、甘薯、玉米粉等等代替马铃薯或者采用马铃薯培养基和上述培养基交替使用，复壮效果更好。
原种个栽培种也应尽量减少传代次数。 其次，在实践中往往是几个品种在同一环境下培养，它们之间的自然杂交率也是很高的，品种的自然杂交也会引起菌种的不纯。
菌种的提纯与复壮知识
Байду номын сангаас
• 长期使用某一品种栽培，或对品种保存、管理不当， 会造成该品种的退化和老化，因此对菌种必须进行 经常的提纯复壮工作。
• 菌种的退化和老化有两种不同的含意。退化是指某一 良种遗传性状发生改变，造成产量下降的现象。一个 优良品种在长期栽培过程中，由于环境条件的逆境， 病虫害的侵袭，化学药物的杀伤，管理不当，多次的 转管造成人为的创伤的增多，影响菌种遗传性状的变 异或突变，从而改变了菌种原有的遗传特性，造成退 化现象；其次，在实践中往往是几个品种在同一环境 下培养，它们之间的自然杂交率也是很高的，品种的 自然杂交也会引起菌种的不纯。
• 老化是指菌种菌龄过长，使菌丝体衰老，生活能力下 降，抗病能力减弱，吃料慢，长势弱，出菇少，畸形 多等种种现象。
常见微生物的菌种保藏及原理ppt课件
要使用菌种时,从液氮罐中取出安瓿瓶,并迅速放到35～40℃温 水中,使之冰冻熔化,以无菌操作打开安瓿瓶,移接到保藏前使用 的同一种培养基斜面上进行培养.从液氮罐中取出安瓿瓶时速度 要快,一般不超过1min,以防其他安瓿瓶升温而影响保藏质量.并 且取样时一定要戴专用手套以防止意外爆炸和冻伤
（三）、菌种保藏的方法
1、斜面低温保藏法 2、石蜡油封藏法 3、砂土管保藏法 4、麸皮保藏法 5、冷冻真空干燥保藏法 6、液氮超低温保藏法
1、斜面低温保藏法
将菌种接种在适宜的斜面培养基上,待菌种生长完全后,置于4℃ 左右的冰箱中保藏,每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面 培养基上,生长后继续保藏,如此连续不断.此法广泛适用于细菌、 放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜 用冷冻干燥保藏的菌种.放线菌、霉菌和有芽孢的细菌一般可保 存6个月左右,无芽孢的细菌可保存1个月左右,酵母菌可保存3个 月左右.如以橡皮塞代替棉塞,再用石蜡封口,置于4℃冰箱中保藏, 不仅能防止水分挥发、能隔氧,而且能防止棉塞受潮而污染.这 一改进可使菌种的保藏期延长.
该法的优点是简便易行,容易推广,存活率高,故科研和生产上对 经常使用的菌种大多采用这种保藏方法.其缺点是菌株仍有一定 程度的代谢活动能力,保藏期短,传代次数多,菌种较容易发生变 异和被污染.
2、石蜡油封藏法
此法是在无菌条件下,将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入 培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上,石蜡油层高出 斜面顶端lcm,使用的液体石蜡要求优质无毒, 化学纯规格,其灭菌条件是：150～170℃烘箱内灭菌lh；或121℃ 高压蒸汽灭菌60～80min,再置于80℃的烘箱内烘干除去水分.
（一）、菌种保藏的目的
微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚 至死亡,因而常常造成菌种的衰退,并有可能使优良菌 种丢失.菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原 有性状和活力的稳定,确保菌种不死亡、不变异、不 被污染,以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需 要.
（三）、菌种保藏的方法
1、斜面低温保藏法 2、石蜡油封藏法 3、砂土管保藏法 4、麸皮保藏法 5、冷冻真空干燥保藏法 6、液氮超低温保藏法
1、斜面低温保藏法
将菌种接种在适宜的斜面培养基上,待菌种生长完全后,置于4℃ 左右的冰箱中保藏,每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面 培养基上,生长后继续保藏,如此连续不断.此法广泛适用于细菌、 放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜 用冷冻干燥保藏的菌种.放线菌、霉菌和有芽孢的细菌一般可保 存6个月左右,无芽孢的细菌可保存1个月左右,酵母菌可保存3个 月左右.如以橡皮塞代替棉塞,再用石蜡封口,置于4℃冰箱中保藏, 不仅能防止水分挥发、能隔氧,而且能防止棉塞受潮而污染.这 一改进可使菌种的保藏期延长.
该法的优点是简便易行,容易推广,存活率高,故科研和生产上对 经常使用的菌种大多采用这种保藏方法.其缺点是菌株仍有一定 程度的代谢活动能力,保藏期短,传代次数多,菌种较容易发生变 异和被污染.
2、石蜡油封藏法
此法是在无菌条件下,将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入 培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上,石蜡油层高出 斜面顶端lcm,使用的液体石蜡要求优质无毒, 化学纯规格,其灭菌条件是：150～170℃烘箱内灭菌lh；或121℃ 高压蒸汽灭菌60～80min,再置于80℃的烘箱内烘干除去水分.
（一）、菌种保藏的目的
微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚 至死亡,因而常常造成菌种的衰退,并有可能使优良菌 种丢失.菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原 有性状和活力的稳定,确保菌种不死亡、不变异、不 被污染,以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需 要.
新版微生物菌种退化与其复壮保藏-精选.ppt
质粒脱落导致菌种退化：
控制产量的质粒脱落或核内DNA和质粒复制不一 致。
连续传代加速退化的发生：
传代
个别低产突变株
13
大量低 产突变株
https:///ht ml/2018/1019/524010223200
不良的培养条件：如营养成分、温度湿度、pH 值、通气量等和保藏条件如营养、含水量、温 度、氧气等不仅会诱发低产基因型出现，而且 会造成低产基因和高产基因细胞的数量比发生 变化。
退 化 的 表 现
10
产物合成能力下降 产量下降 发酵力或糖化力降低
孢子数量变化
菌落大小变化
生长能力和生长速度变化
https:///ht ml/2018/1019/524010223200
1.菌种退化的原因
基因突变
连续移代
退化原因
质粒的脱落
11
培养和保藏 条件的影响
微生物菌种及其复壮与保藏
1
工业生产常用的微生物及 要求
2 菌种的退化与复壮
3 菌种的保藏
3
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ml/2018/1019/524010223200
工业生产常用的微生物及要求
工
1. 细菌: 分布最广，数量最多，单细胞原核，业
二分裂殖….
生
枯草芽孢杆菌---- 淀粉酶、蛋白酶 产
嗜热乳杆菌----乳酸
醋酸杆菌----醋酸
常 用 的
棒状杆菌----氨基酸
微
短杆菌----肌苷酸
生
物
4
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ml/2018/1019/524010223200
第六章 菌种复壮衰退及保藏(与“菌种”相关文档)共44张PPT
例如，构巢曲霉如用分生孢子接种易退化； 如用子囊孢子接种则不易退化。
（5）采用有效的菌种保藏方法
菌种保藏的温度、所用的培养基等可影响自发突变。
（二）菌种的复壮（rejuvenation）
1. 定义
狭义的复壮：
是指菌种已发生衰退后，通过纯种分离和测定典型
性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出 少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状 的相应措施。
（3）淘汰已衰退的个体
S. microflavus“5406”农用抗生菌的分生孢 子，采用－10～－30℃的低温处理5～7天，退 化的个体死亡，留下的10％～20％个体是未退 化的。
二、菌种的保藏
菌种（culture，stock culture）
是一种极其重要和珍贵的生物资源。
菌种保藏（preservation，conservation，maintenance）
纯种分离的方法
粗放
“菌落纯”水平（pure culture in colony lever）
“菌株纯”水平（pure culture in strain lever）
精细
（2）通过宿主体复壮
针对病原菌
衰退的病原菌 接种
活的 “选择性培养基
”
相应的昆虫或动、植物宿主体内
多次选择
从典型的病灶部分分离到恢复原始独立的复壮菌株
（1）定期移植保藏法
操作方法：
将菌种接种在斜面、液体或穿刺培养基上，待生 长完全后，置普通冰箱4℃保藏，湿度50％～70％ 以下，棉塞换成不通气橡皮塞更好。
（国一立） 典国型内菌种收藏馆（NCTC）
抗东生京素 大菌学种应保用藏微管生理物中研心究所（TAM）
创微造生一 物个菌适落合形原态种或的个生体长形条态件的，变就化可；在一定程度上防止菌种衰退 ；
（5）采用有效的菌种保藏方法
菌种保藏的温度、所用的培养基等可影响自发突变。
（二）菌种的复壮（rejuvenation）
1. 定义
狭义的复壮：
是指菌种已发生衰退后，通过纯种分离和测定典型
性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出 少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状 的相应措施。
（3）淘汰已衰退的个体
S. microflavus“5406”农用抗生菌的分生孢 子，采用－10～－30℃的低温处理5～7天，退 化的个体死亡，留下的10％～20％个体是未退 化的。
二、菌种的保藏
菌种（culture，stock culture）
是一种极其重要和珍贵的生物资源。
菌种保藏（preservation，conservation，maintenance）
纯种分离的方法
粗放
“菌落纯”水平（pure culture in colony lever）
“菌株纯”水平（pure culture in strain lever）
精细
（2）通过宿主体复壮
针对病原菌
衰退的病原菌 接种
活的 “选择性培养基
”
相应的昆虫或动、植物宿主体内
多次选择
从典型的病灶部分分离到恢复原始独立的复壮菌株
（1）定期移植保藏法
操作方法：
将菌种接种在斜面、液体或穿刺培养基上，待生 长完全后，置普通冰箱4℃保藏，湿度50％～70％ 以下，棉塞换成不通气橡皮塞更好。
（国一立） 典国型内菌种收藏馆（NCTC）
抗东生京素 大菌学种应保用藏微管生理物中研心究所（TAM）
创微造生一 物个菌适落合形原态种或的个生体长形条态件的，变就化可；在一定程度上防止菌种衰退 ；
菌种的保藏PPT教学课件
▪ 此法适用于产孢子的霉菌和某些放线菌，保藏 期在1年以上。因操作简单、经济实惠，工厂较 多采用。
（五）甘油悬液保藏法
▪ 此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中，置于低温下 保藏，本法较简便，但需置备低温冰箱。保藏温 度若采用－20℃，保藏期约为0.5～1年，而采用 －70℃，保藏期可达10年。
▪ 将拟保藏菌种对数期的培养液直接与经 121℃蒸汽灭菌20min的甘油混合，并使 甘油的终浓度在10％～15％，再分装于 小离心管中，置低温冰箱中保藏。
二、菌种的复壮
狭义的复壮－－消极的措施
是指在菌种已经发生衰退的情况下，通过纯 种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已 衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达 到恢复原菌株固有性状的相应措施。
广义的复壮－－积极的措施
是指在菌种的典型特征或生产性状尚未衰 退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性 状测定工作，以期从中选择到自发的正突变个 体。
一、菌种的衰退
▪ 菌种衰退（degeneration）是指由于 自发突变的结果，而使某物种原有的一系 列生物学性状发生量变或质变的现象。
纯菌种 自发突变 不纯菌种 传代增殖 衰退菌种
突变个体
原始个体
（一）菌种衰退的现象
菌落和细胞形态改变 生长速度缓慢，产孢子越来越少 代谢产物生产能力下降，即出现负突变 致病菌对宿主侵染能力下降 对外界不良条件的抵抗能力下降等
第八章 菌种的保藏
第一节 菌种的衰退和复壮
一、菌种的衰退 二、菌种的复壮
第二节 菌种的保藏
一、菌种保藏的目的 二、菌种保藏的原理 三、菌种保藏的方法
性状稳定的菌种是微生物工作最 重要的基本要求，否则生产或科研 都无法正常进行。
影响微生物菌种稳定性的因素： a）变异；b）污染；c）死亡
（五）甘油悬液保藏法
▪ 此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中，置于低温下 保藏，本法较简便，但需置备低温冰箱。保藏温 度若采用－20℃，保藏期约为0.5～1年，而采用 －70℃，保藏期可达10年。
▪ 将拟保藏菌种对数期的培养液直接与经 121℃蒸汽灭菌20min的甘油混合，并使 甘油的终浓度在10％～15％，再分装于 小离心管中，置低温冰箱中保藏。
二、菌种的复壮
狭义的复壮－－消极的措施
是指在菌种已经发生衰退的情况下，通过纯 种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已 衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达 到恢复原菌株固有性状的相应措施。
广义的复壮－－积极的措施
是指在菌种的典型特征或生产性状尚未衰 退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性 状测定工作，以期从中选择到自发的正突变个 体。
一、菌种的衰退
▪ 菌种衰退（degeneration）是指由于 自发突变的结果，而使某物种原有的一系 列生物学性状发生量变或质变的现象。
纯菌种 自发突变 不纯菌种 传代增殖 衰退菌种
突变个体
原始个体
（一）菌种衰退的现象
菌落和细胞形态改变 生长速度缓慢，产孢子越来越少 代谢产物生产能力下降，即出现负突变 致病菌对宿主侵染能力下降 对外界不良条件的抵抗能力下降等
第八章 菌种的保藏
第一节 菌种的衰退和复壮
一、菌种的衰退 二、菌种的复壮
第二节 菌种的保藏
一、菌种保藏的目的 二、菌种保藏的原理 三、菌种保藏的方法
性状稳定的菌种是微生物工作最 重要的基本要求，否则生产或科研 都无法正常进行。
影响微生物菌种稳定性的因素： a）变异；b）污染；c）死亡
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1.沙土管法
2.滤纸保藏法
• 本法是将要要保藏的微生物细胞或孢子吸
附在灭菌滤纸上，干燥后冷藏。 是3#滤纸剪成5mm×50mm的小条，放入干燥 的培养皿中灭菌。将培养好的菌种用灭菌 脱脂乳或奶粉复原乳制成孢子悬液，用灭 菌镊子将准备好的滤纸条在灭菌操作下浸 入菌悬液中，充分吸附菌细胞，取出后放 入灭菌小试管或安瓿管中，在真空干燥机 上抽干，真空条件下火焰熔封，冷藏。
把菌株的优良性状保存下来，防止退化、 死亡或杂菌污染。保藏的一般程序是选取 优良的纯菌种，最好是用其分生孢子或芽 孢等休眠体，在其休眠和停止生长的条件 下保藏。微生物生长要求适宜的温度、水 分、空气和营养物质等，如将菌种处于低 温、干燥、无氧和缺乏营养的条件下，就 可以使菌种暂时处于休眠状态。
菌种保藏
• 在沙土保藏初期，菌死亡率高，以后逐
渐减慢，存活下来的孢子在以后保存期
间稳定性较好，保藏的有效时间与菌种
存活率的关系见图2-10。
用沙
土管保藏的某些抗生素产生菌保藏期可
达18年(土霉素和链霉素产生菌)到22年
(新霉素产生菌)，但对利福霉素、卡那
霉素、四环素等容易产生变异的菌种，
就不适合作长期的沙土管保存。
• 一、菌种保藏 • 二、菌种的提纯与复壮
一、菌种保藏
• 工业微生物菌种保藏与其他目的
的菌种保藏要求有所不同。工业 微生物菌种保藏，是要使菌种生 产能力和与生产工艺相适应的优 良性状保持稳定，当然做不到绝 对不变，只是力求把这种衰退现 象推迟减缓到最低限度。
菌种保藏
• 菌种保藏有许多的方法，其共同的目标是
一、菌种保藏
现行的菌种保藏方法有下列诸种:
• (一)低温保藏法 • (二)低温定期移植法 • (三)石蜡油低温保藏法 • (四)干燥保藏 • (五)甘油管保藏法 • (六)真空冷冻干燥法 • (七)液氮超低温保存
(一)低温保藏法
• 这是一种常用的简便方法。一般的斜面孢
子、液态孢子、斜面种子以及用麸皮、大 米、小米或碎玉米制成的孢子，可以放在 4℃冰箱内保藏，这种温度条件下不能使 菌体进入休眠，而仅是抑制微生物的生命 活动。因此，保藏时间不宜过长，一般不 超过1～2个月为宜。本方法虽然简便，但 由于菌株处于较高的水平活性下，这对保 藏株的生产性状是不利的，因此，生产菌 种一般不采用此法保藏。
第二章 菌种的保藏与复壮
• 菌种衰退的基本原因是变异，
变异是不可避免的，而减缓变异速 度则是可能的。变异速度与菌种所 处的环境有密切的关系，不良环境 条件能促进变异，频繁或过多传代 也是造成衰退变异的重要原因。为 菌种创造良好条件，减缓菌种衰退， 这就是菌种保藏与复壮工作。
第二章 菌种的保藏与复壮
(二)低温定期移植法
• 把培养好的斜面菌种放在低温干燥处保存，
定期移植，一般3～6个月移植一次(视菌种 特征而定)。也可以用穿刺培养，定期移植 法保藏细菌，其效果也较好。穿刺培养是 将含0.6％～0.8％的琼脂培养基装试管灭 菌后直立冷凝后，用接种针尖挑取少量菌 体，垂直刺入琼脂培养基中心，放在适当 温度下培养，待菌长好后即可放低温保存， 此法较斜面保存有利，大肠杆菌可保藏2年 以上不发生明显变异。
(二)低温定期移植法
• 斜面定期移植与穿刺移植法有其缺陷，
即容易发生遗传变异；连续传代可使一 些生产性状丢失或减弱，也易于污染杂 菌。因此，一些贵重菌株及生产优良菌 株不宜用此法保藏。
(三)石蜡油低温保藏法
• 本方法的原理是在长好的斜面菌上覆盖
灭菌的液体石蜡，达到菌体与空气隔绝， 使菌处于生长和代谢停止状态，同时石 蜡油还防止水分蒸发，在低温下达到较 长期的保藏菌种的目的。保藏温度要求 在-4～4℃下。液体石蜡法适用于不产孢 子的菌种。
其中低温是保藏菌种的重要因素，也是常用 的一种简单易行的方法。在作低温保藏时，注意 尽量不损伤细胞。在缓慢冷冻时，胞外基质一般 较快结冰而形成冰晶使基质浓度增高，造成细胞 水分外渗而大量脱水，可能使细胞死亡。如快速 降温，胞内也很快形成冰晶，胞内外渗透压基本 平衡，同时胞内冰晶较小，对细胞及原生质膜的 损伤也较小，菌株不易死亡，影响也较小。与低 温相关的保藏方法，如冷冻干燥法、超低温保藏 法等，都是利用低温条件下细胞与环境的特殊平 衡原理而设计的。
(四)干燥保藏
• 微生物生长需要水分，干燥法是使菌处于
干燥条件下停止生长及处于休眠状态，达 到较长期保藏的目的。此法用于细菌芽孢 或产分生孢子的菌种，是现在发酵工业生 产中较常用的菌种保藏方法。为了转接方 便，控制接种量以及对菌种的保护作用， 通常将菌种的分生孢子、芽孢，甚至菌丝 体吸附于一些载体表面放至干燥容器里进 行常压干燥或真空干燥，所用载体有沙土、 滤纸、硅胶及大(小)米等。
1.沙土管法
取河(海)沙，过0.78mm(24目)筛，用10％盐酸 浸泡24h，倒去盐酸用清水冲洗至pH呈中性，去水 烘干或晒干。取菜园或果园土粉碎过筛，把烘干 的沙土按3：2或1：1混合装入指形管或高100mm， 直径为10mm的小试管中，高约1cm(约2g)，塞棉塞 121℃灭菌1h，也可用170℃2h干热灭菌(或蒸汽三 次间歇灭菌)，蒸汽灭菌后需烘干。经肉汤检查确 实证明无菌即可使用。将要保存的斜面菌种制成 浓孢子悬液(≥106/ml)，用灭菌滴管或吸管吸取孢 子悬液滴入无菌沙土上，每管约0.3～0.5ml，用 接种环将其混合均匀。
1.沙土管法
• 也可将真菌分生孢子用接种环从斜面直
接挑取放入沙土中。然后将沙土管抽真 空干燥。这时管内砂土松散，表明已干 燥。将干燥的砂土管放置在干燥器或密 闭容器内、干燥器下部放置变色硅胶等 干燥剂，于4℃下保存。从斜面取出的孢 子放入沙土管中混匀后，可以不抽真空 直接放干燥器内保存。
1 具体操作是：菌种为斜面培养菌种，斜
面不宜过长；选择纯净优质石蜡油，置 三角烧瓶中经过121℃高压蒸汽灭菌1～ 2h，将其放烘箱中(160℃左右)干热处理， 去除灭菌时渗入的水分，待石蜡油变得 清澈透明后冷却即可加入斜面，斜面上 不能出现气泡，液蜡添加量以高出斜面 顶部约1cm左右为宜。